专利名称：甘蔗蔗糖转运蛋白ShSUT4基因序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学中的基因领域，特别是关于甘蔗蔗糖转运 蛋白ShSUT4基因序列。
背景技术：
甘蔗是一种重要的糖料作物，同时也是一种高光效的C4植物， 其成熟茎节中积累高浓度蔗糖的机制已经成为了研究的热点。蔗糖是 甘蔗从源到库转运过程中的主要形式，蔗糖的转运一是通过共质体途 径，即通过胞间连丝在细胞间进行转运；二是通过质外体途径，即穿 过细胞壁和组织间的细胞间隙进行转运。转运方式的不同主要取决于 组织类型和发育时期。蔗糖在质外体和共质体间的转运需要质膜上的 蔗糖转运蛋白介导。因此，分离克隆甘蔗中蔗糖转运蛋白基因 进一步鉴定转运蛋白的功能，可为阐明甘蔗蔗糖的运输和 积累机制提供理论依据，另外还可为培育高蔗糖含量的甘蔗新品种提 供理论基础。发明内容本发明的目的是提供一种甘蔗蔗糖转运蛋白ShSUT4基因序列， 是通过以近源物种蔗糖转运蛋白基因的CDS序列的保守区设计简并 引物，并用PCR法扩增，结合RACE技术克隆甘蔗蔗糖转运蛋白 ShSUT4基因的全表达序列。其核苷酸如序列表中SEQ ID NO. 1所如序列表中SEQIDNO. 2所述。 本发明的目的是通过以下技术措施实现1、 总RNA的提取取新鲜的粤糖93-159甘蔗成熟茎杆的7-9茎节，使用Trizol试 剂，按照使用说明提取甘蔗总RNA。2、 d)NA第一链的合成甘蔗总RNA与反转录引物(oligo-dT接头引物)混合，进行反 转录。3、 引物设计依据，引物合成的方法从GenBank中下载近源物种(如玉米、水稻、大麦等)蔗糖转运 蛋白同源基因CDS序列，利用ClustalW软件进行多序列比对，确定 保守区，根据保守区序列设计引物，扩增片段大小约为560bp。引物 设计后交给上海生物工程生物公司合成。 引物序列为ShSUT4 F: 5， - TCAGGAAGCTTTCCTCT -3， ShSUT4 R: 5， -CGCTGTGGTATGACAATAG-3'4、 ShSUT4基因cDNA全序列的克隆以上述合成的第一链cDNA作为模板，用保守区序列设计引物进 行PCR扩增，所扩增的PCR产物用1.2%的琼脂糖凝胶进行检测，从 凝胶中纯化回收目的产物。然后将纯化的PCR产物克隆到pMD—18T 载体中，转化大肠杆菌DH5ci感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒 DNA。经酶切检测后，将具有插入片段的质粒DNA交给上海生物工程生物公司进行双向测序。根据已得到的cDNA片段序列设计特异性引物，利用cDNA末端快 速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA ends, RACE)对目的基 因的3'和5'末端进行PCR扩增。在3' RACE中，利用半巢式(semi-nested) PCR方法，首先由 外侧引物和接头引物进行PCR反应，所得产物利用内侧和接头引物再 进行PCR扩增。基因外侧引物5' -CTACAGAGAACGACCCAAGGAG-3 ，基因内侧引物5， -ATGGCCCTGGAAACATACTTG-3'接头引物5' -GGCCACGCGACTAGTAC-3'在5， RACE中，利用末端转移酶和dATP在cDNA末端加上poly (A)尾后，以加尾后的cDNA作为模板，利用外侧特异性引物和 OligodT进行第一次PCR扩增，所得PCR产物再利用内侧引物和 OligodT进行第二次PCR扩增。基因外侧引物5， -CAACAGAGGTGAATCCAAGGACGAC -3，基因内侧引物5， -GCTCTTGCACGGATGCTACAG-3'Oligo-dG: 5， -GGGGGGGGGGGGGGGH—3' 所得到的PCR产物在1.2%的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测 后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD— 18T载体中，转化大肠杆菌DH5 a 感受态细胞，挑取阳性克隆，交给上海生物工程生物公司进行双向测 序，测序所得序列再与保守区序列设计引物扩增所得的序列利用 Clustal W软件进行拼接。5、对甘蔗蔗糖转运蛋白ShSUT4基因的测定 将拼接结果用BLAST软件进行同源性测定，以确定为甘蔗蔗糖转 运蛋白ShSUT4同源序列。比对结果<image>image see original document page 6</image>本发明的优点甘蔗(&cc/zarwm q^c/waram L.)生长于热带和亚 热带地区，是人类最早利用的C4光合途径的高光效植物。蔗糖是甘 蔗光合作用的主要产物之一，也是甘蔗体内光合产物运输、分配及其 储存主要形式。植株源器官中合成的蔗糖，除了少量被用于满足自身 生长发育的需求外，大部分装载到韧皮部的筛管伴胞复合体(sieve element companion cell complex, SECCC)中，经长距离运输而转运和 分配到根、茎、嫩叶、花、种子等库器官。蔗糖在植株体中定向运输 和分配的方式不仅调控植物的整个生长和发育进程(包括相关的生理 过程、生化代谢途径和基因表达等)，同时，也决定了作物经济器官 的产量和品质。在蔗糖从"源"到"库"的转运过程中，蔗糖载体蛋 白(Sucrose Transporter, SUT)起至关重要的调节作用。因此该基因的 获得，不仅有利于揭示甘蔗中蔗糖积累的机制，还可以为作物产量和 品质的遗传改良提供参考。
具体实施方式
下面对本发明作进一步说明。1、总RNA的提取取0.1克新鲜甘蔗7-9节茎(从生长点向下数)，削成片状，于 液氮中研磨成粉末；加入lmL Trizol (Gibco， Japan)，按照试剂盒 使用说明提取总RNA。 2、 cDNA第一链的合成取甘蔗总RNA 5iig与反转录引物(oligo—dT接头引物)luL (10pmol/L)混合，70。C加热5min后，立即放置冰上，然后加入5 X buffer, 2.5mmol/L dNTP混合液，Ribonuclease Inhibitor, M-MLV 反转录酶，反应体系为25 u L。反应过程为42°C 60min， 70°C 15min， 最后放入一8(TC保存备用。3、 引物设计依据，引物合成的方法从GenBank中下载近源物种(如玉米、水稻、大麦等)蔗糖转 运蛋白同源基因CDS序列，利用ClustalW软件进行多序列比对，确 定保守区，根据保守区序列设计引物，扩增片段大小约为560bp。引 物设计后交给上海生物工程生物公司合成。 引物序列为ShSUT4 F: 5，- TCAGGAAGCTTTCCTCT画3' ShSUT4 R: 5 ，隱CGCTGTGGTATGACAATAG陽3'4、 甘蔗SUT4基因全序列的克隆以上述合成的第一链cDNA作为模板，用保守引物进行PCR扩 增，反应体系为10XPCR反应缓冲液5iiL， 25mmol/LMgCl23uL，2.5mmol/L dNTP 2 u L， 10nmol/L引物ShSUT4 F和ShSUT4 R各2 UL， Taq酶1.25U，用PCR水将反应体系补充至50 ti L。反应条件 为1个循环，94"变性3 min; 30个循环，94。C变性45s， 56°〇退 火45s， 72"延伸45s; 1个循环，72。C延伸10min; 4。C保温。所扩 增的PCR产物用1.2%的琼脂糖凝胶进行检测，从凝胶中纯化回收目 的产物。然后将纯化的PCR产物克隆到pMD—18T载体中，转化大 肠杆菌DH5感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒DNA。经酶切检 测后，将具有插入片段的质粒DNA交上海生物工程生物公司进行双 向测序。根据己得到的cDNA片段序列设计特异性引物，禾,cDNA末 端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA ends, RACE)对目的 基因的3'和5'末端进行PCR扩增。在3，RACE中，利用半巢式(semi-nested) PCR方法，首先由外 侧引物和接头引物进行PCR反应，所得产物稀释50倍后，取1 u L 作为模板，利用内侧和接头引物再进行PCR扩增。反应体系为10xPCR反应缓冲液5|iL， 25mmol/L MgCl2 3)iL， 2.5mmol/LdNTP2jiL， 10nmol/L正反向引物各2|iL， Taq酶1.2U，用 PCR水将反应体系补充至50pL。反应条件为1个循环，9fC变性5min; 35个循环，94。C变性 45s， 55。C退火30s， 72。C延伸lmin; 1个循环，72。C延伸7min; 4°C 保温。基因外侧引物5，-CTACAGAGAACGACCCAAGGAG-3，基因内侧引物5 ， -ATGGCCCTGGAAACATACTTG-3 ， 接头引物5'-GGCCACGCGACTAGTAC隱3， 在5'RACE中，利用末端转移酶和dATP在cDNA末端加上poly (A)尾后，以加尾后的cDNA作为模板，利用外侧特异性引物和 OligodT进行第一次PCR扩增，所得PCR产物取1 U L作为模板，再 利用内侧引物和OligodT进行第二次PCR扩增。反应体系及反应条 件同3'RACE 。基因外侧引物5，-CAACAGAGGTGAATCCAAGGACGAC -3， 基因内侧引物5，-GCTCTTGCACGGATGCTACAG-3， Oligo-dG: 5'-GGGGGGGGGGGGGGGH-3，所得到的PCR产物在1.2%的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测 后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD—18T载体中，转化大肠杆菌 DH5a感受态细胞，挑取阳性克隆，交上海生物工程生物公司进行双 向测序，测序所得序列再与保守区引物扩增所得的序列利用Clustal W 软件进行拼接。5、对甘蔗蔗糖转运蛋白ShSUT4基因的测定 将拼接结果用BLAST软件进行同源性测定，以确定为甘蔗蔗糖 转运蛋白ShSUT4同源序列。比对结果Sequences producing significant alignments:(C丄ick:丄eadet:s t。 j。rt columns) —l)f>>srri|、1mn "Villi"- l(JCMlt虽&250884%O.CI 95%巧OS250S84%0.0 : 95%巡6152676%0,0 ; 867。152676%0.0 86%-,:149376%0,0 85%144:3 1—13S1443 113876%U,U 03 /。 0.0 85% 0.0 ; Sl%7.02 ..Q. .1345 134567% 67%o.o 91% 0,0 91%41614%2e-112 : 93%Links朋叫1HZ^^AP,21S.:EF5764S0,1Zea mavs sucrose transporter SLIT4 mRNA画complete cds Zea ni3YS sucrose transport protein (SUT2) mR濕，complete cds On/2a sat卜,a Indi':a Group SUT2M (SLH7M) niRNA, complete cds Orrza sat卜,a Japonica Gr卿cDMA clone:001-;L27-C09, full insert seq Op/za sativa J咖mca Gr, OsSUT2 mRNA for sucrose transporter,( Orv2a ("oonic3 cultiv3r-qrou口) Osl2QCi641棚(Osl2q064140[C'rvza sativa Ja口omca Gr, cDNA cicne.;J013093C04, full insert sequ Hordeum vul。are mRNA for sucrose transporter 2: (su!:2 qene) Orvza sativa "ap。nica cultivar-qrou口) genomic DNA, chr-omosorr,e 12 On/za s3ti、'3 chromosome 12, , PAC P0243AM of chromosome 12 of Zea mavs PCO07D951 mRNA se叫enceOn a sativa (indica cultivar-qr,) clone OSS-289-384-D8 sucrose trISHi GB序列表<i io>中国热带农业科学院热带生物技术研究所<120>甘蔗蔗糖转运蛋白ShSUT4基因序列<160>2<210>1<211>1861<212>RNA<213>甘蔗(iSflcc/zar應q^"'war簡L.) <220><221>3'UTP <222>(1556).,, (1861) <220><221>5'UTP <222>(1)... (47) <220> <221>CDS <222>(47)…(1555) <220><221>PolyAsite <222>(1846)…(1861) <400>1Caaaatcaaa caactcagcg attcgattag cggcgcgtga agcggg46atg ccg tcg cgc acg get ccg gcg gcg acc ccg ccc ccg ccg egg 92 Met Pro Ser Arg Thr Ala Pro Ala Ala Thr Pro Pro Pro Pro Arg 1 6 11aag gtg ccc etc egg aag ctg ctg cgt gcg gcg tcg gtc gcc tgc 137Lys Val Pro Leu Arg Lys Leu Leu Arg Ala Ala Ser Val Ala Cys 16 21 26ggg gtg cag ttc ggc tgg gcg ctg cag ctg teg ctg ctg acc ccg 182 Gly Val Gin Phe Gly Trp Ala Leu Gin Leu Ser Leu Leu Thr Pro 31 36 41tac gtg cag gag ctg ggc ate ccg cac gcc ttc gcc age etc gtc 227 Tyr Val Gin Glu Leu Gly lie Pro His Ala Phe Ala Ser Leu Val 46 51 56tgg ctg tgc ggc ccg ctg teg ggc etc etc gtt cag ccc etc gtc 272 Trp Leu Cys Gly Pro Leu Ser Gly Leu Leu Val Gin Pro Leu Val 61 66 71ggc cac etc tec gac cgc ate ggc ccc gcc gcc teg ccg etc ggg 317 Gly His Leu Ser Asn Arg lie Gly Pro Ala Ala Ser Pro Leu Gly 76 81 86cgc cgc agg ccc ttc ate gcc gcc ggc gcc gcg tec ate gca gca 362 Arg Arg Arg 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Gly Ser Ser Phe lie Gly Gly Leu Val AlaGly Leu Pro Arg Ala Arg lie Ala Ser Ser Ser Leu ArgGly Gly Thr His Arg *296 Asn 311 Ser 326 Val 341 Trp 356 Leu 371 Gly 386 Thr 401 Ala 416 Leu 431 lie 446 Gly 461 Gly 476 Ser 49权利要求
1. 一种甘蔗蔗糖转运蛋白ShSUT4基因序列，其特征在于其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所述。
2、 一种甘蔗蔗糖转运蛋白ShSUT4基因序列，其特征在于 其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 2所述。
全文摘要
本发明公开了一种甘蔗蔗糖转运蛋白ShSUT4基因序列，是以近源物种蔗糖转运蛋白基因的CDS序列的保守区设计简并引物，从甘蔗成熟茎节提取总RNA，用PCR法扩增，结合RACE技术克隆到甘蔗蔗糖转运蛋白(ShSUT4)基因的全表达序列。本发明不仅为研究甘蔗蔗糖转运蛋白在蔗糖运输中的作用，进一步探讨蔗糖的积累机理奠定基础，而且通过氨基酸序列可以获得具有生物活性的纯化蛋白，为研究蔗糖转运蛋白的结构与功能提供基础。
文档编号C12N15/29GK101280311SQ20081009982
公开日2008年10月8日 申请日期2008年5月22日 优先权日2008年5月22日
发明者张树珍, 杨本鹏, 王俊刚, 蔡文伟 申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所