在微生物中生产油的制作方法

在微生物中生产油的制作方法
【专利摘要】本发明提供了用于在微生物中生产油、燃料、油类化学品和其他化合物的方法和组合物。具体地，本发明提供了带油的微生物以及这类微生物的低成本培养方法。本发明还提供了含有外源基因的微生物细胞，所述外源基因编码例如脂肪酶、蔗糖转运蛋白、蔗糖转化酶、果糖激酶、多糖降解酶、脂肪酰基-ACP硫酯酶、脂肪酰基-CoA/醛还原酶、脂肪酰基-CoA还原酶、脂肪醛还原酶、脂肪醛脱羰基酶和/或酰基载体蛋白。本发明还包含制‘造运输燃料例如可再生柴油、生物柴油和可再生：喷气式发动机燃料的方法。■I
【专利说明】在微生物中生产油
[0001] 本申请是申请日为2008年6月2日、发明名称为"在微生物中生产油"的中国专 利申请200880100976. 9 (国际申请号PCT/US2008/065563)的分案申请。
[0002] 与相关申请交叉引用
[0003] 本申请要求以下美国临时专利申请的优先权：2007年6月1日提交的 No:60/941, 581 ;2007 年 7 月 10 日提交的 No:60/959, 174 ;2007 年 8 月 27 日提交的 N〇:60/968,291 ;和2008年1月28日提交的N〇:61/024,069,所述临时专利申请的公开内 容为了所有目的整体并入本文作为参考。 发明领域
[0004] 本公开涉及油、燃料的生产，和由微生物制成的油类化学品（oleochemicals)。具 体地，本公开涉及带油的微生物，包括微藻、酵母和真菌，并且涉及培养这类微生物的方法， 所述微生物用于生产在工业中使用或者用作能量或食物来源的有用化合物，包括脂质、月旨 肪酸酯、脂肪酸、醛、醇和烷烃。本发明的微生物可以被选择或遗传改造，以适用于本文所述 的本发明方法或其他方面。
[0005] 发明背景
[0006] 化石燃料是埋藏的有机材料的可燃性地质沉积物的通用术语，其由腐朽的植物和 动物形成，所述腐朽的植物和动物通过在数亿年间暴露于地壳中的热和压力而被转化为原 油、煤、天然气或重油。
[0007] 在通常的对话中，化石燃料（也称作矿物燃料）与其他含烃的自然资源例如煤、油 和天然气作为同义词使用。化石燃料的利用使得能够进行大规模的工业发展并大幅取代水 驱动的磨，以及燃烧木头或泥炭用于取暖。化石燃料是有限的、不可再生的资源。
[0008] 发电时，通常使用来自化石燃料燃烧的能量驱动涡轮。较早的世代通常使用燃料 燃烧产生的蒸汽使涡轮旋转，但是在较新的发电厂中，通过燃料燃烧产生的气体直接转动 燃气涡轮（gas turbine)。随着20世纪和21世纪的全球现代化，对来自化石燃料（特别是 得自油的汽油）的能量的渴求是主要的地区冲突和全球冲突的原因之一。
[0009] 人类对化石燃料的燃烧是二氧化碳排放的最大来源，二氧化碳是允许辐射强迫 (radiative forcing)并促进全球变暖的温室气体之一。在美国，多于90%的温室气体排 放来自于化石燃料的燃烧。另外，产生了其他气体污染物，例如一氧化氮、二氧化硫、挥发性 有机化合物（VOC)和重金属。
[0010] 人类活动主要通过从化石燃料燃烧释放二氧化碳提高温室气体水平，但是其他气 体例如甲烷不能忽略。由于人类活动，例如导致更高二氧化碳浓度的化石燃料燃烧和滥伐， 若干种温室气体的浓度随时间提高。根据全球变暖的假说，来自工业和农业的温室气体在 最近观察到的全球变暖中起主要作用。
[0011] 全球经济造成的增加的能量需求也为碳氢化合物的成本带来递增的压力。除能量 以外，包括塑料和化学品制造商在内的许多工业严重依赖于碳氢化合物作为制造过程原料 的可用性。对目前供应来源的成本划算的替代方式能够帮助缓和对能量和这些原料成本的 增加的压力。
[0012] 发明概述
[0013] 在一个方面中，本发明提供了微生物，所述微生物在多个实施方案中可包括含有 外源基因的微藻细胞，产油酵母（oleaginous yeast)，或真菌，所述外源基因编码选自以 下的蛋白质：脂肪酶、蔗糖转运蛋白、蔗糖转化酶、果糖激酶、多糖降解酶、脂肪酰基-ACP硫 酯酶、脂肪酰基-CoA/醛还原酶、脂肪酰基-CoA还原酶、脂肪醛还原酶、脂肪醛脱羰基酶 和酰基载体蛋白（ACP)。微生物（例如微藻细胞）可例如选自表1。在具体的实施方案 中，细胞是小球藻属（Chlorella)的物种，例如Chlorella fusca、原壳小球藻（Chlorella protothecoides)、蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa)、Chlorella kessleri、小 球藻(Chlorella vulgaris) > Chlorella saccharophila> Chlorella sorokiniana 或 椭圆小球藻（Chlorella ellipsoidea)。在一些实施方案中，微生物是选自弯曲隐球 菌(Cryptococcus curvatus) > Cryptococcus terricolus、假丝酵母(Candida sp.)、 油脂酵母（Lipomyces starkeyi)、产油油脂酵母（Lipomyces lipofer)、Endomycopsis vernalis、红酵母（Rhodotorula glutinis)、瘦弱红酵母（Rhodotorula gracilis)和解 脂亚罗酵母（Yarrowia Iipolytica)的产油酵母。还在其他实施方案中，微生物是选自 以下的真菌：被孢霉属（Mortierella)的物种，葡酒色被孢霉（Mortierrla vinacea)、高 山被抱霉（Mortierella alpine))、德巴利腐霉（Pythium debaryanum)、卷枝毛霉（Mucor circinelloides)、赫曲霉（Aspergillus ochraceus)、土曲霉（Aspergillus terreus)、薄 青霉（Pennicillium iilacinum)、Hensenulo 属的物种、毛壳（Chaetomium)属的物种、枝 孢（Cladosporium)属的物种、畸枝霉属（Malbranchea)属的物种、根霉（Rhizopus)属的 物种和腐霉（Pythium)属的物种。在其他实施方案中，本发明包括烃修饰酶在细菌宿主例 如大肠杆菌（E. Coli)中的表达，和生产可再生柴油的Bacilla方法。在一个实施方案中， 所述方法包括（a)在存在固定的碳源时培养微生物群体，其中（i)微生物将其干细胞重量 的至少10%作为脂质累积，和（ii)所述固定的碳源选自甘油、解聚合的纤维素材料、蔗糖、 糖蜜、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、果糖、阿拉伯糖、甘露糖、乙酸盐及前述的任一组合， (b)从培养的微生物中分离脂质组分，和（c)对分离的脂质组分进行一个或多个化学反应， 产生直链烷烃，从而产生可再生的柴油。
[0014] 在另一方面中，本发明涉及根据上文所述方法制造的液态烃组合物，其中所述组 合物符合ASTM D975规范。
[0015] 在另一方面中，本发明涉及生产喷气式发动机燃料（jet fuel)的方法。在一个实 施方案中，所述方法包括（a)在存在固定的碳源时培养微生物群体，其中（i)所述微生物将 其干细胞重量的至少10%作为脂质累积，和（ii)所述固定的碳源选自甘油、解聚合的纤维 素材料、蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、果糖、阿拉伯糖、甘露糖、乙酸盐及前述的任 一组合，（b)从培养的微生物中分离脂质组分，（c)对分离的脂质组分进行一个或多个化学 反应，产生直链烷烃，（d)裂化所述直链烷烃从而产生喷气式发动机燃料。
[0016] 在另一方面中，本发明涉及根据上文所述方法产生的液态烃组合物，其中所述组 合物符合ASTM D1655规范。
[0017] 在另一方面中，本发明涉及微藻或酵母细胞，所述微藻或酵母细胞已被遗传改造 和/或选择，从而与相同物种的野生型细胞相比以改变的水平表达脂质途径酶。在一些情 况下，当两种细胞均在相同条件下生长时，与野生型细胞相比所述细胞产生更多脂质。在一 些情况下，细胞已被遗传改造和/或选择，从而与野生型细胞相比以更高的水平表达脂质 途径酶。在一些情况下，脂质途径酶选自丙酮酸脱氢酶、乙酰-CoA羧化酶、酰基载体蛋白和 甘油-3磷酸酯酰基转移酶。在一些情况下，细胞已被遗传改造和/或选择为以低于野生型 细胞的水平表达脂质途径酶。在其中细胞以更低水平表达脂质途径酶的至少一个实施方案 中，脂质途径酶包括柠檬酸合酶。
[0018] 在一些实施方案中，上文所述微藻或酵母细胞已被遗传改造和/或选择为与野生 型细胞相比以改变的水平表达脂肪酸合成的总体调节子，从而与野生型细胞相比改变了多 种脂肪酸合成基因的表达水平。在一些情况下，脂质途径酶包括修饰脂肪酸的酶。在一些 情况下，脂质途径酶选自硬脂酰-ACP去饱和酶和甘油脂去饱和酶。
[0019] 在另一方面中，本发明涉及含有一种或多种外源基因的产油微生物，其中所述外 源基因编码选自以下的蛋白质：脂肪酰基-ACP硫酯酶、脂肪酰基-CoA还原酶、脂肪醛还 原酶、脂肪酰基-CoA/醛还原酶、脂肪醛脱羰基酶和酰基载体蛋白。在一些情况下，微生物 是原壳小球藻、微小小球藻（Chlorella minutissima)、Chlorella emersonii、Chlorella sorokiniana、椭圆小球藻或小球藻属物种（Chlorella sp.)。在其他情况下，微生物是本 文所述的另一物种。在一个实施方案中，外源基因与启动子处于有效连接中，所述启动子是 应答刺激可诱导型或阻抑型。在一些情况下，刺激选自外源提供的小分子、热、冷和光。在 一些情况下，外源基因在细胞区室中表达。在一些实施方案中，细胞区室选自叶绿体和线粒 体。
[0020] 在一个实施方案中，外源基因编码脂肪酸酰基-ACP硫酯酶。在一些情况下，外源 基因编码的硫酯酶催化从酰基载体蛋白（ACP)上切割8-18碳脂肪酸。在一些情况下，外源 基因编码的硫酯酶催化从ACP上切割10到14碳脂肪酸。在一个实施方案中，外源基因编 码的硫酯酶催化从ACP上切割12-碳脂肪酸。
[0021] 在一个实施方案中，外源基因编码脂肪酰基-CoA/醛还原酶。在一些情况下，外源 基因编码的还原酶催化20到30-碳脂肪酰基-CoA还原成为相应的伯醇。在一些情况下， 外源基因编码的还原酶催化8到18-碳脂肪酰基-CoA还原成为相应的伯醇。在一些情况 下，外源基因编码的还原酶催化10到14-碳脂肪酰基-CoA还原成为相应的伯醇。在一个 实施方案中，外源基因编码的还原酶催化12-碳脂肪酰基-CoA还原成为十二烷醇。
[0022] 在一个实施方案中，外源基因编码脂肪酰基-CoA还原酶。在一些情况下，外源基 因编码的还原酶催化8到18-碳脂肪酰基-CoA还原成为相应的醛。在一个实施方案中，夕卜 源基因编码的还原酶催化12-碳脂肪酰基-CoA还原成为十二醛。
[0023] 在至少一个实施方案中，本发明的微生物还含有一种或多种外源的蔗糖利用基 因。
[0024] 在另一方面中，本发明涉及含有两种外源基因的微生物，其中第一外源基因编码 脂肪酰基-ACP硫酯酶，第二外源基因编码选自以下的蛋白质：脂肪酰基-CoA还原酶、脂肪 酰基-CoA/醒还原酶和酰基载体蛋白。在一些情况下，微生物是微小小球藻、Chlorella emersonii、Chlorella sorokiniana、椭圆小球藻、小球藻属物种或原壳小球藻。在其他情 况下，微生物是本文所述的另一物种。在一些情况下，两个外源基因各自处于与启动子的有 效连接中，所述启动子是应答刺激可诱导的。在一些情况下，各个启动子是应答相同刺激可 诱导的。
[0025] 在一个实施方案中，第一外源基因编码的硫酯酶催化从ACP上切割8到18-碳脂 肪酸。在一些实施方案中，第二外源基因编码脂肪酰基-CoA/醛还原酶，所述酶催化8到 18-碳脂肪酰基-CoA还原成为相应的伯醇。在一些情况下，第一外源基因编码的硫酯酶催 化从ACP上切割10到14-碳脂肪酸，第二外源基因编码的还原酶催化10到14-碳脂肪酰 基-CoA还原成为相应的伯醇，其中所述硫酯酶和还原酶作用于相同的碳链长度。在一个实 施方案中，第一外源基因编码的硫酯酶催化从ACP上切割12-碳脂肪酸，第二外源基因编码 的还原酶催化12-碳脂肪酰基-CoA还原成为十二烷醇。在一些实施方案中，第二外源基因 编码脂肪酰基-CoA还原酶，所述酶催化8到18-碳脂肪酰基-CoA还原成为相应的醛。
[0026] 在一些实施方案中，第二外源基因编码脂肪酰基-CoA还原酶，并且微生物还含有 编码脂肪醛脱羰基酶的第三外源基因。在一些情况下，第一外源基因编码的硫酯酶催化从 ACP上切割8-18碳脂肪酸，第二外源基因编码的还原酶催化8到18-碳脂肪酰基-CoA还原 成为相应的脂肪醛，并且第三外源基因编码的脱羰基酶催化8到18-碳脂肪醛转化成为相 应的烷，其中所述硫酯酶、还原酶和脱羰基酶作用于相同的碳链长度。
[0027] 在一些实施方案中，第二外源基因编码天然地与脂肪酰基-ACP硫酯酶共表达的 酰基载体蛋白。
[0028] 在一些实施方案中，第二外源基因编码酰基载体蛋白，并且微生物还含有编码选 自脂肪酰基-CoA还原酶和脂肪酰基-CoA/醛还原酶的蛋白质的第三外源基因。在一些情 况下，第三外源基因编码脂肪酰基-CoA还原酶，并且所述微生物还含有编码脂肪醛脱羰基 酶的第四外源基因。
[0029] 在另一方面中，本发明涉及在微生物群体中生产分子的方法。在一个实施方案中， 该方法包括在培养基中培养微生物群体，其中所述微生物含有（i)编码脂肪酰基-ACP硫酯 酶的第一外源基因，和（ii)编码脂肪酰基-CoA/醛还原酶的第二外源基因，并且微生物合 成与酰基载体蛋白（ACP)连接的脂肪酸，脂肪酰基-ACP硫酯酶催化从ACP上切割脂肪酸， 通过进一步加工得到脂肪酰基-CoA，并且脂肪酰基-CoA/醛还原酶催化酰基-CoA还原成为 醇。
[0030] 在微生物群体中生产分子的方法的一个实施方案中，微生物是微小小球藻、 Chlorella emersonii、Chlorella sorokiniana、捕圆小球藻、小球藻属物种或原壳小球 藻。在其他情况下，微生物是本文所述的微生物的另一物种。在一些情况下，培养基含有甘 油。在一些情况下，甘油是酯交换过程的副产物。在一些情况下，培养基含有甘油和至少一 种其他的固定碳源。在一个实施方案中，至少一种其他的固定碳源是蔗糖。在一些情况下， 在发酵开始时对微生物提供所有的甘油和所有的至少一种其他的固定碳源。在一些情况 下，在发酵过程中以预定的速率对微生物饲喂甘油和至少一种其他的固定碳源。在本发明 的一些培养方法中，在不存在至少一种其他的固定碳源时，在第一段时间中对微生物提供 甘油，在第一段时间结束时提供至少一种其他的固定碳源，并且在存在至少一种其他的固 定碳源时将微生物培养第二段时间。
[0031] 在一些实施方案中，外源基因与启动子有效连接，所述启动子是应答第一刺激可 诱导的。在一些情况下，该方法还包括提供第一刺激，并且在存在第一刺激时将微生物群体 孵育第一段时间以产生醇。在一些情况下，该方法还包括从包含培养基和微生物的水性生 物量中提取醇。
[0032] 在一些实施方案中，第一外源基因编码的硫酯酶催化从ACP上切割8到18-碳脂 肪酸，并且第二外源基因编码的还原酶催化8到18-碳脂肪酰基-CoA还原成为相应的伯 醇，其中所述硫酯酶和还原酶作用于相同的碳链长度。在一些情况下，第一外源基因编码的 硫酯酶催化从ACP上切割10到14-碳脂肪酸，并且第二外源基因编码的还原酶催化10到 14碳脂肪酰基-CoA还原成为相应的伯醇，其中所述硫酯酶和还原酶作用于相同的碳链长 度。在一个实施方案中，第一外源基因编码的硫酯酶催化从ACP上切割12-碳脂肪酸，并且 第二外源基因编码的还原酶催化12-碳脂肪酰基-CoA还原成为十二烷醇。在一些情况下， 微生物还含有编码酰基载体蛋白的第三外源基因。在一些实施方案中，第三外源基因编码 与脂肪酰基-ACP硫酯酶天然共表达的酰基载体蛋白。
[0033] 在另一方面中，本发明涉及在微生物群体中生产脂质分子的方法。在一个实施方 案中，该方法包括在培养基中培养微生物群体，其中微生物含有（i)编码脂肪酰基-ACP硫 酯酶的第一外源基因，和（ii)编码脂肪酰基-CoA还原酶的第二外源基因，并且其中微生物 合成与酰基载体蛋白（ACP)连接的脂肪酸，脂肪酰基-ACP硫酯酶催化从ACP上切割脂肪 酸，通过进一步加工得到脂肪酰基-CoA，并且脂肪酰基-CoA还原酶催化酰基-CoA还原成为 醒。在一些情况下，微生物是微小小球藻、Chlorella emersonii、Chlorella sorokiniana、 椭圆小球藻、小球藻属物种或原壳小球藻。在其他情况下，微生物是本文所述的另一微生物 物种。
[0034] 在一些实施方案中，外源基因与启动子有效连接，所述启动子是应答第一刺激可 诱导的，并且该方法还包括提供第一刺激，并在存在第一刺激时将微生物群体孵育第一段 时间以产生醛。在一个实施方案中，该方法还包括从包含培养基和微生物群体的水性生物 量中提取醛。
[0035] 在一些实施方案中，第一外源基因编码的硫酯酶催化从ACP上切割8到18-碳脂 肪酸，并且第二外源基因编码的还原酶催化8到18-碳脂肪酰基-CoA还原成为相应的醛， 其中所述硫酯酶和还原酶作用于相同的碳链长度。在一些情况下，微生物还含有编码脂肪 醛脱羰基酶的第三外源基因，所述脂肪醛脱羰基酶催化醛转化成为烷烃。
[0036] 在一些情况下，外源基因与启动子有效连接，所述启动子是应答第一刺激可诱导 的，并且该方法还包括提供第一刺激，并在存在第一刺激时将微生物群体孵育第一段时间 以产生烷。在一些情况下，该方法还包括从包含培养基和微生物群体的水性生物量中提取 烧。
[0037] 在一些情况下，第一外源基因编码的硫酯酶催化从ACP上切割8到18-碳脂肪酸， 第二外源基因编码的还原酶催化8到18-碳脂肪酰基-CoA还原成为相应的醛，并且第三外 源基因编码的脱羰基酶催化8到18-碳醛转化成为相应的烷，其中所述硫酯酶、还原酶和脱 羰基酶作用于相同的碳链长度。在一些实施方案中，微生物还含有编码酰基载体蛋白的第 三外源基因。在一些情况下，第三外源基因编码天然地与脂肪酰基-ACP硫酯酶共表达的酰 基载体蛋白。在一些情况下，微生物还含有编码脂肪醛脱羰基酶的第四外源基因，所述脂肪 醛脱羰基酶催化醛转化成为烷。
[0038] 在一些方法中，培养基含有甘油。在一个实施方案中，甘油是酯交换过程的副产 物。在一些情况下，培养基含有甘油和至少一种其他的固定碳源。在一个实施方案中，至少 一种其他的固定碳源是蔗糖。在一些情况下，在发酵开始时对微生物提供所有的甘油和所 有的至少一种其他的固定碳源。在一些情况下，在发酵过程中以预定的速率对微生物饲喂 甘油和至少一种其他的固定碳源。在一个实施方案中，在不存在至少一种其他的固定碳源 时，在第一段时间中对微生物提供甘油，在第一段时间结束时提供至少一种其他的固定碳 源，并且在存在至少一种其他的固定碳源时将微生物培养第二段时间。
[0039] 在另一方面中，本发明涉及在微生物群体中生产具有特定碳链长度的脂肪酸分子 的方法。在一个实施方案中，该方法包括在培养基中培养生产脂质的微生物群体，其中微 生物含有编码脂肪酰基-ACP硫酯酶的外源基因，所述酶具有对碳链长度特异的活性，并且 其中微生物合成与酰基载体蛋白（ACP)连接的脂肪酸，并且当脂肪酸被合成至特定的碳链 长度时硫酯酶催化从ACP上切割脂肪酸。在一些情况下，微生物是微小小球藻、Chlorella emersonii、Chlorella sorokiniana、椭圆小球藻、小球藻属物种或原壳小球藻。在其他情 况下，微生物是本文所述的其他微生物物种。
[0040] 在一些实施方案中，外源基因与启动子有效连接，所述启动子是应答第一刺激可 诱导的，并且该方法还包括提供第一刺激，并在存在第一刺激时将微生物群体孵育一段时 间。在一些情况下，该方法还包括从包含培养基和微生物群体的水性生物量中提取脂肪酸。
[0041] 在一些情况下，微生物还含有编码酰基载体蛋白的第二外源基因。在一些实施方 案中，第二外源基因编码天然地与脂肪酰基-ACP硫酯酶共表达的酰基载体蛋白。在一个实 施方案中，酰基-ACP硫酯酶催化从ACP上切割8到18-碳脂肪酸。
[0042] 在一些情况下，培养基含有甘油。在一个实施方案中，甘油是酯交换过程的副产 物。在一些实施方案中，培养基含有甘油和至少一种其他的固定碳源。在一个实施方案中， 至少一种其他的固定碳源是蔗糖。在一些情况下，在发酵开始时对微生物提供所有的甘油 和所有的至少一种其他的固定碳源。在一些情况下，在发酵过程中以预定的速率对微生物 饲喂甘油和至少一种其他的固定碳源。在一个实施方案中，在不存在至少一种其他的固定 碳源时，在第一段时间中对微生物提供甘油，在第一段时间结束时提供至少一种其他的固 定碳源，并且在存在至少一种其他的固定碳源时将微生物培养第二段时间。
[0043] 在另一方面中，本发明涉及含有外源基因的微藻细胞，其中外源基因编码选自以 下的蛋白质：脂肪酶、蔗糖转运蛋白、蔗糖转化酶、果糖激酶或多糖降解酶。在一些情况下， 细胞是微小小球藻、Chlorella emersonii、Chlorella sorokiniana、捕圆小球藻、小球藻 属物种或原壳小球藻。在其他情况下，微生物是本文所述的另一微藻物种。
[0044] 在一些情况下，外源基因与启动子有效连接。在一些情况下，启动子是应答刺激的 诱导型或阻抑型启动子。在多种实施方案中，刺激选自外源提供的小分子、热、冷和光。在 一些情况下，外源基因在细胞区室中表达。在一些实施方案中，细胞区室选自叶绿体和线粒 体。
[0045] 在一些情况下，基因编码与选自表9的脂肪酶具有至少70%氨基酸同一性的脂肪 酶。在一个实施方案中，脂肪酶是novozym-435。在一个实施方案中，多糖降解酶对小球藻 病毒而言是内源的。
[0046] 在另一方面中，本发明涉及含有两个外源基因的微藻细胞，其中第一外源基因编 码脂肪酶，第二外源基因编码多糖降解酶。在一些情况下，外源基因各自与启动子有效连 接。在一些情况下，外源基因各自与启动子有效连接，所述启动子是应答刺激的诱导型启动 子。在一些情况下，外源基因各自与启动子有效连接，所述启动子是应答相同刺激的诱导型 启动子。在一些情况下，外源基因各自与启动子有效连接，所述启动子是应答至少一种刺激 诱导型启动子，所述刺激不诱导另一种启动子。
[0047] 在另一方面中，本发明涉及在微生物中制造脂质分子的方法。在一个实施方案中， 该方法包括（a)将微生物培养足以提高细胞密度的第一段时间，其中微生物含有（i)编码 脂肪酶的外源基因，和/或（ii)编码多糖降解酶的外源基因，其中外源基因与应答刺激的 诱导型启动子有效连接，（b)提供刺激，和（c)在存在刺激时将微生物孵育第二段时间。
[0048] 在另一方面中，本发明涉及在微生物中制造脂质分子的方法。在一个实施方案中， 该方法包括（a)将生产脂质的微生物培养足以提高细胞密度的第一段时间，（b)提供与微 生物直接接触时能够感染并裂解微生物的病毒，和（C)将微生物孵育第二段时间，产生裂 解的水性生物量。在一个实施方案中，该方法还包括从裂解的水性生物量中提取脂质分子。 [0049] 在另一方面中，本发明涉及含有外源基因的微藻细胞，其中外源基因编码脂质途 径酶的辅因子，或编码参与辅因子合成的蛋白质。
[0050] 在另一方面中，本发明涉及培养生产脂质的微生物的方法。在一个实施方案中，该 方法包括在存在足量的一种或多种脂质途径酶的辅因子时培养微生物，使得提高微生物脂 质产量超过不存在所述一种或多种辅因子时的微生物脂质产量。在一些情况下，一种或多 种辅因子是一种或多种脂质途径酶所需的维生素。在一个实施方案中，一种或多种辅因子 是生物素。在一些情况下，通过在培养物中包含下述微生物提供一种或多种辅因子，所述微 生物已被遗传改造为生产一种或多种辅因子。
[0051] 在另一方面中，本发明涉及发酵微生物的方法，包括对微生物提供包含葡萄糖和 木糖的混合物作为能源。在一个实施方案中，混合物还包含木质素。在一个实施方案中，混 合物还包含至少一种糠醛种类。在一些情况下，混合物是解聚的纤维素材料。在一些情况 下，混合物还包含至少一种蔗糖利用酶。在一些情况下，混合物包含蔗糖转化酶。
[0052] 在一些情况下，微生物选自Bracteococcus minor、捕圆小球藻、Chlorella kessleri、Chlorella luteoviridis、Bracteococcus medionucleatus、微小小球藻、 Chlorella ovalis、原壳小球藻、Chlorella saccharophila>ChloreIla sorokiniana、小球 藻属物种、小球藻、ParachloreIla kessIeri、Prototheca moriformis 和 PseudochloreIla aquatica。在其他情况下，微生物是本文所述的另一微生物物种。在一些情况下，微生物已 被遗传改造为表达编码至少一种脂质修饰酶、烃修饰酶或蔗糖利用酶的外源基因。
[0053] 在另一方面中，本发明涉及培养微藻的方法，包括在包含原料的培养基中培养 微藻，所述原料包含至少一种选自纤维素材料、5-碳糖、6-碳糖和乙酸盐的碳底物。在 一些情况下，碳底物是葡萄糖，微藻是选自小球藻属、Parachlorella、Pseudochlorella、 Bracteococcus、原壁菌属（Prototheca)和栅藻属（Scenedesmus)的属。在一些情况下，碳 底物是木糖，微藻是选自小球藻属、PseudochlorelIa和原壁菌属的属。在一些情况下，碳 底物是鹿糖，微藻是选自小球藻属和Bracteococcus的属。在一些情况下，碳底物是果糖， 微藻是选自小球藻属、Parachlorella、原壁菌属和栅藻属的属。在一些情况下，碳底物是 阿拉伯糖，微藻是小球藻属物种。在一些情况下，碳底物是甘露糖，微藻是选自小球藻属、 Parachlorella、Bracteococcus、原壁菌属和栅藻属的属。在一些情况下，碳底物是半乳糖， 微藻是选自 Bracteococcus、Parachlorella、小球藻属、Pseudochlorella、Bracteococcus 和原壁菌属的属。在一些情况下，碳底物是乙酸盐，微藻是选自小球藻属、Parachlorel Ia和 原壁菌属的属。
[0054] 在一个实施方案中，培养基还含有至少一种蔗糖利用酶。在一些情况下，微藻已被 遗传改造为表达编码至少一种脂质修饰酶、烃修饰酶或蔗糖利用酶的外源基因。在一些情 况下，培养基含有蔗糖转化酶。
[0055] 在另一方面中，本发明涉及培养微藻的方法，包括在解聚纤维素材料的存在下放 置大量微藻细胞。在一些情况下，在存在额外的固定碳源时培养微藻，所述固定碳源选自甘 油、蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、果糖、阿拉伯糖、甘露糖、乙酸盐和前述的任一组 合。在一个实施方案中，在存在至少一种鹿糖利用酶时培养微藻。
[0056] 在一些情况下，微藻选自Bracteococcus属的物种、小球藻属的物种、 Parachlorella属的物种、原壁菌属的物种，或Pseudochlorella属的物种。在一些情 况下，微藻选自 Bracteococcus minor、捕圆小球藻、Chlorella kessleri、Chlorella luteoviridis、Bracteococcus medionucleatus、微小小球藻、Chlorella ovalis、原壳 小球藻、Chlorella saccharophila、Chlorella sorokiniana、小球藻属物种、小球藻、 Parachlorella kessleri、Prototheca moriformis 和 Pseudochlorella aquatica。在其 他情况下，微藻是本文所述的另一微藻物种。
[0057] 在一些实施方案中，微藻已被遗传改造为表达编码至少一种脂质修饰酶、烃修饰 酶或蔗糖利用酶的外源基因。在一个实施方案中，至少一种蔗糖利用酶是蔗糖转化酶。在 一些情况下，至少一种脂质修饰酶选自硬脂酰-ACP去饱和酶、甘油脂去饱和酶、丙酮酸脱 氢酶、乙酰-CoA羧化酶和甘油-3磷酸酰基转移酶。在一些情况下，至少一种烃修饰酶选自 脂肪酰基-ACP硫酯酶、脂肪酰基-CoA还原酶、脂肪醛还原酶、脂肪酰基-CoA/醛还原酶、月旨 肪醛脱羰基酶和酰基载体蛋白。
[0058] 在另一方面中，本发明涉及培养生产脂质的微生物的方法，该方法包括在存在乙 酸和不存在固定氮源时培养微生物。在一些情况下，在存在足量乙酸时培养微生物，使得提 高微生物脂质产量超过不存在乙酸时的微生物脂质产量，其中两种培养之间培养条件在其 他方面相同。
[0059] 在另一方面中，本发明涉及包含微生物群体和培养基的微生物培养物，所述培 养基包含葡萄糖、木糖和选自木质素和糠醛种类的分子。在一些情况下，微生物选自 Bracteococcus minor、捕圆小球藻、Chlorella kessleri、Chlorella luteoviridis、 Bracteococcus medionucleatus、微小小球藻、Chlorella ovalis、原壳小球藻、Chlorella saccharophila、Chlorella sorokiniana、小球藻属物种、小球藻、Parachlorella kessleri、Prototheca moriformis 和 Pseudochlorella aquatica。在其他情况下，微生物 是本文所述的另一微生物物种。
[0060] 在另一方面中，本发明涉及培养微藻的方法。在一个实施方案中，该方法包括（a) 提供能够进行异养生长的微藻，（b)将微藻置于生长培养基中，其中所述生长培养基包含解 聚的纤维素材料，和（C)将微藻孵育足以允许细胞生长的一段时间。
[0061] 在另一方面中，本发明涉及生物柴油制造方法。在一个实施方案中，该方法包括 (a)在第一微生物培养物中培养生产脂质的微生物，（b)从第一微生物培养物生产的生物 量中回收脂质，（C)对脂质进行酯交换，产生脂肪酸酯和甘油，和（d)将甘油添加至第二微 生物培养物中。在一些情况下，第一和第二微生物培养物是相同微生物物种的培养物。在 一些情况下，第二微生物培养物包含选自以下的微生物：Parachlorella kessleri、原壳小 球藻、Bracteococcus medionucleatus、Prototheca moriformis、微小小球藻、小球藻属物 种和Chlorella sorokiniana。在其他情况下，第二微生物培养物包含本文所述的另一微生 物物种。
[0062] 在另一方面中，本发明涉及发酵方法，包括在存在甘油和至少一种其他的固定碳 源时培养微生物。在一些情况下，以预定的比例对微生物同时提供甘油和至少一种其他的 固定碳源。在一些情况下，在发酵开始时对微生物提供所有的甘油和所有的至少一种其他 的固定碳源。在一些情况下，在发酵过程中以预定的速率对微生物饲喂所有的甘油和至少 一种其他的固定碳源。在该方法的一个实施方案中，在不存在至少一种其他的固定碳源时， 在第一段时间中对微生物提供甘油，在第一段时间结束时提供至少一种其他的固定碳源， 并且在存在至少一种其他的固定碳源时将微生物培养第二段时间。在一个实施方案中，在 第二段时间期间以预定的速率对微生物饲喂至少一种其他的固定碳源。在一些情况下，在 第一段时间结束时对微生物提供所有的至少一种其他的固定碳源。在该方法的一个实施方 案中，在不存在甘油时，在第一段时间中对微生物提供至少一种其他的固定碳源，在第一段 时间结束时提供甘油，并且在存在甘油时将微生物培养第二段时间。在一个实施方案中，甘 油是酯交换过程的副产物。在一个实施方案中，甘油是经过酸化的。在另一实施方案中，甘 油是未经酸化的。在一些情况下，至少一种其他的固定碳源是葡萄糖。在一些情况下，至少 一种其他的固定碳源是解聚的纤维素材料。在一个实施方案中，至少一种其他的固定碳源 是蔗糖。
[0063] 在另一方面中，本发明涉及包含微生物群体、甘油和至少一种糖的发酵罐， 所述糖选自木糖、葡萄糖和蔗糖。在一个实施方案中，甘油是脂质酯交换过程的副产 物。在一些情况下，微生物选自Parachlorella kessleri、原壳小球藻、Bracteococcus medionucleatus、Prototheca moriformis、微小小球藻、小球藻属物种和 Chlorella sorokiniana。在其他情况下，微生物是本文所述的另一物种。
[0064] 在另一方面中，本发明涉及发酵微生物的方法。在一个实施方案中，该方法包括 提供来自酯交换过程的副产物甘油作为固定碳能量的唯一来源。在一个实施方案中，不对 微生物提供光能量。在另一实施方案中，对微生物提供光能量。在一些情况下，微生物选 自 Parachlorella kessleri、原壳小球藻、Bracteococcus medionucleatus、Prototheca moriformis、微小小球藻、小球藻属物种和Chlorella sorokiniana。在其他情况下，微生物 是本文所述的另一物种。
[0065] 在另一方面中，本发明涉及含有外源蔗糖利用基因的微生物。在一个实施方案 中，基因编码蔗糖转运蛋白。在一个实施方案中，基因编码蔗糖转化酶。在一个实施方案 中，基因编码果糖激酶。在一些情况下，微生物选自微小小球藻、Chlorella emersonii、 Chlorella sorokiniana、椭圆小球藻、小球藻属物种或原壳小球藻。在其他情况下，微生物 是本文所述的另一物种。
[0066] 在另一方面中，本发明涉及原壳小球藻、Chlorella emersonii或微小小球藻物种 的细胞，其中所述细胞含有外源基因。在一些情况下，外源基因编码选自以下的蛋白质：蔗 糖转运蛋白、蔗糖转化酶、脂质修饰酶、烃修饰酶和果糖激酶。在一些实施方案中，蛋白质是 被分泌进细胞外间隙的蔗糖转化酶。在一些实施方案中，蛋白质是靶向细胞质的蔗糖转化 酶。
[0067] 在另一方面中，本发明涉及含有微生物群体和培养基的微生物培养物，所述培养 基包含（i)蔗糖和（ii)蔗糖转化酶。
[0068] 在另一方面中，本发明涉及含有微生物群体和培养基的微生物培养物，所述培养 基包含（i)糖蜜和（ii)蔗糖转化酶。
[0069] 在另一方面中，本发明涉及含有微生物群体和培养基的微生物培养物，所述培养 基包含（i)蔗糖、（ii)木质素和（iii)蔗糖转化酶。
[0070] 在上文所述的多种微生物培养物中，微生物含有至少一种外源蔗糖利用基因。在 一些实施方案中，蔗糖利用基因编码蔗糖转运蛋白、蔗糖转化酶、己糖激酶、葡糖激酶或果 糖激酶。在一个实施方案中，蔗糖转化酶是微生物群体表达的外源蔗糖转化酶基因编码的 可分泌的蔗糖转化酶。在一些情况下，微生物含有至少一种编码脂质途径酶或烃修饰酶的 外源基因。
[0071] 在另一方面中，本发明涉及核酸，所述核酸包含编码蔗糖利用基因的cDNA，和编码 赋予抗生素潮霉素或抗生素 G418抗性的蛋白质。
[0072] 在上述多种方法、组合物、细胞、微生物、微生物培养物、发酵罐等等的实施方 案中，除非另有说明，微生物可以是微藻、产油酵母、真菌或细菌。在一些情况下，微生 物选自表1中所列的微藻。在一些情况下，微生物是小球藻属的物种。在一些情况下， 微生物选自 Chlorella anitrata> Chlorella antarctica> Chlorella aureoviridis、 Chlorella Candida、Chlorella capsulata、Chlorella desiccata、捕圆小球藻、 Chlorella emersonii、Chlorella fusca、Chlorella fusca var. vacuolata、Chlorella glucotropha、Chlorella infusionum、Chlorella infusionum var. Actophila、Chlorella infusionum var. Auxenophila、Chlorella kessleri、Chlorella luteoviridis、Chlorella luteoviridis var. aureoviridis、Chlorella luteoviridis var. Lutescens、Chlorella miniata、微小小球藻、Chlorella mutabilis、Chlorella nocturna、Chlorella parva、 Chlorella photophila、Chlorella pringsheimii、原壳小球藻、Chlorella regularis、 Chlorella regularis var. minima、Chlorella regularis var. umbricata、Chlorella reisiglii、Chlorella saccharophila、Chlorella saccharophila var. ellipsoidea、海 水小球藻（Chlorella salina)、Chlorella simplex、Chlorella sorokiniana、小球藻属 物种、Chlorella sphaerica、Chlorella stigmatophora、Chlorella vanniellii、小球藻、 小球藻、Chlorella vulgaris f. tertia、Chlorella vulgaris var. airidis、Chlorella vulgaris var. vulgaris、Chlorella vulgaris var. vulgaris f. tertia、Chlorella vulgaris var. vulgaris f. viridis、Chlorella xanthella 矛口 Chlorella zofingiensis。 在一些情况下，微生物是选自以下的产油酵母：弯曲隐球菌、Cryptococcus terricolus、假 丝酵母（Candida sp.)、油脂酵母、产油油脂酵母、Endomycopsis vernalis、红酵母、痩弱红 酵母和解脂亚罗酵母。在一些情况下，微生物是选自以下的真菌：被孢霉属的物种、葡酒色 被孢霉、高山被孢霉、德巴利腐霉、卷枝毛霉、赭曲霉、土曲霉、薄青霉、Hensenulo属的物种、 毛壳属的物种、枝孢属的物种、畸枝霉属的物种、根霉属的物种和腐霉属的物种。
[0073] 在上述多个实施方案中，微生物可含有至少一种外源蔗糖利用基因。在一些情况 下，蔗糖利用基因编码蔗糖转运蛋白、蔗糖转化酶、己糖激酶、葡糖激酶或果糖激酶。
[0074] 在上述多个实施方案中，微生物可含有至少一种编码脂质途径酶的外源基因。在 一些情况下，脂质途径酶选自硬脂酰-ACP去饱和酶、甘油脂去饱和酶、丙酮酸脱氢酶、乙 酰-CoA羧化酶、酰基载体蛋白和甘油-3磷酸酰基转移酶。
[0075] 在上述多个实施方案中，微生物可含有至少一种编码烃修饰酶的外源基因。在一 些情况下，烃修饰酶选自脂肪酰基-ACP硫酯酶、脂肪酰基-CoA/醛还原酶、脂肪酰基-CoA 还原酶、脂肪醛还原酶、脂肪醛脱羰基酶和/或酰基载体蛋白。
[0076] 可以将上述多种实施方案中任一两个或多个组合在一起，产生包括在本发明范围 内的其他实施方案。
[0077] 附图概述
[0078] 图1展示了在存在多种类型甘油（含或不含额外的葡萄糖）时培养时，每升多种 小球藻属物种和菌株的干细胞重量。
[0079] 图2展示了在存在多种类型甘油（含额外的葡萄糖）时培养时，每升多种小球藻 属物种和菌株的干细胞重量。
[0080] 图3展示了在存在多种类型甘油（含额外的葡萄糖）时培养时，多种小球藻属物 种和菌株的培养物的相对脂质浓度。
[0081] 图4展示了在存在多种类型甘油（含或不含额外的葡萄糖）时培养时，多种小球 藻属物种和菌株的培养物的脂质浓度。
[0082] 图5展示了在存在多种类型甘油（含额外的葡萄糖）时培养时，两种小球藻属物 种和菌株的作为干细胞重量百分比的脂质，其中甘油在葡萄糖之后顺序添加。
[0083] 图6展示了在存在多种类型甘油（含额外的葡萄糖）时培养时，两种小球藻属物 种和菌株的作为干细胞重量百分比的脂质。
[0084] 图7展示了在存在2%葡萄糖和1%葡萄糖+1%试剂级甘油时培养时，多种小球藻 属物种和菌株的培养物的相对脂质浓度。
[0085] 图8展示了在存在葡萄糖（含或不含试剂级甘油）时培养时，多种小球藻属物种 和菌株的作为干细胞重量百分比的脂质，其中甘油与葡萄糖顺序添加或组合添加。
[0086] 图9展示了在存在多种类型甘油（含额外的葡萄糖）时培养时，多种小球藻属物 种和菌株培养物的相对脂质浓度，其中甘油与葡萄糖顺序添加或组合添加。
[0087] 图10展示了在存在多种类型甘油（含额外的葡萄糖）时培养时，每升多种小球藻 属物种和菌株的干细胞重量，其中甘油与葡萄糖顺序添加或组合添加。
[0088] 图11(a)展示了在存在葡萄糖、试剂级甘油、未酸化的生物柴油副产物甘油、以及 甘油和葡萄糖的组合时培养时，钝顶螺旋藻（Spirulina platensis)的作为干细胞重量百 分比的脂质。
[0089] 图11(b)展示了在存在多种类型的甘油和存在甘油与葡萄糖的组合时培养时， Navicula pelliculosa的作为干细胞重量百分比的脂质。
[0090] 图12(a)展示了在存在多种类型的甘油和存在甘油与葡萄糖的组合时培养时，被 甲栅藻（Scenedesmus armatus)的作为干细胞重量百分比的脂质。
[0091] 图12(b)展示了在存在多种类型甘油和存在生物柴油副产物甘油与葡萄糖的组 合时培养时，每升被甲栅藻的干细胞重量。
[0092] 图13展示了在存在多种类型甘油和存在未酸化的生物柴油副产物甘油与葡萄糖 的组合时培养时，每升Navicula pelliculosa的干细胞重量。
[0093] 图14展示了在存在酸化和未酸化的生物柴油副产物甘油（含额外的葡萄糖）时 培养时，每升被甲栅藻和Navicula pelliculosa的干细胞重量，其中甘油与葡萄糖顺序添 加或组合添加。
[0094] 图15展示了与单独的木糖或葡萄糖相比，木糖和葡萄糖的组合对小球藻属生长 的协同效应。
[0095] 图16展示了含有外源基因的原壳小球藻转化体的基因分型。
[0096] 图17展不了原壳小球藻的密码子选择。
[0097] 图18展示了盐生杜氏藻（D. salina)和蛋白核小球藻的密码子选择。
[0098] 图19展示了（a)试剂级甘油；(b)未酸化的生物柴油副产物甘油；和（C)酸化的 生物柴油副产物甘油，其均用于实施例中所述的实验中。
[0099] 图20展示了原壳小球藻在葡萄糖和果糖上的生长。
[0100] 图21展示了 Chlorella fusca在1 %鹿糖上的生长。
[0101] 图22展示了 Chlorella kessleri在1 %鹿糖上的生长。
[0102] 图23展示了在存在葡萄糖、蔗糖或若干糖蜜样品（称作BS1、BS2和HTM)之一时， 在存在或不存在蔗糖转化酶时培养时，每升原壳小球藻的干细胞重量。
[0103] 图24展示了在存在葡萄糖、蔗糖或若干糖蜜样品（称作BS1、BS2和HTM)之一时， 在存在或不存在蔗糖转化酶时培养时，通过相对细胞密度测量的原壳小球藻的生长。
[0104] 图25展示了酵母转化酶（SUC2)的多种质粒构建体的图解，所述构建体具有三种 不同的启动子（称作CMV、CV和HUPl)以及用于亚克隆的限制性位点。
[0105] 图26展示了在黑暗中于蔗糖上选择的含有外源蔗糖转化酶基因的原壳小球藻转 化体的基因分型。
[0106] 图27展示了用下述基因转化的原壳小球藻细胞的基因分型，所述基因编码来自 酿酒酵母（S. cerevisiae)的分泌型鹿糖转化酶。
[0107] 图28展不了用下述基因转化的微小小球藻和Chlorella emersonii细胞的基因 分型，所述基因编码来自酿酒酵母的分泌型蔗糖转化酶。
[0108] 图29图解了气相色谱，所述气相色谱通过分析根据本发明方法产生并在实施例 27中描述的可再生柴油产物获得。
[0109] 图30图解了根据本发明的方法产生并在实施例27中描述的可再生柴油产物的沸 点分布曲线。
[0110] 发明详述
[0111] I.定义
[0112] 除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员 通常所理解的含义。以下的参考文献为技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般 定义：Singleton et al. , Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (第 2 版.1994) ;The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker编辑，1988); The Glossary of Genetics,第 5 版，R. Rieger 等（编辑），Springer Verlag(1991);和 Hale&Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。除非另有说明，在本 文中使用时，以下术语具有归属于它们的含义。
[0113] 关于核酸使用时，"在微藻中有活性"是指在微藻中有功能的核酸。例如，用于驱动 抗生素抗性基因的启动子在微藻中有活性，所述抗生素抗性基因对转基因微藻赋予抗生素 抗性。在微藻中有活性的启动子的例子是对某些藻类物种而言内源性的启动子，和存在于 植物病毒中的启动子。
[0114] "酰基载体蛋白"或"ACP"是一种蛋白质，其在脂肪酸合成期间作为硫酯在4' -磷 酸泛酰巯基乙胺部分的远侧巯基上与延长的酰基链结合，并且包含脂肪酸合酶复合体的组 件。涉及与脂肪酰基-ACP硫酯酶结合的酰基载体蛋白时，短语"天然地共表达"表示ACP和 硫酯酶天然地在它们来源的组织或生物中共表达，例如因为编码这两种酶的基因处于共同 调节序列的控制下，或者因为它们应答相同的刺激而表达。
[0115] "酰基-CoA分子"或"酰基-CoA"是下述分子，其在辅酶A的4' -磷酸泛酰巯基乙 胺部分的远侧巯基上包含通过硫酯键与辅酶A共价结合的酰基部分。
[0116] "无菌的"表示培养物或生物不被其他活生物污染。
[0117] "生物柴油"是生物生产的、适合在柴油引擎中用作燃料的脂肪酸烷基酯。
[0118] 术语"生物量"表示通过细胞的生长和/或繁殖产生的材料。生物量可含有细胞 和/或细胞内含物以及细胞外材料。细胞外材料包括但不仅限于细胞分泌的化合物。
[0119] "生物反应器"表示其中培养细胞的封闭容器（enclosure)或部分封闭的容器，所 述细胞任选地在悬浮液中培养。
[0120] 在本文中使用时，"催化剂"表示能够方便或促进反应物到产物的化学反应而不成 为产物一部分的物质，例如分子或大分子复合物。因此，催化剂提高反应的速率，之后催化 剂可作用于另一反应物，形成产物。催化剂通常降低反应所需的总体活化能，使得反应进展 更快或者在更低的温度下进行。因此，可以更快地达到反应平衡。催化剂的例子包括酶（其 为生物催化剂）、热（其为非生物催化剂）和石油精炼过程中使用的金属催化剂。
[0121] "纤维素材料"表示纤维素消化的产物，包括葡萄糖和木糖，并任选地包括其他化 合物例如二糖、寡糖、木质素、糠醛和其他化合物。纤维素材料来源的非限制性例子包括甘 蔗渣、甜菜浆、玉米杆、木片、锯屑和柳枝稷。
[0122] 术语"共同培养"或其变型表示相同的生物反应器中存在两种或更多类型的细胞。 两种或更多类型的细胞可以均为微生物，例如微藻，或者可以是具有不同细胞类型的培养 的微藻细胞。培养条件可以是促进两种或更多细胞类型生长和/或繁殖的条件，或者促进 两种或更多细胞中一种或一亚类的生长和/或增殖同时维持剩余部分细胞生长的条件。
[0123] 术语"辅因子"在本文中用于表示酶发挥其酶活性所需的、除底物外的任一分子。
[0124] 在本文中使用时，"互补DNA"（ "cDNA"）是mRNA的DNA表述，通常通过信使 RNA (mRNA)的反转录或扩增（例如通过聚合酶链式反应（"PCR"））获得。
[0125] 术语"培养的"及其变型表示通过使用有意的培养条件，有意地加强一种或多种细 胞的生长（提高细胞尺寸、细胞内含物和/或细胞活性）和/或繁殖（通过有丝分裂提高 细胞数）。生长和繁殖二者的组合可以称作增殖。一种或多种细胞可以是微生物细胞，例如 微藻细胞。有意的条件的例子包括使用确定成分培养基（具有已知的特征，例如pH、离子强 度和碳源）、特定的温度、氧张力、二氧化碳水平和在生物反应器中的生长。该术语不涉及天 然的或者没有直接人工干预的微生物的生长或繁殖，例如生物的天然生长，所述生物最终 变为化石，产生地质学原油。
[0126] 在本文中使用时，术语"细胞溶解"表示低渗环境中的细胞裂解。细胞溶解由朝向 细胞内的过量渗透作用或水的移动引起（水分过多）。细胞不能够承受内部水的渗透压，因 此爆裂。
[0127] 在本文中使用时，术语"表达载体"或"表达构建体"表示重组或合成产生的核酸 构建体，其具有一系列特定的核酸元件，所述元件允许在宿主细胞中转录具体的核酸。表达 载体可以是质粒、病毒或核酸片段的部分。通常，表达载体包含与启动子有效连接的待转录 的核酸。
[0128] "外源基因"表示被转化进细胞中的核酸。经转化的细胞可表示可以向其中引入额 外的外源基因的重组细胞。外源基因可以来自相对于被转化的细胞而言不同的物种（并因 此是异源的），或者来自相同的物种（并因此是同源的）。在同源基因的情况下，其相对于 基因的内源拷贝而言占据了细胞基因组中不同的位置。外源基因可以以多于一个拷贝存在 于细胞中。外源基因可以作为基因组的插入物或者作为附加体分子而在细胞中维持。
[0129] "外源提供的"描述了被提供给细胞培养物的培养基的分子。
[0130] 在本文中使用时，"脂肪酰基-ACP硫酯酶"是在脂质合成期间催化从酰基载体蛋白 (ACP)上切割脂肪酸的酶。
[0131] 在本文中使用时，"脂肪酰基-CoA/醛还原酶"是催化酰基-CoA分子还原成为伯醇 的酶。
[0132] 在本文中使用时，"脂肪酰基-CoA还原酶"是催化酰基-CoA分子还原成为醛的酶。
[0133] 在本文中使用时，"脂肪醛脱羰基酶"是催化脂肪醛转化成为烷的酶。
[0134] 在本文中使用时，"脂肪醛还原酶"是催化醛还原成为伯醇的酶。
[0135] "固定碳源"表示在室温和压强下为固体或液体形式的含碳分子，优选地为有机分 子。
[0136] 在本文中使用时，"真菌"表示异养型生物，其特征是来自真菌界的甲壳质细胞壁。
[0137] "匀浆"表示被物理破裂的生物量。
[0138] 在本文中使用时，"烃"表示：(a)仅含有氢和碳原子的分子，其中碳原子共价连接 形成线性、分支、环状或部分环状的主链，氢原子与所述主链结合；或（b)仅主要含有氢和 碳原子、并且可以通过一到四个化学反应被转化为仅含有氢和碳原子的分子。后者的非限 制性例子包括在一个碳原子和一个氢原子之间含有氧原子从而形成醇分子的烃，以及含有 单个氧原子的醛。用于将醇还原为仅含碳原子和氢原子的烃的方法是公知的。烃的另一例 子是酯，其中有机基团代替含氧酸中的氢原子（或多于一个氢原子）。烃化合物的分子结 构从最简单的甲烷形式（CH 4)(天然气的组分）到非常重和非常复杂的形式（例如一些分 子，例如原油、石油和浙青中存在的浙青质）变化。烃可以是气体、液体或固体形式，或这些 形式的任一组合，并可在主链中相邻碳原子之间具有一个或多个双键或三键。因此，该术语 包括线性、分支、环状或部分环状的烷、烯、脂质和石蜡。例子包括丙烷、丁烷、戊烷、己烷、辛 烧、三油精（triolein)和藍烯。
[0139] "烃修饰酶"是指改变烃共价结构的酶。烃修饰酶的例子包括脂肪酶、脂肪酰 基-ACP硫酯酶、脂肪酰基-CoA/醛还原酶、脂肪酰基-CoA还原酶、脂肪醛还原酶和脂肪醛 脱羰基酶。烃修饰酶的酶活性产生的化合物在本文中可与烃或脂质互换，所述化合物包括 脂肪酸、醇、醛、烷或来自其中的其他化合物。
[0140] 术语"氢：碳比例"是指以原子比原子为基础，分子中氢原子与碳原子的比例。 该比例可用于表示烃分子中碳原子和氢原子的数量。例如，具有最高比例的烃为甲烷 CH4 (4:1) 〇
[0141] "疏水级分"是指与水性相相比，在疏水相中更易溶的材料的部分或级分。疏水级 分在水中基本不溶，并且通常是非极性的。
[0142] 在本文中使用时，短语"提高脂质产量"是指通过例如提高每升培养物的细胞干 重，提高构成脂质的细胞百分比，或提高每单位时间每升培养物体积的总体脂质量，提高微 生物培养物的生产力。
[0143] "诱导型启动子"是应答具体的刺激，介导有效连接的基因转录的启动子。
[0144] 在本文中使用时，"有效连接"是指两条序列，例如控制序列（通常为启动子）和所 连接的序列之间的功能性连接。如果启动子能够介导基因的转录，则启动子与外源基因有 效连接。
[0145] 术语"原位"表示"在适当的地方（in place)"或"在其原始的位置"。例如，培养 物可含有分泌催化剂的第一微藻和分泌底物的第二微生物，其中第一和第二细胞类型生产 具体化学反应在共培养物中原位发生所需要的组分，而不需要将材料进一步分离或加工。
[0146] "养分的限制浓度（limiting concentration) "是指培养物中限制所培养的生物 繁殖的浓度。"养分的非限制浓度（non-limiting concentration)"是指在给定的培养周 期期间支持最大繁殖的浓度。因此，与养分是非限制性时相比，存在限制浓度的养分时，在 给定的培养周期期间生产的细胞数更低。当养分以高于支持最大繁殖的浓度存在时，称作 培养物中养分"过量"。
[0147] 在本文中使用时，"脂肪酶"是催化不溶于水的脂质底物中酯键水解的水溶性酶。 脂肪酶催化脂质水解为甘油和脂肪酸。
[0148] 在本文中使用，"脂质途径酶"是在脂质代谢中起作用的任一酶，所述脂质代谢即 脂质合成、修饰或降解之任一种。该术语包括化学修饰脂质的蛋白质以及载体蛋白。
[0149] "脂质"是一类烃，其在非极性溶剂（例如醚和氯仿）中可溶，并且在水中相对或完 全不溶。脂质分子具有这些特性是因为它们主要由天然疏水的长烃尾组成。脂质的例子包 括脂肪酸（饱和和不饱和）；甘油酯或甘油脂（例如甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯或中性 脂肪，和磷酸甘油酯或甘油磷酸脂）；非甘油酯（nonglycerides)(鞘脂类，包括胆固醇和类 固醇激素的留醇脂质，包括萜类的异戊烯醇脂质，脂肪醇，蜡和聚酮化合物）；和复合脂质 衍生物（与糖连接的脂质，或糖脂，和与蛋白质连接的脂质）。"脂肪"是称作"三酰基甘油 酯"的脂质亚类。
[0150] 在本文中使用时，术语"裂解物"是指含有裂解的细胞内含物的溶液。
[0151] 在本文中使用时，术语"裂解（名词）"是指生物的质膜和任选的细胞壁的破裂，所 述破裂足以释放至少一些细胞内内含物，其通常通过破坏细胞完整性的机械、病毒或渗透 机制实现。
[0152] 在本文中使用时，术语"裂解（动词）"表示破坏生物或细胞的细胞膜并任选地破 坏细胞壁，所述破坏足以释放至少一些细胞内内含物。
[0153] "微藻"表示含有叶绿体并任选地能够进行光合作用的真核微生物，或能够进行光 合作用的原核微生物。微藻包括不能代谢固定碳源作为能量的专性光能自养生物，以及能 够在完全没有固定碳源时生存的异养生物。微藻可表示在细胞分裂后与姐妹细胞分开的单 细胞生物如衣藻属（Chlamydomonas),也可以表示微生物例如团藻属（Volvox),其为两种 不同细胞类型的简单的多细胞光合微生物。"微藻"也可以表示细胞例如小球藻属和杜氏藻 属（Dunaliella)。"微藻"还包括显示细胞-细胞黏着的其他微生物光合生物，例如阿格藻 属（Agmenellum)、鱼腥藻属（Anabaena)和桑葚藻属（Pyrobotrys)。"微藻"还包括丧失了 进行光合作用的能力的专性异养微生物，例如某些甲藻藻类物种。
[0154] 术语"微生物"在本文中表示微观的单细胞生物。
[0155] 在本文中使用时，"产油酵母"表示下述酵母，其天然能够将其干细胞重量的多于 10%作为脂质累积，或者由于遗传改造而能够将其干细胞重量的多于10%作为脂质累积。 产油酵母包括生物例如解脂亚罗酵母，以及经改造的酵母菌株，例如被改造为将其干细胞 重量的多于10%作为脂质累积的酿酒酵母。
[0156] 在本文中使用时，术语"渗透休克"是指在渗透压突然降低后细胞在溶液中的破 裂。有时诱导渗透休克，从而将这类细胞的细胞组分释放进溶液中。
[0157] "光生物反应器"是指下述容器，至少其部分是部分透明的或部分开放的，从而允 许光通过，其中培养一种或多种微藻细胞。光生物反应器可以是闭合的，如在聚乙烯袋或锥 形瓶的情况下，或者可以是对环境开放的，如在露天池塘的情况下。
[0158] 在本文中使用时，"多糖降解酶"表示能够催化任一多糖的水解或解聚的任一酶。 例如,纤维素酶催化纤维素的水解。
[0159] "多糖"（也称作"聚糖"）是由通过糖苷键连接在一起的单糖组成的碳水化合物。 纤维素是多糖的一个例子，其组成某些植物细胞壁。可以通过酶将纤维素解聚，得到单糖例 如木糖和葡萄糖，以及更大的二糖和寡糖。
[0160] 在生物反应器的语境中，"口 "表示生物反应器上的开口，其允许材料例如气体、液 体和细胞的输入和输出。口通常与从光生物反应器导出的管道连接。
[0161] "启动子"被定义为指导核酸转录的一组核酸控制序列。在本文中使用时，启动子 包含接近转录起点的必需核酸序列，例如在聚合酶II型启动子的情况下，包含TATA元件。 启动子还任选地含有远端增强子或阻抑子元件，其可处于距离转录起点多达数千碱基对 处。
[0162] 在本文中涉及例如细胞或核酸、蛋白质或载体使用时，术语"重组的"表示通过引 入外源核酸或蛋白质或改变天然的核酸或蛋白质修饰细胞、核酸、蛋白质或载体，或者细胞 来自于如此被修饰的细胞。因此，例如重组细胞表达该细胞的天然（非重组）形式中不存在 的基因，或者表达否则异常表达、表达不足或完全不表达的天然基因。术语"重组核酸"在本 文中表示核酸，其一般通过核酸的操作，例如使用聚合酶和内切核酸酶最初体外形成，为天 然不存在的形式。藉此实现了不同序列的有效连接。因此就本发明的目的而言，通过连接通 常不相连的DNA分子而体外形成的线性形式的分离的核酸或表达载体均被认为是重组的。 应当理解，一旦制备了重组核酸并将其再次引入宿主细胞或生物中，则其会非重组地复制， 即使用宿主细胞的体内细胞机制而不是体外操作；然而，一旦重组生产了这类核酸，尽管其 随后非重组地复制，但是就本发明的目的而言仍然认为其是重组的。类似地，"重组蛋白质" 是使用重组技术制造的蛋白质，即通过表达如上文所述的重组核苷酸而制造的蛋白质。
[0163] 在本文中使用时，术语"可再生的柴油"是指通过脂质的氢化和脱氧生产的烷烃 (例如 C:10:0、C12:0、C:14:0、C16:0 和 C18:0)。
[0164] 在本文中使用时，术语"声波破碎"是指通过使用声波能量破坏生物材料，例如细 胞的方法。
[0165] "糠醒种类"是指2-呋喃甲醒（2-Furancarboxaldehyde)或其衍生物，所述衍生物 保留相同的基本结构特征。
[0166] 在本文中使用时，"秸杆"表示在收获谷粒后剩余的干燥的农作物茎和叶。
[0167] "蔗糖利用基因"是这样的基因，所述基因表达时有助于细胞利用蔗糖作为能源的 能力。蔗糖利用基因编码的蛋白质在本文中称作"蔗糖利用酶"，并且包括蔗糖转运蛋白、蔗 糖转化酶和己糖激酶，例如葡萄糖激酶和果糖激酶。
[0168] "废水"是水样废弃物，其通常包含洗涤水、洗衣废弃物、粪便、尿和其他液体或半 液体废弃物。其包含一些形式的市政废弃物以及经二级处理的污水。
[0169] 为了进行序列比较来测定核苷酸或氨基酸同一性百分比，通常使用一条序列作为 参照序列，将测试序列与之比较。使用序列比较算法时，将测试和参照序列输入计算机中， 在需要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。然后序列比较算法以指定的程序参 数为基础，计算测试序列相对于参照序列的百分比序列同一性。
[0170] 用于比较的最佳序列比对可以例如通过Smith&Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)的局部同源性算法，通过Needleman&Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970) 的同源性比对算法，通过 Pearson&Lipman, Proc. Nat' I. Acad. Sci. USA85:2444(1988) 的相似性搜索方法，通过这些算法的计算机实现（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575Science Dr. , Madison, WI 中的 GAP、BESTFIT、 FASTA和TFASTA)，或通过目检（一般见上文Ausubel等）进行。
[0171] 适用于测定百分比序列同一性和序列相似性的另一个示例算法是BLAST算法，其 描述于Altschul等，J. Mol. Biol. 215:403-410(1990)中。公众可通过国家生物信息学中 心（网址www. ncbi. nlm. nih. gov)获得用于进行BLAST分析的软件。该算法涉及：首先通 过在查询序列中鉴定长度为W的短字来鉴定高评分序列对（HSPs)，所述短字与数据库序列 中相同长度的字比对时匹配或者满足一些正值的阈值评分T。T是指邻域字评分阈值（上 文Altschul等）。这些初始邻域字命中发挥种子的作用启动搜索，以寻找含有它们的更长 的HSP。然后该字命中沿着每条序列在两个方向上延伸，远至能够提高累积比对评分。对 核苷酸序列而言，累积评分使用参数M(-对匹配残基的奖励评分；总是>0)和N(错配残基 的罚分；总是〈〇)计算。对氨基酸序列而言，使用评分矩阵计算累积评分。在以下情况下 停止每个方向上字命中的延伸：累积比对评分比其达到的最大值降低数量X ;由于一个或 多个负得分残基比对的累积，累积评分达到或低于零；或达到任一序列的末端。为了鉴定核 酸或多肽是否在本发明的范围内，BLAST程序的默认参数是合适的。BLASTN程序（对核苷 酸序列而言）使用11的字长（W)，10的期望（E)，M = 5, N = -4和两条链的比较作为默认 值。对氨基酸序列而言，BLASTP程序使用3的字长（W)，10的期望（E)和BL0SUM62评分矩 阵作为默认值。TBLATN程序（使用核苷酸序列的蛋白质序列）使用3的字长（W)，10的期 望（E)和 BL0SUM62 评分矩阵作为默认值"(MHenikoff&Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci· USA89:10915(1989))。
[0172] 除了计算百分比序列同一性以外，BLAST算法还进行两条序列之间相似性的统 计学分析（见例如 Karlin&Altschul, Proc. Nat ' I. Acad. Sci. USA90:5873-5787 (1993))。 BLAST算法提供的一种相似性度量是最小总和概率（P (N))，其提供了两条核苷酸或氨基酸 序列之间随机发生匹配的概率的指征。例如，如果测试核酸与参照核酸的比较中的最小总 和概率少于约0. 1，更优选地少于约0. 01，最优选地少于约0. 001时，则核酸被认为与参照 序列相似。
[0173] II.概述
[0174] 本发明部分以下述观点为基础：某些微生物能够被用于经济和大量地生产油、燃 料，和其他烃或脂质组合物，以用于运输燃料、石油化学工业和/或食品和化妆品工业，以 及其他应用中。合适的微生物包括微藻、产油酵母和真菌。用于本发明的微藻的一个优选 的属是生产脂质的微藻小球藻属。脂质的酯交换产生可用作生物柴油的长链脂肪酸酯。其 他酶方法和化学方法可被定制为产生脂肪酸、醛、醇、烷烃和烯烃。本申请描述了对多种微 生物物种和菌株（包括小球藻属和类似的微生物）进行遗传修饰以提供具有下述特征的生 物的方法，所述特征促进适用于转化成为油、燃料和油类化学品（oleochemicals)的脂质 的生产。在一些应用中，生产可再生的柴油、喷气式发动机燃料或其他烃类化合物。本申请 还描述了为了提高的生产力和提高的脂质产量和/或更经济地生产本文所述组合物而培 养微藻的方法。
[0175] 在具体的实施方案中，本申请描述了用一种或多种外源基因对微藻菌株进行遗传 改造。例如，可以将生产高水平的适用于生物柴油的三酰甘油（TAGs)的微藻改造为表达脂 肪酶，所述脂肪酶能够促进微藻TAG的酯交换。可以使用诱导型启动子任选地表达脂肪酶， 从而可以将细胞在发酵罐中首先培养至想要的密度，然后收获，之后通过诱导启动子来表 达脂肪酶，任选地在足量醇的存在下表达脂肪酶，以驱动TAG转化成为脂肪酸酯。
[0176] 一些微藻脂质被隔离在细胞膜和细胞的其他非水性部分中。因此，为了提高酯交 换反应的产率，将细胞裂解从而提高脂肪酶对脂质的可及性会是有益的。细胞破裂可以例 如通过添加加压蒸汽机械地进行，或通过使用裂解微藻细胞的病毒、表达在细胞中产生裂 解蛋白质的基因、或用裂解微藻细胞的试剂处理培养物进行。为了细胞破裂对微藻的蒸汽 处理描述于例如美国专利6, 750, 048中。
[0177] 本文还公开了对生产高水平TAG的微藻进行遗传改造，从而表达裂解微藻细胞的 基因，例如来自裂解病毒的基因。该基因可使用诱导型启动子表达，从而可以将细胞在发酵 罐中首先培养至想要的密度，然后收获，之后通过启动子的诱导表达该基因，以裂解细胞。 例如可以表达编码多糖降解酶的基因，从而裂解细胞。
[0178] 任选地，脂肪酶可以在细胞内区室中表达，在那里其保持与大部分微藻脂质分离 直至酯交换。通常，优选在从制备物中基本去除水和/或添加过量醇之后进行酯交换。在 酯交换中脂肪酶能够使用水以及醇作为底物。使用水时，脂质与羟基部分缀合产生极性脂 肪酸而不是酯。使用醇例如甲醇时，脂质与甲基缀合，产生非极性脂肪酸酯，所述非极性脂 肪酸酯通常是运输燃料所优选的。为了在条件适合酯交换生产脂肪酸酯之前限制脂肪酶与 微藻脂质的接触，可以使脂肪酶例如在叶绿体、线粒体或其他细胞器中表达。该区室化的表 达导致脂肪酶与大部分细胞脂质隔绝，直至细胞破裂。
[0179] 在其他具体的实施方案中，本申请描述了用一种或多种外源基因遗传改造微藻、 产油酵母、细菌或真菌的菌株，以生产多种烃类化合物。例如，可以将天然或者通过遗传修 饰生产高水平脂质的微藻改造（或进一步改造）为表达外源脂肪酰基-ACP硫酯酶，所述酶 能够在脂质合成期间促进从酰基载体蛋白（ACP)上切割脂肪酸。这些脂肪酸可以被回收， 或者通过细胞内的进一步酶加工产生其他烃类化合物。任选地，脂肪酰基-ACP硫酯酶可以 从与诱导型启动子有效连接的基因表达，和/或可以在细胞内区室中表达。
[0180] 脂肪酰基-ACP硫酯酶可以根据其对（在脂肪酸合成期间）延长的具有特定碳链 长度的脂肪酸的特异性来选择。例如，脂肪酰基-ACP硫酯酶可对范围从8到34个碳原子， 优选地从8到18个碳原子，最优选地10到14个碳原子的碳链长度具有特异性。最优选的 是对具有12个碳原子的脂肪酸的特异性。
[0181] 本发明还提供了经遗传改造的微藻菌株，其表达一种或多种外源基因，所述外源 基因例如为脂肪酶和裂解酶，例如编码多糖降解酶的基因。可使用诱导型启动子表达一种 或两种基因，所述诱导型启动子允许控制这些基因表达的相对时间选择，从而增强脂质产 率和向脂肪酸酯的转化。本发明还提供了用于将生产脂质的微生物改造为代谢蔗糖的载体 和方法，代谢蔗糖是一种有利的性状，因为它允许经改造的细胞将甘蔗或其他原料转化为 适用于生产油、燃料、油类化学品等等的脂质。
[0182] 在其他实施方案中，本发明提供了遗传改造的微生物（例如微藻、产油酵母、细菌 或真菌）菌株，其表达两种或更多外源基因，例如脂肪酰基-ACP硫酯酶和脂肪酰基-CoA/ 醛还原酶，它们的组合作用产生醇产物。本发明还提供了外源基因的其他组合，包括但不限 于，脂肪酰基-ACP硫酯酶和天然共表达的酰基载体蛋白，用于产生长度特异性脂肪酸，或 脂肪酰基-ACP硫酯酶和脂肪酰基-CoA还原酶，用于产生醛。本发明还提供了脂肪酰基-ACP 硫酯酶、脂肪酰基-CoA还原酶和脂肪醛脱羰基酶的组合，用于产生烷烃或烯烃。可以使用 诱导型启动子表达一种或多种外源基因。
[0183] 本发明还提供了微藻的修饰，例如用于对微藻提供想要的生长特征和/或用于增 强产生的脂质量和/或品质。例如，可以将微藻改造为提高进入脂质途径的碳通量和/或 修饰脂质途径从而有益地改变细胞产生的脂质的比例或特性。
[0184] 本申请公开了微藻的遗传改造菌株，其表达两种或更多外源基因，一种编码固定 碳源（例如蔗糖）的转运蛋白，第二种编码蔗糖转化酶。与可通过先前已知的生物烃生产 方法获得的制造成本相比，得到的可发酵的生物以更低的制造成本生产烃。上述两种外源 基因的插入可以与定向诱变和/或随机诱变对多糖生物合成的破坏组合，这将驱动甚至更 大的碳通量进入经生产。食性转化（trophic conversion)、为了改变经生产而改造、和用外 源酶处理，这三者各自或者组合地改变了微生物所生产的烃组合物。该改变可以是生产的 烃量、生产的一种或多种烃种类相对于其他烃的量和/或微生物中生产的烃种类类型的改 变。例如，可以将微藻改造为生产更大量和/或更高百分比的TAG。
[0185] III.生产油或生产脂质的微生物
[0186] 可以使用生产合适的脂质或烃的任一物种的生物，尽管优选天然生产高水 平的合适脂质或经的微生物。微生物对经的生产由Metzger等，Appl Microbiol Biotechnol (2005) 66:486 - 496 和 A Look Back at the U.S. Department of Energy's Aquatic Species Program:Biodiesel from Algae,NREL/TP-580-24190,John Sheehan, Terri Dunahay, John Benemann and Paul Roessler (1998)综述。
[0187] 除了用于生产油、燃料和油类化学品的合适脂质或烃的生产以外，影响本发明中 使用的微生物选择的考虑还包括：（1)作为细胞重量百分比的高脂质含量；（2)容易生长； (3)容易遗传改造；和（4)容易进行生物量加工。在具体的实施方案中，野生型或经遗传修 饰的微生物产生至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%或至少 70%或更多为脂质的细胞。优选的生物（在不存在光时在糖上）异养生长，或者能够使用 例如本文公开的方法被改造为异养生长。转化的容易性和选择标记和在微生物中有功能的 组成型和/或诱导型启动子可得性，使得易于进行遗传改造。加工考虑可包括例如裂解细 胞的有效手段的可用性。
[0188] A.藻类
[0189] 在本发明的一个实施方案中，微生物是微藻。根据本发明的方法可以使用的微藻 的非限制性例子展示于表1中。
[0190] 表1.微藻的例子。
【权利要求】
1. 生产可再生柴油的方法，包括： (a) 在存在固定的碳源时培养微生物群体，其中： (i) 微生物将其干细胞重量的至少10%作为脂质累积；和 (ii) 固定的碳源选自甘油、解聚合的纤维素材料、蔗糖、糖蜜、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳 糖、木糖、果糖、阿拉伯糖、甘露糖、乙酸盐及前述的任一组合； (b) 从培养的微生物中分离脂质组分；和 (c) 对分离的脂质组分进行一个或多个化学反应以产生直链烷烃，从而产生可再生的 柴油。
2. 生产喷气式发动机燃料的方法，包括： (a) 在存在固定的碳源时培养微生物群体，其中： (i) 微生物将其干细胞重量的至少10%作为脂质累积；和 (ii) 固定的碳源选自甘油、解聚合的纤维素材料、鹿糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、木 糖、果糖、阿拉伯糖、甘露糖、乙酸盐及前述的任一组合； (b) 从培养的微生物中分离脂质组分；和 (c) 对分离的脂质组分进行一个或多个化学反应以产生直链烷烃，从而产生喷气式发 动机燃料。
3. 根据权利要求1的方法制造的液态烃组合物，其中该组合物符合ASTM D975规范。
4. 根据权利要求2的方法制造的液态烃组合物，其中所述组合物符合ASTM D1655规 范。
5. 微藻或酵母细胞，所述微藻或酵母细胞已被遗传改造和/或选择，从而与相同物种 的野生型细胞相比以改变的水平表达脂质途径酶。
6. 含有一种或多种外源基因的产油微生物，其中所述外源基因编码选自以下的蛋白 质：脂肪酰基-ACP硫酯酶、脂肪酰基-CoA还原酶、脂肪醛还原酶、脂肪酰基-CoA/醛还原 酶、脂肪醛脱羰基酶和酰基载体蛋白。
7. 含有两种外源基因的微生物，其中第一外源基因编码脂肪酰基-ACP硫酯酶，第二外 源基因编码选自脂肪酰基-CoA还原酶、脂肪酰基-CoA/醛还原酶和酰基载体蛋白的蛋白 质。
8. 在微生物群体中生产分子的方法，所述方法包括在培养基中培养微生物群体，其中 所述微生物含有： ⑴编码脂肪酰基-ACP硫酯酶的第一外源基因，和 (ii)编码脂肪酰基-CoA/醛还原酶的第二外源基因；并且 其中所述微生物合成与酰基载体蛋白（ACP)连接的脂肪酸，所述脂肪酰基-ACP硫酯酶 催化从ACP上切割脂肪酸，通过进一步加工产生脂肪酰基-CoA，并且脂肪酰基-CoA/醛还原 酶催化所述酰基-CoA还原成为醇。
9. 在微生物群体中生产脂质分子的方法，所述方法包括在培养基中培养微生物群体， 其中微生物含有： ⑴编码脂肪酰基-ACP硫酯酶的第一外源基因，和 (ii)编码脂肪酰基-CoA还原酶的第二外源基因；并且 其中微生物合成与酰基载体蛋白（ACP)连接的脂肪酸，脂肪酰基-ACP硫酯酶催化从 ACP上切割脂肪酸，通过进一步加工得到脂肪酰基-CoA，并且脂肪酰基-CoA还原酶催化酰 基-CoA还原成为醛。
10. 在微生物群体中生产具有特定碳链长度的脂肪酸分子的方法，所述方法包括在 培养基中培养生产脂质的微生物群体，其中所述微生物含有编码脂肪酰基-ACP硫酯酶的 外源基因，所述酶具有对碳链长度特异的活性，并且其中所述微生物合成与酰基载体蛋白 (ACP)连接的脂肪酸，并且当脂肪酸被合成至特定的碳链长度时，硫酯酶催化从ACP上切割 脂肪酸。
11. 含有外源基因的微藻细胞，其中所述外源基因编码选自脂肪酶、蔗糖转运蛋白、蔗 糖转化酶、果糖激酶或多糖降解酶的蛋白质。
12. 含有两种外源基因的微藻细胞，其中第一外源基因编码脂肪酶，第二外源基因编码 多糖降解酶。
13. 在微生物中制造脂质分子的方法，所述方法包括： (a) 将微生物培养足以提高细胞密度的第一段时间，其中所述微生物含有： ⑴编码脂肪酶的外源基因；和/或 (ii)编码多糖降解酶的外源基因； 其中所述外源基因与应答刺激的诱导型启动子有效连接； (b) 提供所述刺激；和 (c) 在存在所述刺激时将微生物孵育第二段时间。
14. 在微生物中制造脂质分子的方法，所述方法包括： (a) 将生产脂质的微生物培养足以提高细胞密度的第一段时间； (b) 提供与微生物直接接触时能够感染并裂解所述微生物的病毒；和 (c) 将微生物孵育第二段时间，产生裂解的水性生物量。
15. 含有外源基因的微藻细胞，其中所述外源基因编码脂质途径酶的辅因子，或编码参 与辅因子合成的蛋白质。
16. 培养生产脂质的微生物的方法，所述方法包括在存在足量的一种或多种脂质途径 酶的辅因子时培养微生物，使得提高微生物脂质产量超过不存在所述一种或多种辅因子时 的微生物脂质产量。
17. 发酵微生物的方法，包括对微生物提供包含葡萄糖和木糖的混合物作为能源。
18. 培养微藻的方法，包括在含有下述原料的培养基中培养微藻，所述原料包含至少一 种选自纤维素材料、5-碳糖、6-碳糖和乙酸盐的碳底物。
19. 培养生产脂质的微生物的方法，所述方法包括在存在乙酸且不存在固定的氮源时 培养所述微生物。
20. 微生物培养物，含有： (a) 微生物群体；和 (b) 培养基，其包含葡萄糖、木糖和选自木质素和糠醛种类的分子。
21. 生物柴油制造方法，所述方法包括： (a) 在第一微生物培养物中培养生产脂质的微生物； (b) 从第一微生物培养物产生的生物量中回收脂质； (c) 对脂质进行酯交换以产生脂肪酸和甘油；和 (d)将甘油添加至第二微生物培养物中。
22. 发酵方法，包括在甘油和至少一种其他的固定碳源存在下培养微生物。
23. 发酵罐，其含有： (a) 微生物群体； (b) 甘油；和 (c) 至少一种选自木糖、葡萄糖和蔗糖的糖。
24. 发酵微生物的方法，包括提供来自酯交换过程的副产物甘油作为固定碳能量的惟 一来源。
25. 含有外源蔗糖利用基因的微生物。
26. 原壳小球藻、Chlorella emersonii或微小小球藻物种的细胞，其中所述细胞含有 外源基因。
27. 微生物培养物，其含有： (a) 微生物群体；和 (b) 包含（i)蔗糖和（ii)蔗糖转化酶的培养基。
28. 微生物培养物，其包含： (a) 微生物群体；和 (b) 包含（i)糖蜜和（ii)蔗糖转化酶的培养基。
29. 微生物培养物，其包含： (a) 微生物群体；和 (b) 包含（i)蔗糖；（ii)木质素和（iii)蔗糖转化酶的培养基。
30. 核酸，其包含： (a) 编码蔗糖利用基因的cDNA ;和 (b) 编码赋予对抗生素潮霉素或抗生素 G418的抗性的蛋白质的cDNA。
31. 培养微藻的方法，包括： (a) 提供能够进行异养生长的微藻； (b) 将微藻置于生长培养基中，其中所述生长培养基包含解聚的纤维素材料；和 (c) 将微藻培养足以允许细胞生长的一段时间。
【文档编号】C12P7/64GK104212844SQ201410321130
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2008年6月2日 优先权日:2007年6月1日
【发明者】D·E·特里穆博, C-S·伊姆, H·F·狄龙, A·G·戴, S·富兰克林, A·科拉格利奥蒂 申请人:索拉兹米公司