专利名称：：重组牛肠激酶、其制备方法及用途的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，更具体地，本发明公开了重组牛肠激酶突变体和重组牛肠激酶融合蛋白、其制备方法和应用。
背景技术：
：肠激酶(Enterokinase,EK或Enteropeptidase,EP，EC3.4.21.9)是存在于哺乳动物十二指肠内的一种异源二聚体(hetei-odimei-ic)丝氨酸蛋白酶。分T质量为150kDa，由1条U5kDa的重链和1条35kDa的轻链组成，在pH值4.5-9.5，温度4-45'C范围内特异性水解蛋白底物。由于EK裂解融合蛋白所释放的目的多肽具有和野生型完全一致的N-末端氨基酸序列，因而可作为蛋白表达体系中融合蛋白的切割试剂。似是天然的肠激酶来源毕竟有限，并且提取分离的成本高，加之天然提取的肠激酶易为其它蛋白酶污染，造成切割融合蛋白的同时又降解了目的产物。而S因工程的方法正可以弥补这些不足，因而运用基因工程的方法牛产肠激酶广为应用。商品化白'」肠漠义酶主要有两种天然提纯的牛肠激酶和基因工程重组牛肠激酶。肠激酶具有以下特点结构特点天然肠激酶由1条结构业基(重链)和1条催化亚基(轻链)构成，两者通过1个分子间二硫键结合，结构亚基负责将催化亚基固定在小肠刷状缘膜上并引导它向肠腔移动，催化亚基可以特异性识别Asp-Asp-A叩-A叩-Lys序列并沼序列的羧基端切下，将胰蛋白酶原活化为胰蛋白酶，从而启动各种酶原活化的级联。重组肠激酶(recombinantEnterokinase，rEK)的分了'质量通常为26.3kDa，具有3个糖基化位点，其糖基化分子质量大约为43kDa。Vozza等发现，rEK体外实验证明有全酶酶切特异性并且相较于天然肠激酶表现出对基闲T.程融合蛋白底物的酶切活性增强，闲而现多采用基闲工程的方法生产肠激酶。近年来所做的尝试多是克隆与表达235个氨基酸的轻链(recombinantEnterokinaselightchain,rE、)。Ja.nska等研究氨基，水端残基发现了EK轻链的二维结构与类胰蛋白酶等的丝氨酸蛋白酶的结构同源性。Seong等则发现将轻链氨基末端的Ile突变为Val其酶活性几乎不发牛改变。另外，有研究发现EK的重链强烈影响肠激酶对大分了底物的识别而对合成的融合蛋白或小分.了-底物的识别没有影响。酶学特点肠激酶在体内激活胰蛋白酶原转化为胰蛋白酶，由于肠激酶的轻链结构在人、牛和猪中保守，其识别序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys在脊椎动物中也有很强的保守性，且几乎所有被定序的胰蛋白酶原都具冇4个天冬酰胺相连的特征，此序列在其它的天然蛋白质上又非常罕见，而肠激酶的活性中心有1个特殊的阳离子位点，使得有强大负电的Asp-Asp-Asp-Asp可以与此阳离子位点结合，因此，牛肠激酶的底物酶切位点序列具有高度的特异性，这种特点使得EK成为基因工程融合蛋白表达后修饰过程中1个极其有用的工具而被广泛应用。对于EK酶切的高度特异性，Ru,h认为是由于酶中钙离了的丧失使得酶A切割，从而具备了激活其它酶的高度特异性。似是在实际的酶切反应中也可能产牛一些非特异性的切割，在基因工程研究中应认真对待。分离纯化特点与人多蛋白的分离纯化方法类似，rEK可通过硫酸铵沉淀、DEAE柱、凝胶层析和透析等方法得到纯品，另外，运用组氨酸(llistidine，His)在蛋白末端进行标记，Nickel金属螯合柱亲和纯化这种低成本高效率一步分离蛋白的方法，也正广泛地运用到rEK的分离纯化，其收率可达50%以上。对于His-tag的位点，Choi等研究发现在rEK'.的C末端进行His标i，用Nickel金属螯合柱亲和纯化后其酶沾性不发牛改变，而在N1端进行His标记后通过Nickel金属螯合杵则酶活性丧失。生理特点1939年Kunitz证实肠激酶是胰蛋白酶原的牛理激活剂，而胰蛋白酶是消化系统其它许多酶原的激活剂，因此肠激,被认为是消化系统重要的起始酶之一。一般认为EK存在于小肠刷状缘细胞膜上，Zaraolodchikova等认为pro-EK是由十二指肠酶激活的。病理研究发现，十二指肠与胰腺的回流液中富集EK会激活过多的胰蛋白酶原从而导致急性胰腺炎，而缺陷的机体将会有腹泻、呕吐、浮肿等症状，造成发育不良，导致血蛋白不足症和贫血。EK的基因工程研究进展在原核生物中的表达在原核细胞表达系统中的基因工程大多是釆用大肠杆菌Escherichiacoli来作为宿主菌。但是对于表达含二硫键的蛋白应该考虑到表达的蛋白二硫键的正确性及蛋白的活性，因而为保证肠激酶二硫键的正确形成，学者们采用融合DsbA、thioredoxin等方法使得表达的肠激酶有活性。LaVallie等采用了融合表达伴侣DsbAproiein在Escheriehiacoli中分泌表达EL将牛EKxDNA序列融合在DsbA序列的3'末端，融合蛋白间通过编码EK的特异性识别位点的序列相连，通过自切割加工就可以得到有活性的rEK.，并且其切割含Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列的融合蛋白的能力要优于天然肠激酶。黄鹤等是通过提取牛组织总RNA,以RT-PCR方法阔增得到牛EKLcDM，将该基因插入pET39b中构建牛EK,融合表达载体pET39b-EK，在EscherichiacoliBL21(DE3)中用IPTG诱导进f丁表达，通过Nickel金属螯合柱-一步分离，得到了有活性的肠激酶。Yuan等是将牛EldcDNA序列融合在融合表达伴侣thioredoxin(Trx)下游，在EscherichiacoliBL21(DE3)表达，在体内S催化切割融合蛋白Trx-EId后，有完整生物活性的rEKk被释放出来，经DEAE等方法纯化，测其比活为720Aus/mg，Km=0.17niM，K(cat)=20.8s/L，100ml摇瓶得到4.3mgt:ld纯品。与之相似，Gasparian等是将人EK,.c廳序列融合在Trx下游，克隆到pET32a上，在EscherichiacoliBL2J(DE3)表达'可溶性的产物无fi切割活性，通过增溶和复性从包涵体中获得了有活性的重组人肠激酶催化亚基(L-HEP)，用纯化的LHEP切割Gly-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp--Lys-beta-卿hthylamide，其KhfO.16Mm，K(cat)-115s/L。在相同条件下，L-HEP消化硫氧还蛋白-人表皮牛长因了-Trx-hEGF(thioredoxinhuman印ide而lgrowthfator)的速度比相同活性单位的牛E1V决5倍。在真核生物中的表达包括在真菌、哺乳动物细胞和酵母中表达，对于在其中真菌中表达Svetina等将插入/KEX-2蛋白酶酶切为点的亇Eld的(:DM融合在葡萄糖淀粉酶(giucoamylasc)基因下游，在黑曲霉(filamentousfungusAspergillusnigerAB1.13)中进行分泌表达'融合蛋白在向细胞周质分泌途中被核酸内切酶KEX--2加工成成熟的EKL，运用离了交换层析和亲和层析分离纯化培养液上清可得到有活性的EKI丄9mg/L，在大豆牛奶培养基的最高产量可达5mg/L(卨于在E.coli中的产量)，虽然低于在甲醇酵母中的表达量，似是在湿菌体中EKL的得率32ug/g却远大于在甲醇酵母中的12ug/g。对于动物细胞表达，1993年，LaVallieER等以哺乳动物丝氨酸蛋白酶PACE的前肽作为分泌引导序列融合到EK,的N末端，将此融合基因PACE-EK,.构建到pMT3表达载体上，然后转染猴肾C0S--1细胞进行分泌表达，获得了有低活性的EKi,，同时研究发现由PACE-EKyKEX2共表达得到的EKL，其切割'力光底物(;ly-Asp--Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-beta-naphthylamide的活性有增强的趋势。对于利用酵母细胞表达，常用于外源蛋白的功能性表达的酵母是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和甲醇酵母(Pichiapastoris)，这两个系统都具有翻译后修饰的功能二硫键的形成、蛋白的糖基化等，这些翻译后加工方式比较类似于哺乳动物细胞。由于酵母不能利用外源基因的信号序列31导外源蛋白的分泌表达，因而Saccharomycescerevisiae和Pichifci.pa.sl.ori.s利用由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号-交配因子(-MF)前导序列来引导外源缶G的分泌表达。与其它蛋白表达系统相比，酵母表达系统的优点在于强有力的A0X1启动了严格调空外源蛋白的表达，对人是安全的，能在常规实验室中应用并且费用低廉。牛EK,有4对分子内二硫键，S-S能否正确形成直接影响EK,是否有活性，因而国内外学者纷纷利用酵母可以进行翻译后加工的特点在酵母系统表达EK,蛋白。在Saccharomycescerevisiae系统表达肠激酶所做的尝试是Choi和Seong等将编码235个氨基酸的牛EKLcDNA克隆至pIL20Gh，构建pIL20EKL分泌表达载体，--MF为启动了，以人的-白介素(interleukin-1)N末端24个氨基酸作为分泌增强了-，并在interleukin-l与EK之间引入了KEX酶切位点，在Saccharomycescerevisiae2805进行分泌表达，产物经Nickel金属螯合分离纯化，得到有活性的EK'(约lmg/L)。Pichiapastoris表达系统自70年代应用于争细胞蛋白牛产以来，经过近20年的发展，已发展成为一个成功表达了200余种外源蛋白的表达系统。pA0804、pA0815和pPIC.3等为其常用的表达载体。Pich"系统的最大特点天然蛋白的分泌水平极低，使得外源蛋白表达后成为培养基中主要成分。因此，利用Pichiapastoris系统表达外源蛋白被广泛应用在基因丄程领域。孙自勇等用RT--PCR扩增EKL的Cdria，构建pPICZaA-EK!表达载体，在宿+:PichapastorisGSl15中分泌表达，发酵液经Zn-S印harose亲和纯化后可得到RKJ.6mg/l,(纯度大于90%),得率高于Choi报道的从1L啤酒酵母培养液中纯化lmgEld的收率，其对小分了荧光底物Gly-Asp-Asp-Asp-Asp-A印-Lys-beta-naphthylamidc的Km-二:7b3丄42mM，K(cat)=31.5土3.8s/L。LFang等将牛EKL整合到pA0815质粒中，用甲醇诱导在宿主PichiapastorisGSl15总分泌表达，经Nickel金属螯合柱分离纯化发酵上清得到有活性的EK力.'1呢/L。V0zza等以-MF为前导序列在甲醇酵母中分泌表达牛El，纯化发酵液上清得到冇活性的EKA.3mg/L，fg白表达量明显高于在E.co丄i和COScells中的表达量。2004年，PengZhong用甲醇酵母表达系统分泌表达EKL，用甘油/甲醇培养基在pH值6.0，rEK,.的产量达350mg/L，经阴离子交换层析后得到EK,.为15mg/L。尽管对重组肠激酶己经进行了大量的研究，对于目前广泛应用的大肠杆菌表达系统获得的肠激酶轻链包涵体产物存在着包涵体产物复性闲难，蛋白活性低的问题，而且，随着牛物技术的发展，仍需要表达量高，活性好且适用于生产的重组肠激酶。
发明内容为了解决上述问题，本发明的发明人进行了大量实验，参照牛肠激酶轻链EKL与其抑制剂VD4K-氯甲的复合物的晶体结构(Codeno:IEKB，ProteinDtabaseBank),观察以VD4K为中心5A范围内的氨基酸残基的情况，选择突变后可能增强EKL与DDDDK结合活性的残基，将其突变为R，以增强其与VD4K中DM结合力。共设计/9个突变体，分别命名为EKLml、EKLm2、EKLm3、EKLm4、EKLra5、EKLm6、EKLm7、EKLm8、EKLm9，活性测定比较表明野牛型EKL的米氏常数Km及5乂大反应速度Vmax与R&D同类产品相似，9个突变体中，EKLm3、EKLm5、EKLm6、EKLm7和EKLm8的Km与野生型相比均有不同程度的下降，K中以EKLm6的Km值降低最为显著，即EKLm6具有与底物最佳的亲和力。本发明的发明人还采用毕赤酵母表达系统对EKLm6进行了表达，获得了高活性的EKLm6，实验结果表明酵母表达的EKLm6的活性也同样高于EKL，酵母表达的EKLm6活性是大肠杆菌表达的相同蛋白的2倍。由于大肠杆菌表达系统获得的肠激酶轻链包涵体产物复性l木l难，因此活性蛋白的得率极低。为了尽可能提高EKL活性蛋白的产量，分别选取肠激酶重链EKH的各结构域^EKL经一个10肽的柔性Linker相连构成融合蛋白，通过诱导表达EKL、EKI」m6、EKH1-EKLra6、EKH3-EKLm6、EKH4-EKLm6、EKH5-EKLm6，结果表明每100gEKH5--EKLra6包涵体可复件纯化得到113.8mg蛋白，其得率较EKL(10.4mg)、EKLm6(9.8mg)、EKH1-EKLm6(7.6mg)、EKH3-EKLm6(12.6mg)和EKH4-EKLm6(9.5mg)有显著提高，更具体地，为了增强复性效果，提高活性蛋白的得率，在复性缓冲液中添加了PEG-8000和丙二醇，辅助蛋白的正确折叠以及保持蛋白的活性。另外，采用特异性极高的STI亲和层析柱来纯化有活性的蛋白，可以有效的将正确折叠的目的^t」跟未正确折夢的f的蛋白以及杂蛋白分开，得到纯度达98%以上的活性蛋白，极大的提高了蛋白的纯度，避免了金属螯合柱纯化蛋白杂质较多的弊端。活性测定表明利用大肠杆菌表达的EKH5--EKLm6融合蛋白和EKLm6的活性相似，与市场现有的腿D公"j的产品相比，其活性提高/近10倍，酵母表达的EKLm6活性与市场现有的R&D公司的产品相比活性提高了近20倍。上述结果表明，本发明公开的重组牛肠激,达到了本发明的y的。图1:牛肠激酶轻链与艽抑制剂VD4K-氯甲的复合物的二维结构图，艽中牛肠激酶轻链氨基酸用条带表示；VD4K-氯甲的氨基酸残基用浅色标识；牛肠激酶轻链中与抑制剂紧密接触的氨基酸残基用深色标识；图2:重组牛肠激酶轻链突变体序列比较图，短划线代表突变体中与EKL在相对应位置相同的氨基酸残基；图3:重组牛肠激酶重链结构域-轻链突变休融合蛋白基因结构图；3-1:EKH1-EKLm6;3-2:EKH3-EKLm6;3-3:EKH4-EKLm6;3-4:刚5-EKLm6;图4:EKL及突变体Km、Vmax测定，Linewaver-Bu:rk作图结果;图4-1:EKLml;图4-2:EKLra2;图4-3:C.EKLm3;图4-4:EKLm4;图4--5:EK1肌5;图4-6:EKLm6;图4-7:EKLm7;图4-8:EKLm8;图4-9:EKLm9:图5:温度对酶切thioredoxin融合蛋白Trx/h[Lll的影响结果；其中1:20。C，2:10。C，3:30"C;图6:反应时间对酶切U"oredoxin融合蛋白Trx/hIL-丄l的影响结果；其中1:40hr，2:20hr，3:10hr，4:5hr;图7:不同用量的酶酶切thioredoxin融合蛋白Trx/hIL-11的结果；其中1:1.28ng，2:0.64ng，3:0.32ng，4:0.16ng,5:0.08ng，6:().04ng，7:0.02ng，8:0;图8:EKH5-EKLm6的稳定性检测结果:其中l:2("C，保存6个月，2:-20'C及37'C反复3次，3:37。C放置l天，4:37。C放置3天，5:37。C放置5天，6:3TC放置7天，7:37。C放置i0天，8:对昭./、、、，图9:底物浓度对酶促反应速度的影响曲线；图10:双倒数坐图结果。图11:反应温度对酶切thioredoxin融合蛋白Trx-MBL-CLR的影响实验结果图12:反应时间对酶切thioredoxin融合蛋白Trx-MBL-CLR的影响实验结果图13:酶切thioredoxin融合蛋白Trx-MBL-CLR的最适比例实验结果图14:EKH5-EKLm6的稳定性检测结果具体实施例方式以下实施例仅对本发明进行进一步说明，不应理解为对本发明的限制，实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法以及经典的细胞融合和筛选、分离和纯化等方法。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人w是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sainbrook，J.，Fritsch,E.F.andManiais，T.(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndedition,ColdspringHarborLaboratoryPress.本发明实施例中未标明来源的原、辅料均为市售。thioredoxin—humaninterleukin—11(TrxZhIL--.11)(上海中寸言BH建药业有限公司)9Trx-MBL-CLR:按《人MBL-CLR表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达》(《细胞与分子免疫学杂志》2007No.23(1)Page:25-7，31蔡学敏、左大明等)中公开的方法制备得到实施例1牛EKcDNA片段的克隆取150mg新鲜的牛十二指肠，用Trizol试剂(Invitrogen公司产品)提取总RNA，取0.总RNA，加入oligo(dT)lSprimer引物，补加水至总体积10.5，混匀。室温放置10min，高速离心5min。再依次加入4.5X逆转录反应缓冲液，0.RNA酶抑制剂，2.(M]0mM(lNTP，2.(MDTT，羅LV逆转录酶，混匀，置37。C反应120nin。取1.5W.RT产物，加入lOOpmol上游引物(5'-aagcttatggg'gu:aaagcgaagtgt-3')禾U下游引物(5'-gaattctcaatgt卿認ctttgtatcc-3，，参照CenB肌k中牛Enterokinase的编码序列，序列号U09859设计引物)，2.5^1IOXPCR缓冲液，2.5mMdNTP，2.5DMSO，0.25T叫酶，加水至终体积，混匀后迅速加入的石蜡油进行PCR扩增。反应条件为94'C变性4min;然后进行以下30个循环94'C变性50s，5rC退火50s。72"C3rain;最后在72。C延伸8mim。将cDNA片段电泳，然后按照试剂盒说明书进行胶分离回收。将PMD18-T载体与8W回收的PCR产物在T-4DNA连接酶的作用下16'C连接过夜，然后转化氯化钙法制备的感受态大肠杆菌D115a。随机挑取单一0色菌落5个，37。C摇菌过夜，进行质粒提取，以Hind.U丄和EcoRI酶切鉴定，对插入的片段进行全序列测定，筛选出正确插入者，命名为pMD18-T-EK。实施例2EKLm的设计及pET39h-EKL和pF/H9h+:KLm表达质粒的构建为了提高肠激酶的活性，本申请的发明人参照牛肠激酶轻链与其抑制剂VD4K--氯甲的复合物的晶体结构(Godeno:1EKB，ProteinDtabaseBank),观察以VD4K为中心5A范围内的氨基歐残墓的情况，选择突变后可能增强EKL与DDDDK结合活性的残基，将其突变为R，以增强其与VD.,K中D的结合力。共设计了9个突变体，如图1所不。以鉴定正确的pMD18-T-EK为模板，PCR冉次扩增牛肠激酶轻链编码区cDNA片段，上游引物为5-gaattcggacgacgacgacaagattgtcggaggaagtgactcc-3，，下游引物为5，-aagctttcaatgtagaaaactttgtatcc-3'。上游引物带EcoRI酶切位点和肠激酶识别位点，下游引物带HindIII酶切位点和终止密码了。PCR扩增条件为94'C变性4min:然后进行以下30个循环94。C变性45s，52"C退火45s。72"C延伸1min;最后在72'C延伸7mim。PCK扩增产物琼脂糖凝胶电泳鉴定后进行回收(方法同前)，构建EKL基因。在此基础上，为提高其结合活性，做9个突变体，突变位点如图1所小，分别定名为EKLml、RKbn2、RKl」m'3、EKLm4、EKLm5、EKl,m6、EKLm7、EKLm8、EKLm9，将测序正确的突变体基因分别与pET39b质粒用HindIII和EcoRI37°C双酶切2小时。经0.8%琼脂糖凝胶电泳分离并回收酶切产物。目的片段及载体按摩尔比4:1混合，10W连接体系，1WT4DNA连接酶，16X:水浴过夜。连接产物转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞，挑选重组克隆培养，提取质粒DNA，经HindIII和EcoRI双酶切鉴定正确克隆，分别命名为pET39b-EKL和pET39b-EKLml，pET3恥--EKLm2,pET39bEKLm3，pET39b-EKLm4，pET39b-EKLm5，pET39b-EKLm6，pET39b-EKLm7，pET39b-EKLtn8，pt:T:Wb-EKLm9。实施例3pET39b-EKL和pET39b-EKLm的诱导表达pET39b载体上提供的硫氧还蛋白类似物[).sbA可以帮助蛋A质正常折叠，从而产牛有活性的可溶蛋白。将各工程菌接入LB培养基中。放入摇床在37"C，250rpra条件下过夜培养。将过夜后的种了-液加入2YT培养基中，放入摇床在37"〔〕,250rpra条件下培养。当OD柳,为0.6时，加入O.1mMIPTG进行诱导，放入摇床在3(rC，250rpm条件下继续培养。诱导2h后取样，离心去上清，沉淀放入冰箱，然后每过lh取样，同样离心去上清，将沉淀放入冰箱。诱导6h后收瓶，离心去上清。PAGE电泳检测诱导表达情况，以诱导4小时时目的蛋白表达量最高。根据大肠杆菌摇床表达的实验结果将活化的工程菌接入LB培养基中，放入摇床，在3rC，250rpm条件下过夜培养。将过夜后的种子液加入发酵罐中，培养温度37"C，氨水调节pH为7.4，饱和氧气体积分数保持>130%。当OD为8.0时，取样做对照，并加入0.3油lIPTG进行诱导，温度降低全3CTC。诱导3h后收罐，离心去上淸。实施例4EKL及其突变体的复性和纯化将表达EKI,及其突变体的大肠杆菌发酵液离心(8()00rpm，10min，4°C)弃上清，用缓冲液(50mMTris-HClpH8.5)以1.0g菌体10m]缓冲液悬浮菌体。待完全溶解。然后超声(800w/30s，4-6次)破菌30min，镜检显不菌体完仝破开后，离心(12000rpm，15min，4'C)弃上清，收柒包涵体沉淀，用于进一步纯化。每克包涵体以8ml溶解液(8M尿素，20mMTris100mM2-MT0)变性溶解，脱盐去除f3-MT后稀释复性(至尿素终浓度1M)16'C过夜。脱盐至酶切缓冲液(20mMTris50mMNaCllraMCaCLPH8.75)自切10小时。以ST丄(特异性胰酶抑制剂，可特异结合EK)亲和层析柱纯化EKL及其突变体。每100g包涵体可复性纯化得到约5-15mg蛋白。实施例5EKL及其突变体的米氏常数(Km)和圾大反应速度(Vm)的测定在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶促反应的速度有很大的影响。在底物浓度很低时，反应速度随底物浓度的增加而急骤加快，两者呈正比关系；3底物浓度较高时，反应速度虽然随着底物浓度的升高而加快，似不再呈正比例加快；当底物浓度增高到一定程度时，如果继续加大底物浓度，反应速度不再增加，说明酶已被底物所饱和。在酶的浓度不变的情况下，底物浓度对反应速度影响的作用呈现矩形双曲线。见图9。酶促反应速度与底物浓度之间的变化关系，反映了[ES]的形成与生成产物[P]的过程。在[S]很低时，酶的活性中心没有全部与底物结合，增加[S]，[:ES'j的形成与[P]的生成均呈正比关系增加；当[S]增高至一定浓度时，酶全部形成了i—ESI，此时再增加[S]也不会增加[ES]，反应速度趋于恒定。为了解释底物浓度与酶促反应速度的关系，1913年Michaelis和Menten把上图归纳为酶促反应动力学最基本的数学表达式---米氏方程Michaelis-Menten:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>式中v——反应速度；Km——米氏常数；Vmax—-—-酶反应最大速度；[S]—-一底物浓度。在酶学分析中，Km是酶的一个基本特征常数，它包含若酶与底物结合和解离的性质。Km与底物浓度、酶浓度无关，与pH、温度、离f强度等因素有关。对于每一个酶促反应，在--定条件下,有其特定的Km值，因此可用于鉴别酶。米氏常数(Km)的意义1.当反应速度为最大速度一半时，米氏方程可以变换如下1/2Vmax二Vmax[S]/(Kra+[S])所以Km=[S]。因此，Km值等于酶促反应最大速度一半时的底物浓度。2.Km值可判断酶与底物的亲和力(Km佰愈大，酶与底物的亲和力愈小；反之亦然)。3.Km值是酶的特征性常数，只与酶的结构、酶所催化的底物和酶促反应条件有关，与酶的浓度无关。酶的种类不同，Km值不同，同一种酶与不同底物作用时，Km值也不同。测定Km、V腿x，一般用作图法求得。作图法有很多.最常用的是Linewaver-Burk作图法，该法是根据米氏方程的倒数形式，以Vv对1/[S]作图，可得到一条直线(见图)。直线在横轴上的截距为-1/Km，纵截距为1/Vmax，可求出Km4Vmax。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>见图10。F'nl,erokinase活性通过其荣光底物GlyAsp-AspAsp-Asp-Lys--naphthylamide(Sigma)测定。多肽底物溶解于含有10"M)MS0，70mMTrisHC1，pH8.O溶液屮。100LEmerokinase溶液与2.4mL底物溶液泡.合，室温(25°C)，测定单位时间内荧光强度的变化，通过荧光强度的增强检测酶活性，激发波长337nm，检测波长420mn。Km通过Linewaver-Burk作图法计算。为计算方便，Enterokinase驗角军Gly-AspAsp—Asp-Asp—Lys—naphthylamide，反应30秒荧光强度增加l，定义为1AU。反应中，重组牛Enterokinase用量为50nM，底物浓度分别为O.05、0.1、0.2、0.4及0.8mM。结果见表b4、图4:表1<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表2<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表3<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>结论:野生型EKL的Km及Vmax与股D同类产品相似，9个突变体中，EKLm3、EKLm5、EKLm6、EKLm7和EKLm8的Km与野牛型相比均有不同程度的下降(EKLm3、EKLm5、EKLm6、EKLm7和EKLm8的氨基酸序列经过测序分别为SEQIDNO:13、SEQ丄DNO:14、SEQ丄DNO:2、SEQ丄DNO:15、卿丄UNO:16)，艽中以EKLm6的Km值降低最为显著，即EKLm6具有与底物最佳的亲和力。实施例6pET39b/EKH-EKLm6融合蛋白表达质粒的构建由于大肠杆菌表达系统获得的肠激酶轻链包涵体产物复性闲难，因此活性蛋白的得率极低。为了尽可能提高EKL活性蛋白的产量，在采用pET39b表达载休的基础上，分别选取肠激酶重链EKH的各结构域与EKL经一个10肽的柔性Link"(核苷酸序列见SRQIDNO.11，氨基酸序列见SEQIDNO.12)相连构成融合蛋白，通过对各融合蛋白的复性情况及活性测定筛选最优化的fc合蛋白结构，具体实验方法如下。以鉴定正确的pMD18-T-EK为模板，再次PCR扩增牛肠激酶重链结构域5及以pET39b-EKLm6(SRQIDM):和SEQTDNO:2分别显不了EKLm6的核苷酸序列和氨基酸序列)为模板扩增轻链编码区DM片段，重链第5结构域上游引物为5'-gaattcggacgacgacgacaagcgtctcttcaatggcacg--3'，下游引物为5，cccaccgcctgagcctccaccgccgtagaaacattgtagcag--3',轻链编码区上游引物为5-'gaggctcaggcggtgggggttctattgtcggaggaagtga.ctc-3，，轻链下幼,引物为5，-a—tgct.tcaatgtagaaaactttgtatcc-3'。重链第5结构域上游引物带有EcoRI酶切位点和肠激酶识别位点，轻链下游引物带HindIIIS每切位点和终止密码了。重链第5结构域下游引物和轻链编码区上游引物重叠PCR扩增条件为94°C预变性4muu然后94°C变性45秒、55'C退火1min、72°C1min，进行30个循环；最后在72"C延伸7min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后回收，用overlapPCR的方法连接，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收，4pET39b质粒DNA分别用HindIII和EcoRI于37。C酶切2hr。]XTAE，0.8%琼脂糖凝胶电泳，分别回收酶切产物。处理后的插入片段及载体按摩尔比4:l混合，10叱连接体系，]WT4DNA连接酶，16'C水浴过夜。连接产物转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞，挑选重组克隆培养，提取质粒DNA，经Hind丄丄丄和EcoRI双酶切鉴定正确重组克隆，命名为pET39b/'EKH5--EKLm6。用同样的方法构建牛肠激酶重链结构域i、3、4(重链各结构域引物如下重链第1结构域上游引物为5'-gaattcggacgacgacgacaagccacctgfittcaaggctgtg3'，下游引物为5，cccaccgcctgagcctccaccgccagctgtggcacaagt:tUattg--'3';重链第3纟5构域上游引物为5，-gaattcggacgacgacgacaagtgtggagggcctcatgacc--3'，下游引物为5，cccaccgcctgagcctcc,accgccat.agccagta.gtgaaal,',1,g(—3，；重链第4纟吉构域上游引物为5，-gaattcggacgacgacgacaagaaggaagacaattttcagtg-'，"F游弓l物为5'cccaccgcctgagcctccaccgccacagtgtgcttcatctgagc-3，。轻链引物同ii[)与EKLm6的融合蛋白表达质粒'分别命名为pET39b/EKH1-EKLm6、pET39b/EKH3-EKLm6、pET39b/EKH4-EKLm6。SEQIDN0:3和SEQIDNO:4分别显示了EKH1-EKLm6的核昔酸序列和氨基酸序列。SEQIDN0:5和SEQIDNO:6分别显不了EKH3-EKLmt)的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQIDN0:7和SEQIDNO:8分别显示了EKH4-EKLm6的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQIDN0:9和SEQIDNO:10分别显示了EKH5-EKLm6的核苷酸序列和氨基酸序列。实施例7pET39b/EKIfEKLm6融合蛋白的诱导表达方法同实施例3，分别诱^表达EKH1-EKLm6、EKH3-EKl」m6、EKH4-EKLin6、EKH5-EKLm6。实施例8pET39b/EKH-EKLm6融合蛋l'1的复性和纯化方法同实施例4，结果如表5所不,每100gEKH5-EKLrn6包涵体可复件纯化得到113.8mg蛋0，其得率较EKL、EKLm6、EKH1-EKLm6、EKH3-EKLm6和EKH4--EKLm6有显著提高。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>实施例9EKL和EKLm蛋白在毕赤酵母中的表达将pET39b-EKL和pET39b-EKLm(1-9)中的目的基因以B咖H1和EcoK丄酶切，装入同酶切的pPICZaA(Invitrogen)质粒中。连接产物转化CaCL法制备的T0P10F感受态细胞，挑选重组克隆培养，提取质粒DNA，经BamHI和EcoRI双酶切鉴定正确重组克隆，分别命名为pPICZaA-EKL和pPICZaA-EKLraa-9)。随后提取的质粒线性化，转化感受态酵母细胞GS115(Irwitr。gen公司)，RDB平板初步筛选，得到阳性重组子。将活化的工程齒分别接种于YPD和BMGY培养基中，放入摇床在3(TC、250rpra条件下过夜培养。将过夜培养后的种了液倒回原BMGY培养基中，旗人摇床，在3(TC、250rpm条件下培养48h。补加无水甲醇诱导，至终浓度为0.5%。甲醇诱导后每隔12h取样，检查肠激酶表达情况，并补加无水甲醇，至终浓度为O.5%。诱导72h后收瓶，对所取样品进行分析。同时在全白动30L发酵罐中按装量10L的水平进行了探索性培养和发酵。将工程菌接种于1LYPD(分2瓶装)培养基中，放入摇床在30'C、250rpni条件下培养。当％。为5.0且镜检菌种形态合格时，转入到发酵罐中。培养温度30°C，氨水调节pH5.0，16把和氧气体积分数保持不低于20%。发酵过程中依据菌体牛长密度添加高压灭菌后的50%甘油。当菌体密度达0D为200250时加入无水甲醇诱导，控制其终浓度不超过1%，此时pH值控制在3.0。诱导后每12h取样，测0D和菌休湿重，并测定活性。诱导72h后收罐，离心取上清，准备纯化。实施例IO毕赤酵母中表达的EKL和KKLm蛋i'l的纯化收集上清，经mil.ipore超滤膜超滤浓缩，将上一步获得的浓縮液用1M的NaOH调pH8.0后，经ChelatingS印har()seFastFlow柱纯化。先用缓冲液(25mmol/LTris-HClpH8.0，0.3MNaCl)沖洗平衡柱子，将pH8.0的浓縮液上样，流速为4cm/mn,收柒穿透液。上样后用平衡液冲洗至基线，用洗脱A液(25mMTris-HC1pH8.0，50n咖)l/L咪唑)洗脱蛋白，收集洗脱峰1，再用洗脱B液(25mMTris-HC1pH8.0，200隱ol/L咪唑)洗脱蛋白，收集洗脱峰2，SDS-PAGE检测，结果见表6。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>实施例llpET39b/EKLm6，pET39b/腦EKLm6'pPTCZaA-EKLm6的活性测定材料分析缓冲液50mMTris，pH7.5;重组牛Enterokinase:本发明制备；底物thiobenzylbenzyloxycai"bony1-七--lysinate(Z-Lys--SBzl)(BachemCatalog#M-1300);5,5'-dithio-bis(2—nitrobenzoicacid)(DTNB)(SigmaCatalog#D—8130);96孔酶标板(Costar,Catalog#92592);酶标仪(SpectraMaxPlus,MolecularDevices);重组牛肠激酶4139-SE，R&D公司产品方法用分析缓冲液将重组牛Entorokinase稀释至O.04ug/mL;用含有200yMDTNB的分析缓冲液将Z--Lys-SBzl稀释至200uM;96孔板中加入重组牛F川,erokinase稀释液，50uL/孔，空白对照孔加入分析缓冲液，50uL/孔每孔加入50uLZ-Lys-SBzl/DTNB混合液开始反应；以动力学模式读取A405nm,共5分钟；计算重组牛Enterokinase特异活性96孔板中酶及底物终浓度(量)重组牛Enterokinase:2ng重组牛肠激酶4139-SE:2ngDTNB:100uM底物Z-Lys-SBz:100yMA405/min=(V,满ax—V空白腿x)(mOD/min)/校正因了'cm/1000活性"le/min/yg)=([A405/min(按—匕式计算得到)X体积(0.0001L)]/[消光系数(13260M—'cm—1)X酶量(ug)BX10"结果见表7:表7<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>结论野生型EKL活性与腿D同类产品相似，而大肠肝菌表达的EKLm6、EKH5-EKLm6活性较野牛型提高了l()倍左右，酵母表达的EKU-n6活性是大肠杆菌表达的相同蛋白的2倍。实施例12:反应温度对酶切thi.o:redox丄n融合蛋l'lth:i.o:redoxin-humaninterleukin-11()'rx/hlL-ll)的影响实验含有enteropeptidase酶切位点(DD丽)的融合蛋白thioredoxin-humaninterleukin-11(Trx/hIL-11)(以下均私〈Trx/hTL-11)以2()ug与2ngEKH5--EKLni6反应，反应体系为O.lMTris-HC1(pH8.0)，lmMCaCL，及O.1%Tween20，反应体积20uL，酶切温度分别为10。C、20XJ及3(TC，反应20hr。反应产物利用SDS-PAGE进行检测。SDS-PAGE结果显不，EKH5-EKLm6在20。C具有最佳的酶切活力(见图5)实施例13:反应时间对酶切thioredoxin融合蛋白Trx/h]丄-11的影响实验含节enteropeptidase酶切位点(,DK)的融合蛋白thioredoxin--humaninterleukin-11(Trx/hlL厂11)以20yg与2ngEKH5-EKLm6反应，反应体系为O.lMTris.HCl(pH8.0)'lraMCaCl"及O.l%Tween20，反应体积20uL，反应温度为2()T〕，反应时间分别为5hr、10hr、20hr及40hr。反应产物利用SDS.PAGE进行检测。SUS-PAGE结果显示，EKH5-EKLm6在20。C酶切Trx/hlL-11，2()hr可酶切完全(见图6)。实施例14:酶切th:ioredoxin融合蛋白Trx/hlL-ll的设适比例含有enl,ee「opeptidase酶切位点(DDDDK)的融合蛋白thiol-edoxin-humaninterleukin11(Trx/1IL-11)以20ug与0，0.02，0.04，0.08，0.16，0.32，0.64及1.28ngEKH5-KKLm6反应，反应体系为O.丄MTris-HC1(pH8.0)，lmMCaCl"及0.1%Tween20，反应休积20yL，反应条件20。CX20hr。反应产物利用SDS-PAGE进行检测。SDS-PAGE结果显示，EKI15-EKLm6在20。C酶切Trx/hlL11，反应20hr,在酶底物=1:20000(m:m)(质量比以下同)即可酶切完全(见图7)。实施例15:EKH5-EKLm6的稳定性检测EKH5-EKLm6模拟在实际保存过程中可能遭遇的不利条件，而后检测其酶切Trx/hlL-11的能力，以20ug与l.28ngEKH5-EKLm6反应，反应体系为O.1MTris-HC1(pH8.0),lmMCaCl"及0.1%Tween20，反应体积20uL，反应条件2(TCX20hr。反应产物利用SDS-.PAGE进行检测。拟保存条件下留样考察-20°C,保存6个月；反复冻融-20'C及37'C反复3次;高温37。C放置l、3、5、7、10天。SDS-PAGE结果显不，EKH5-EKLm6在上述保存条件下，对酶切活性没有显著影响(见图8)。实验例16反应温度对酶切thioredoxin融合蛋r:lTnc-MBL-CLR的影响实验含有enteropeptidase酶切位点(DD)DK)的融合生tlTrx-MBL-CLR以20叫与2ngEKH5-EKLm6反应，反应体系为0.1MTris—HCI(pH8.0)，1mMCaCl2及0.1%Tween20，反应体积20juL，酶切温度分别为10。C、2(TC及30。C,反应20hr。反应产物利用SDSPAGE进行检测。结果见图llSDS-PAGE结果显不，EKH5-EKLm6在2(TC具冇最佳的酶切活力。实施例17反应时间对酶切thioredoxin融合蛋白Trx-MBL-CLR的影响实验含有enteropeptidase酶切位点(DDDDK)的融合蛋白Trx-MBL-CLR以20吗与2ngEKH5EKLm6反应，反应休系为O.1MTris…HCI(pH8.0)，lmMCaCl2，及O.1%Tween20，反应体积20^L，反应温度为20'C，反应时间分别为5hr、10hr、20hr及40hr。反应产物利用SDS-PAGE进行检测。结果见图12SDS-PAGE结果显示，EKH5-EKLm6在2(TC酶切T"-MBL-CLR，20hr可酶切完全。实施例18酶切thioredoxin融合蛋白Trx-IVIBL-CLR的最适比例实验含有enteropeptidase酶切位点(D[)[)[〕K)的融合蛋白Trx-MBL-CLR以20吗与0，0.02,0.04，0.08，0.16，0.32，0.64及I.28ngEKH5-EKLm6反应，反应体系为0.1MTris-HCI(pH8.0)，lmMCaCl2,及0.1%Tween20，反应休积2()pL，反应条件20°020hr。反应产物利用SDS--PAGE进行检测。结果见图13SDS-PAGE结果显不，EKH5-EKLm6在20'C酶切Trx-MBL-CLR，反应20hr，在酶:底物二:l:20000(m:m)即可酶切完全。实施例19EKH5-EKLm6的稳定性检测EKH5-EKLm6模拟在实际保存过程中可能遭遇的不利条件，而后检测其酶切Trx-MBL-CLR的能力，以20吗与1.28ngEKH5-EKLm6反应，反应体系为0.MTris-HCI(pH8.0)，lmMCaCl2，#0.1%Tween20,反应体积20(xL，反应条件2()。Cx20hr。反应产物利用SDS-PAGE进行检测。拟保存条件下留样考察-20°C，保存6个月；反复冻融-20'C及37'C反复3次;卨温37。C放置l、3、5、7、l()天。SDS-PAGE结果见图14，结果显不，EKH5-EKLm6在上述保存条件下，对酶切活性没有显著影响。序列表SEQUENCELISTING〈110〉上海张江生物技术有限公司<120>重组牛肠激酶、其制备方法及应用<130>CN0111370.3<150>200710040551.0<151〉2007-05-11<150>200710040552.5<151>2007-05-11〈160>16<170>Patentlnversion3.4<210〉1〈211〉705<212〉腿<213>Unknown〈220>"23>轻链突变体核苷酸序列〈400〉1attgtc卿ggaagtgactccag卿aggagcctggccttgggtcgttgctctgtatttc60gacgatcaacaggtctgcggagcttctctggtgagc鄉gattggctggtgtcggccgcc120csctgcgtgtacggg卿aa"Utggtigcc.g朋gcagt,gctaggcct,gcat180att,gacttctcctxagatagaaacta,ggttgattgacca240gsg￡i￡i￡igaacccatgatgca300acacagattatatacagccta,tttgtttectcaagttttt360gaatttgttctattgctggctggggggcacaggttctact420gcagacgtactgctiag犯gctgacgttccccttctatcaa,atgagaaatgtC￡l3C￡L￡LC￡lg480gtaacattacggaaaatatggtgtgtgcaggctatgaagc3gg鄉ggt3540gattcttgtc鄉ggg3ttcctcat.gtgccc&gatggctc600ctggctggcgLggar,gU:a,a,tgt.g(Lt.g(，鄉ggtgtatfi60gcccgggtcccaaggttcac卿gtggatacangttttx705〈210>2〈211>235<212〉PRT<213〉unknown<220>〈223〉轻链突变体氨基酸序列<■〉2l丄eValGlyGlySerAspSerArgGluGlyAlaTrpProTrpValVali51015AlaLeuTyrPheAspAspGinGinValCysGlyAlaSerLeuValSer202530ArgAspTrpLeuValSerAlaAlaHisCysValTyrGlyArgAsnMet354045GluProSerLysTrpLysAlaVa:LLeuGlyLeuHisMetAlaSerAsn505560LeuThrSerProGinlieGluThrArgLeu丄丄eAspGinlieVallie65707580AsnProHisTyrAsnLysArgArgLysAsnAsnAsplieAlaMetMet859095HisLeuGluMetLysValAsnTyr'ThrAspTyrlieGinProlieCys100105110LeuProGluGluAsnGinValPheProProGlyArglieCysSerlie115120125AlaGlyTrpGlyAlaLeulieTyrGinGlySerThrAlaAspValLeu130135140GinGluAlaAspValProLeuLeuSerAsnGluLysCysGinGinGin145150155160MetProGluArgAsnlieThrGluAsnMetValCysAlaGlyTyrGlu165170175AlaGlyGlyValAspSerCysGinGlyAspSerGlyGlyProLeuMet180185190CysGinGluAsnAsnArgTrpLeuLeuAlaGlyValThrSerPheGly195200205ArgGinCysAlaLeuProAsnArgProGlyVa,JTyrA]aArgVa.lPro210215220AjgPheThrGluTrplieGinSerPheLeuHis225230235<210〉3<211〉855<212>DNA〈213〉Unknown〈220〉〈223>重组牛肠激酶重链结构域--轻链突变体融合蛋白EKH1-EKLm6核苷酸序列<400>3ccacctgattc肌ggctgtgtgctgatgctctaaagt:gcatttattttgt60ta犯ctgtccagatggctctgf-itga,agaca,tgccacagct120ggcggtggaggctcaggcggtgggggttxtaUgtcg-gtiggaagtga,ctcC3g￡lg￡l￡lgg￡l180gcctggccttgggtcgttgctctgtatttc鄉tctgcggagcttctctg240gtgagC￡Lgggattggctggtgtcggccgccca,ctgcgtgtacgggagtmatatggagccg300t，力agtggaaagcagtgctaggcctgcatatggcat:caaatctgacttctcctcagata360g￡L33Ct3ggttgattgaccaa^ttgtceittiaacccacy.ct￡LC￡L￡lt￡i￡l￡lCg420ccatgatgcatcttgaemtgaaagt:gaetcttatacagcct■atttgtttactcaagtttttcccccaggatigaatttgttctattgctggc540tggggggcacttatatatcaaggttctactgcagacgtactgcaagemgctgacgttccc600cttctatcaaatgagaaatga,tgccagaacggeia犯t8tg660gtgtgtgcaggCt3tg33gCgattc.ttgtc郷gggattcaggcggacca720c'cxatgtgcccagatggctcctggctggcgt:gacgtcat.ttggacgtcaa780tgtgcactgcctaatcgcccgcccgggtcccaaggttcac卿gtgg自840caaagttttctacat855<210〉4<211>285〈212〉PRT<213>Unk丽n〈220>〈223>重组牛肠激酶重链结构域-轻链突变体融合蛋白EKH1--EKLm6氨基酸序列〈400>4ProProAspSerArgLeuCysAlaAspAlaLeuLysCyslieAlalie151015AspLeuPheCysAspGlyGluLeuAsnCysProAspGlySer'AspGlu202530AspAsnLysThrCysAlaThrAlaGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGly354045GlySerlieValGlyGlySerAspSerArgGh」GlyAlaTr'pProTrp505560ValValAlaLeuTyrPheAspAspGlriGinValCysGlyAlaSerLeu65707580ValSerArgAspTrpLeuValSerAlaAlaHisCysValTyrGlyArg859095AsnMetGluProSerLysTrpLysAlaVa丄LeuGlyLeuHisMetAla100105110SerAsnLeuThrSerProGinlieGluThrArgLeulieAspGinlie115120125VallieAsnProHisTyrAsnLysArgArgLysAsnAsnAsplieAla130135140MetMetHisLeuGluMetLysValAsnTyrThrAspTyrlieGinPro145150155160lieCysLeuProGluGluAsnGinValPheProProGlyArglieCys165170175SerlieAlaGlyTrpGlyAlaLeulieTyrGinGlySer.ThrAlaAsp180ValLeuGinGluAlaAspVal195GinGinMetP.roGluArgAsn210215TyrGluAlaGlyGlyValAsp225230LeuMetCysGinGluAsnAsn245F:ieGlyArgGinCysAlaLeu260ValProArgPheThrGluTrp275〈210〉5<211〉1071<212〉DNA<213〉Unknown<220><223〉重组牛肠激酶重链结构域-轻链突变体融合蛋白EKH3--EKLm6基因序列<400〉5tgt鹏gggcctcatgacctgtggg3gCCfcltcacgtctataaacttccca60aacagctaccctaatcaggctttctgta,t:ttgg肌tt:ta,a,ggg肌eia^t120attcagctccactttcaagaatttgacctgC￡Lg￡ltgt:￡lgttgaaatcags180gatggtgsaggagatgattccttgttcttagctgtgtacac鄉ccctggtccagtaaac240gatgtgttctcaaccaccaaccgaatgactgtgctttttatcactgataatatgctggca300已aacagggattttcactactggctatggcggtggaggctcaggcggtggg360ggttctattgtcgg鄉犯gtgSCtCC￡lg￡lg肌ggagcctggcct,tgggtcgttgctctg420tatttcgacgatc犯caggtctgcggagcttctctggtgagcaggga.ttggctggtgtcg■gccgcccactgcgtgtacgggagaaa,tatgga,gccgtctaagtggaaagcagtgctaggc540ctgcatatggcatcaaatctgacttctcctctaggttgattgaccaaatt600185ProLeuLeuSerAsn200lieThrGluAsnlie280190GluLysCysGin205MetValCysAlaGly220AspSerGlyGlySerCysGinGl.y235ArgTrpLeuLeuAlaGlyValThr250255ProAsnArgProGlyValTyrAla265270GinSerPheLeuPro240SerArgHis285aca11gccat:gatgcatc11660g￡l3￡ltga￡lflgtgaactacaccagcctat:ttgt:tl:ficcagtit柳犯a,tcaB720gtttttccccttgttctattgctggctggggggcacttatatatcaaggt780tctactgcagacgtactgcaag￡l￡lgCtg￡iCgttccc'cttc840ceiacagatgccagaacgtaaceitta.cggaaaa,tatggtgtgtgc鄉ctatg肌gc.Eigga.900ggggt卿ttcttgtc鄉gggattc郷cggaccfi('.tcHtgtgcca,agaaaacfiacaga.960tggctcctggGtggcgtga,cgtcaJ:ttggacactgcctaa,tcgcccaggg1020gtgtatgcccgggtccc犯ggttcacagaggttttctacat1071〈210〉6〈211〉357〈212〉PRT〈213〉Unknown〈220〉〈223〉重组牛肠激酶重链结构域-轻链突变体融合蛋白EKH3-EKLm6氨基酸序列〈400〉6CysGlyGlyProHisAspLeuTrpGluP—r()AsnThrThrPheThrSer15l()15lieAsnPhe:ProAsnSerTyrProAsnGinAlaPheCyslieTrpAsn20LeuAsnAlaGinLysGlyLys35AspLeuGluAsnlieAla50AspAspSerLeuPhe65AspValPhe25AsnlieGinLeuHis40ValValGlulieAsp55AlaVal.TyrThr30PheGinGluPhe45AspGlyGluGlySerLeu70ThrAsnArgMetArg60ProGlyProValThr85AsnMetLeuAlaLysGinGlyPheLys100105GlyGlyGlyGlySerGlyGlyG]y(;lyGly75Thr'Va]LeuPhelieThr9095AlaAsnPheThrThrGlyAsn80AspTyrThr110SerlieValGlyGlySerAsp115120GluGlyAlaTrpProTrpValValAlaSerArg130GinGinValCysGly145AlaAlaHisCys125Tyr.PheAspAspVal165AlaValLeuGlyLeuHisMetAla180LeulieAspGinProTrpValValAlaLeu135140AlaSerLeuValSe:rArgAspTrpLeuVal150155TyrGlyArgAsnMetGluProSerLysGluThrArg195LysAsnAsnAspMet170SerAsnLeuThrSer185VallieAsnProTrp175GinArgArg210A'jnT/rThrAspTyr225ValPheProProlie200lieAlaMetMetHis215GinProI丄eCyslie230ArglieCysSerlieTyrGinGly260AsnGluLysCysGly245SerThrAlaAspVtUL,euG丄nGluAlalie250L,euLeu235AlaGlyTrpGlyLeuLeuSer-275AsnMetValCysAlaGlyTyrGluAlaThrGlu290CysGinGlyAspSer305TrpLeuLeuAlaGin280GlyVal265GinGinMetProAla255ValAla295GlyGlyProLeuMet310ValThrSerPheGly325A*snArgProGlyValTyrAlaArg340GinSerPheLeuHisGly300CysGinGluAsnAsn315ArgGinCysAlaVal345Gly330ProArgPheThrGlu350Leu335TrpSer160LysliePro190TyrAsnLysHis205LeuGluMetLysVal220ProGluGluAsnGin240LeuProAsp270ArgAsnlieGlu285GlyValAspSerArg320Prolie355〈210〉7〈211〉837<212〉DNA<213>Unknown<220><223〉重组牛肠激酶重链结构域-轻链突变体融合蛋白EKH4-EKLm6基因序列〈400〉7aagg犯gacacaaggatggggygtgtdttc.tctctgtgac60ggttttccac〔ictgtaaggatggctcagatg犯gc:acactgtggcggtgga,ggctc鄉c120ggtgggggttctattgtcggagg卿tgactcca,gagaaggfigcctggccttgggtcgtt180gctctgtatttcgacgatc3aca,ggtc1:gcgga,gctl:ctct.ggt砂gceiggga,ttggct.g240gtgtcggccgccceictgcgtgtacggg卿g肌agcagtg300ctaggcctgcatatggcatcei犯tctg3cttctcctcagatagaaacta.ggttgat:tgac360Cgg￡lgfltl￡lga.tgccatgatg420tgaaagtga3cta.tttgttt￡!CC￡lg￡L￡lgM.480tt,cccccagg1:ct匕U:tgct:ggctggggggca_ctta_tatat540caaggttctaCtgC￡Lg3Cgtgctgacgt:tcccctl:ctatc600tgtca/acaacagatgccagatggtgtgtgcaggctatgaa660gc鄉郷ggtagattcttgtcagggggattcaggcggaccactcatgtg720tcctggctggcgtgacgtca,t:t,tggacgtctmtgtgcactgcctaeitcgc780cc鄉ggtgt3tgCCCgggt837〈210>8<211>279〈212〉PRT〈213〉Unknown<220><223>重组牛肠激酶重链结构域-轻链突变体融合蛋白EKH4-EKLm6氨基酸序列<400>8LysGlu1AsnLeuAspAsnPheGinCysLysAspGlyGluCyslieProLeuVal15GluCysPhe5GlyPheProHisGly10LysAspGlySerHisCysGly35SerArgGluGlyAspGlyPheProHisCys2025GlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySe'r'SerAsp50AspAspGinGinVal65ValSerAlaAla40AlaTrpProTr.pVa丄55GlyAlaSerLeuCys70CysValTyrGlyAspGluAla30lieValGlyGly45ValAIeiLeuTyrPhe60SerArgAspTrpHis85TrpLysAlaValLeuGlyLeuHisMet100105ThrArgLeulieAspGinGinlieGlu115AsnLysArgArgLysAsn130LysValAsnTyrThr145AsnGinValPheAsp120AsplieAlaMetAsn135TyrlieGinProValSerArgAspTrpLeu7580ArgAsnMetGluProSerLys9095A]aSerAsnLeuThrSerProi:ioI]eValT]eAsnProHisTyr125HisLeuGluMetAsp150ProGlyArglieMet140CysLeuProGluPro165AlaLeulieTyrGinGlySerThr180LeuSerAsnGlulie155CysSerl:leAlaGlyTrp170175AspValLeuGinGluAlaValProLeu195AsnlieThrGluAsnMet210AspSerCysGinGlyAsp225230Ala185CysGinGinGinGlu160GlyAspLys200CysAlaGlyTyrGluAlaGlyGlyValMet205AlaGlu190ProGluArgValCysAlaGlyTyrGlu215220SerGlyGlyProLeuMetCysGinGlu235Asn240AsnArgTrpLeuLeuAlaGlyVal245LeuProAsnArgProGlyValTyr260TrplieGinSerPheLeuHis275<210>9〈211〉1008〈212>DNA<213>Unknown<220><223>重组牛肠激酶重链结构域-轻链突变体融合蛋白EKH5-EKLm6基因序列<400〉9cgtctcttcaatggcacgacggtttggtgcagttcaggat60tggcatgtagcctgtgccgag￡i￡Lctggacaa,cccagat:cl:cagatgfitgtgtgtcagctg120ctgggactagggactgga肌ctcatccgtgccaa,cctttt,cl:ax、tggaggtggaccat.at180EtC￡ica,gca.cctaatggcagct,Uta,tax，Umcgcc朋gccaacagtgctta240tgattctgcttacggcggtgg鄉ctc郷cggtgggggt300tctattgtcgg鄉犯gtgsCtCC3g￡lg￡l￡Lggfigcctggccttgggtcgttgctctgtat360ttcgacgatcaacaggtctgcggagcttctctggtgagcag卿ttggctggtgtcggcc420gcccactgcgtgtacgggsgaaatatggeigccgtxtaagtgg咖.gcagtgct鄉cctg480catatggcatca_￡iatctgacttctcctca,gggttgaUgaccaaat—tgtc540ataaacccacttgccatgatgcatcttgaa600atgaaagtgaactacacagacctatttgtttelccagaaga660tttcccccaggaagetatttgttctattgctggctggggggcacttatatatcaaggttct720actgcagacgtactgcaaigaagctgacgttccccttctat780cagettgccagatggtg化tgcaggcl:atgaagcagg鄉g840gtagattcttgtc鄉gggattcaggcggaccactcatgtca3cag3tgg900ctcctggctggcgtgacgtcatttggacgtcaa,tgtgcactgcc.taatcgcccaggggtg960totgcccgggtxccaaggttC3C卿gtgg1008ThrSerPheGlyArgGinCysAla250255AlaArgValProArgPheThrGlu265270<210>10<211>336<212〉PRT<213>Unk謂n<220>〈223〉重组牛肠激酶重链结构域-轻链突变体融合蛋白EKH5-EKLm6氨基酸序列<400>10A—rgLeuPheAsnGlyThrThrAspSer'SerGlyLeuValGinPheArg151015lieGinSerlieTrpHisValAlaCysAlaGluAsnTrpThrThrGin202530lieSerAspAspValCysGinLeuLeuGlyLeuGlyThrGlyAsnSer354045SerValProThrPheSerThrGlyGlyGlyProTyrValAsnLeuAsn505560ThrAlaProAsnGlySerLeulieLeuThrProSer'GinGinCysLeu65707580GluAspSerLeulieLeuLeuGinCysAsnTyrGlyGlyGlyGlySer859095GlyGlyGlyGlySerlieValGlyGlySerAspSerArgGluGlyAla100105110TrpProTrpValValAlaLenTyrPheAspAspGinGinValCysGly115120125AlaSerLeuValSerArgAspTrpLeuValSer.AlaAlaHisCysVal130135140TyrGlyArgAsnMetGluProSer'LysTrpLysAlaValLeuGlyLeu145150155160H;isM。tAlaSerAsnLeuThrSerProGinlieGluThrArgLeulie165170175AspGinlieVallieAsnProHisTyrAsnLysArgArgLysAsnAsn180AsplieAlaMet195lieGinProlie210ArgI'leCysSer225ThrAlaAspValLysCysGinGin260CysAlaGlyTyr275GlyGlyProLeu290ValThrSerPhe305TyrAlaArgValMetHisLeuCysLeulieLeu245GinAla230GinPro215GlyGlu200Glu185MetMetProGluGluAlaGlyMet,CysGlyArg310ArgGin295GinGly280GluArg265ValPheThrGluPro325<210>11<211>30〈212〉腿<213>Unknown<220〉<223〉LINKER核苷酸序列〈400〉11ggcggtggaggctcaggcggtgggggttct〈210〉12〈211〉10〈212〉PRTLysValAsnGluAsnGinTrpGlyAlaGluAlaAspVal250AsnLeu235ProVal220[]eTyr205Phe190ThrAspTyrProProGlyTyrG]nGlyLeuLeuSerlieThrGluAspSerCysAsn270GlyAsn255MetSer240GluValAspSerGin285AsnA'snA:rgTrpLeuLeuAlaGlyCysAlaLeuTrp330Pro315lie300AsnArgProGlyGinSerPheleu335Val320His30<213〉Unknown〈220〉〈223〉LINKER氨基酸序列〈400〉12GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer1510<210>13<211>235<212>PRT<213>Unknown〈220〉〈223>牛肠激酶轻链突变体EKLm3氨基酸序列〈400〉13lieValGlyGlySerAspSerArgGluGlyAlaTrpProTrpValVal151015AlaLeuTyrPheAspAspGinGinValCysGlyA]aSerLeuValSer202530AspTrpLeuValSerAlaAlaHisCysValTyrGlyArgAsnMet354045GluProSerLysTrpLysAlaValLeuGlyLeuHisMetAlaSerAsn505560LeuThrSerProGinlieGluThrArgLeulieAspGinlieVallie65707580AsnProHisTyrAsnLysArgArgLysAsnAsnAsplieAlaMetMet859095HisLeuGluMetLysValAsnTyr'ThrAspTyrlieGinProlieCys100105110LeuProGluGluAsnGinValPheProProGlyArglieCysSerlie115120125AlaGlyTrpGlyAlaLeulieTyrGinGlySerThrAlaAspValLeuThrGluAsnG丄u155Val140LysMet170CysGinGl—yAspSerGlyGlyProGlyVal130135GinGluAlaAspValProLeuLeuSerAsn145150MetProGluTyrAsnlie165AlaGlyGlyValAspSe:r180185CysGinGluAsnAsnArgTrpLeuLeuAlaGlyVal195ArgGinCysAlaLeuProAsn210215ArgPheThrGluTrplieGinSer'PheLeuHis225230235〈210〉14〈211〉235〈212〉PRT<213>Unknown<220><223>牛肠激酶轻链突变体EKLm5氨基酸序列<400〉14CysGinCysAlaGlyLeu200ArgTyr220lieVal1AlaLeuArgAspGluPro50LeuThr65GlyGlyTyrTrp35SerPhe20LeuSerAsp5AspAspSerAr.gGluGinGinValSerAlaLysTrpLysSerProGinlie70Ala55GluAla40ValVal25HisGlyAla10CysG]yLeuGlyLeuThrArgLeulie75His60AspThr205AlaCysValTyrGly45MetPro190Ser'AlaSer!Leu30ArgGinGin160TyrGlu175LeuMetPheGlyArgValProTrpProTrpValVal15ValSerAsnMetAlaSerAsnGinlieVallie80LsnFroHisHisLeuGluLeuProAlaGly130GinGlu145MetProGlu115TrpAlaGluAlaGlyGlyCysGinGlu195CysTyrAsnLys85MetLysVal100GluAsnGinGlyAlaLeuAspVeilPro150TyrAsnlie165ValAspSer180AsnAsnArgAlaLeuProArgArgLysAsnAsnAspTleAla90AsnTyrVallie135LeuPhe120TyrThr105ProAspTyrlieGinProGlyArgGinGlySerLeuSerAsnThrGluAsnCysGinTrpThrGluTrplie230Asn215GinLeu200ArgGly185LeuMet170AspGlu155ValThr140LysI丄e125AlaPro110CysCysGinCysAlaGlySerGlyGlyAlaGlyValProGlyValSerPheLeuHis235TyrGin210ArgPhe225<210>15〈211>235〈212>PRT<213〉Unknown<220>〈223〉牛肠激酶轻链突变体EKLm7氨基酸序列<400〉15lieValGlyGlySerAspSerArgGluGlyAla1510AlaLeuTyrPheAspAspGinGinValCysGlyTyr220Thr205AlaPro190SerMetMet95lieCysSerlieAspValLeuGinGin160TyrGlu175LeuMetArgGlyArgValProTrpProTrpAlaSerLeuValVal15ValSerArgAspGluLeu65AsnPro50ThrTrp35Ser20LeuValSerAlaLysTrpLysSerProGinProHisTyrHisLeuGluLeuProAlaGin145MetGly130GluGlu115TrpMet100GluAsn85LysAlaAspValProGluTyrA,laGlyGlyCysGinTyrArg210PheGlu195CysVal180AsnAsn165AspArg25<210〉16〈211>235〈212〉PRTThrGluTrplie70LysPro150lielie230Ala55GluAsnGinVtilGlyAlaLeulie135LeuAlaLeuProAsn215GinAla40ValPhe120TyrAsnArgTrpLeu200Arg25HisValAsnTyrThr105ProSerCysGinGly185LeuCysValTyrl」euGlyLeuThrArgLeuArgArgLysAsn90AspI丄e75AsnLeuSerAsnThrGluAsnMet170Asp(;iu153ValSerPheleuH]'s60AspGinGlySerThr140l,ysAlaGlyValProGlyValTyr220His235Gly'45Met30ArgTyrlieGinProGlyArglie125AlaThr205AlaPro110CysCysAlaGlySerGlyGlyPro190SerAsnMetAlaSerAsnGin工leValAsplieAlaMet95lieCysGinGinTyr175Leulie80MetCysSerlieAspVtilL>euGin160GluMetPheGlyArgValPro<213〉Unknown〈220〉<223>牛肠激酶轻链突变体EKLm8氨基酸序列<400〉16GlyGlySerAspSerArgGluGlyAlaTrpProTrpValVal工leVal1AlaLeuArgAspGluPro50LeuThr65AsnProTyrTrp35SerPhe20Leu510AspAspGinGinVaJCysGlyAlaSerValSerAlaLysTrplysSerProGinHisTyrHisLeuGluLeuProAlaGly130GinGlu145MetProGlu115TrpMet100GluAsn85Lyslie70LysGluTyrAlaGlyGlyAsn165AspAla55GluAla40Va丄25HisCysValTyrLeuGlyLeuThrArgLeuArgArgLyslie75A'snHis60AspAsnGinValGlyAlaLeuAlaAspValPro150lielie135LeuPhe120Tyr'105ProProGlyArgGinGlySerLeuSerAsnThrGluAsnGlu155ValThr140LysVal._180185CysGinGluAsnAsnArgTrpLeuLeu195200Gly45MetAsn90ValAsnTyrThrAspTyr':[leGinlie125AlaAlaGlyVa丄Thr205Leu30ArgAsp工leAlaPro110CysMet170SerCysGinGlyAspSerGlyGlyPro190Ser.15ValGinlieValMet95lieCysAlaGlyTyr175LeuSerAsnMetAlaSerAsnlie80MetCysSerlieAspValLeuCysGinGinGin160GluMetArgGlyArgGinCysAlaLeuProAsnAr'gProGlyVa]Ty:rAlaArgValPro210215220ArgPheThrGluTrplieGlr)SerPheLeuH丄s22523023权利要求1.重组牛肠激酶轻链突变体，其氨基酸序列为SEQIDNO13、SEQIDNO14、SEQIDNO2、SEQIDNO15、SEQIDNO16之一。2.权利要求1所述的重组牛肠激酶轻链突变体，其氨基酸序列为SEQIDNO:2。3.—种DNA分子，编码权利要求1或2任一所述的氨基酸序列。4.一种表达载体，含有权利要求3所述的的DNA序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列。5.—种宿主细胞，被权利要求4所述的表达载体所转化。6.权利要求5所述的宿主细胞，可以为原核宿卞细胞或真核宿主细胞。7.权利要求6所述的宿主细胞，为毕赤酵母细胞。8.—种制备权利要求1或2所述的重组牛肠激酶轻链突变体的方法，包括a)提供一表达载体，该表达载体含有权利要求3所述的DNA序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列；b)用步骤a)所述的表达载体转化宿主细胞c)在适合的条件下培养步骤b)所得的宿主细胞；和d)分离纯化获得所述的重组牛肠激酶轻链突变体。9.一种重组牛肠激酶重链结构域轻链突变体融合蛋白，其中重链结构域和轻链突变体通过短肽相连接，轻链突变体的氨基酸序列为SHy.I.DNO:2、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16之一。10.权利要求9所述的重组牛肠激酶重链结构域-轻链突变体融合蛋白，其中轻链突变体的氨基酸序列为SEQIDNO:2。11.权利要求9所述的重组牛肠激酶重链结构域-轻链突变体融合蛋白，其中短肽的氨基酸序列为SEQIDNO:12。12.—种DM分子，编码权利要求11所述的短肽的核苷酸序列，为SEQIDNO:11。13.权利要求IO所述的重组牛肠激酶重链结构域-轻链突变体融合蛋白，其氨基酸序列为SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、IDNO:8、SEQIDNO:10之一。14.一种DNA分子，编码权利要求13所述的氨基酸序列，为SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9之一。15.权利要求13所述的重组牛肠激酶重链结构域-轻链突变体融合蛋白，其氨基酸序列为SEQIDNO:4。16.编码权利要求15所述的氨基酸序列的DNA分f，其核苷酸序列为SEQIDNO:3。17.—种表达载体，含有权利要求14所述的的DM序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列。18.—种宿主细胞，被权利要求17所述的表达载体所转化。19.权利要求18所述的宿主细胞，可以为原核宿主细胞。20.权利要求19所述的原核宿主细胞，为大肠杆菌。21.—种制备权利要求9、10、11、13、15任-所述的重组牛肠激酶重链结构域-轻链突变体融合蛋白的方法，包括a)提供一表达载体，该表达载体含有相应的DNA序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列；b)用歩骤a)所述的表达载体转化宿主细胞；c)在适合的条件下培养歩骤b)所得的宿主细胞；和d)分离纯化获得所述的重组牛肠激酶重链结构域-轻链突变体融合蛋白。22.权利要求21所述的方法，其中歩骤d)进一歩包括复性歩骤，其特征在于在复性缓冲液中添加PEG-8000和丙三醇。23.权利要求21所述的方法，其中歩骤d)屮使用STI亲和层析柱进行分离纯化。24.权利要求l、2、9、10、11、13、15任一所述的重组牛肠激酶轻链突变体、重组牛肠激酶重链结构域--轻链突变体融合蛋白作为融合蛋白切割剂的用途。全文摘要本发明公开了重组牛肠激酶轻链突变体和重组牛肠激酶重链结构域-轻链突变体融合蛋白，其中重链结构域和轻链突变体通过短肽相连接，本发明进一步公开了上述突变体和融合蛋白的氨基酸序列、其制备方法和其作为融合蛋白切割剂的用途。本发明公开的上述重组牛肠激酶轻链突变体和重组牛肠激酶重链结构域-轻链突变体融合蛋白可以通过简单的分离纯化步骤得到，具有活性高的优点。文档编号C12N15/63GK101386847SQ200810092899公开日2009年3月18日申请日期2008年5月6日优先权日2007年5月11日发明者盛侯,张大鹏,李博华,皓王,珉谈,郭亚军,钱卫珠申请人:上海张江生物技术有限公司;上海中信国健药业有限公司