专利名称：：一种提取蔷薇科植物根原生质体的方法
技术领域：
：本发明涉及一种提取蔷薇科植物根原生质体的方法。
背景技术：
：原生质体是指植物细胞中除去细胞壁的裸露部分。利用原生质体进行细胞融合，可以实现远缘遗传重组，创造新的遗传型；可以转移抗逆性状，改良作物品质；可以转移细胞质基因控制的性状。原生质体还可以作为受体进行基因重组和转移，培养优质高产作物新种质，提高植物细胞中次级代谢物质含量。建立稳定高效的原生质体提取体系，是进行原生质体基础理论研究和原生质体培养的关键。在植物原生质体的提取中，提取的原生质体的产量和活力，与原料来源与生理状态，酶解液的组成成分，酶解方法与条件，收集与纯化方法等有密切关系。在原生质体提取多采用一步酶解法，其中，对提取效果影响最大的是纤维素酶浓度和酶解时间。若酶液浓度较大，酶解时间就较短；反之，时间就需增长。若酶浓度过大，就会导致原生质体中毒和原生质体破裂数增多；而酶解时间过长不仅会导致较早游离出的原生质体破裂，且浪费时间。因为不同的植物，其细胞壁的特性有差异，即使是同一种植物，其不同部位的细胞壁也不相同，因此，探索适于提取同一种，特别是同一属，甚至是同一科的植物的原生质体的方法尤为重要。
发明内容本发明的目的是提供一种提取蔷薇科植物根原生质体的方法。本发明所提供的提取蔷薇科植物根原生质体的方法，是将蔷薇科植物根先用酶解液I进行酶解，再用酶解液II进行酶解，得到蔷薇科植物根原生质体；所述酶解液I为含有210-420U/ml纤维素酶的溶液，所述酶解液II为含有80-320U/ml纤维素酶和l-4U/ml果胶酶的溶液。其中，所述酶解液I具体可为含有280U/ml纤维素酶的溶液，所述酶解液II具体可为含有240U/ml纤维素酶和2U/ml果胶酶的溶液。为了获得较好的提取效果，所述酶解液I和酶解液II均可以用含0.5-4mmol/LCaCl2，0.5-2蘭ol/LMgCl2，0.05-0.25mg/mL牛血清白蛋白，0.022-0.055mg/mL抗坏血酸，0.25-1mg/mL聚乙烯吡咯垸酮的水溶液进行配制。所述酶解液I和酶解液II具体可用含2mmol/LCaCl2，1mmol/LMgCl2，0.05mg/mL牛血清白蛋白，0.044mg/mL抗坏血酸，0.5mg/mL聚乙烯吡咯院酮的水溶液进行配制。在本发明方法中，用所述酶解液I和所述酶解液II进行酶解的温度可以为24-26°C，用所述酶解液I进行酶解的时间可以为40-60分钟；用所述酶解液II进行酶解的时间可以为80-120分钟。所述酶解可以在转速为100-200r/min的震荡条件下进行，旋转半径为50mm或25mm。为了进一步提高酶解效率，所述蔷薇科植物根在酶解前可以先切成0.5mm-lmm的小段。所述蔷薇科植物根与所述酶解液I中的所述纤维素酶的配比为(2100-5600)U纤维素酶/g根，优选为(2100-4200)U纤维素酶/g根；所述蔷薇科植物根与所述酶解液II中的所述纤维素酶和所述果胶酶的配比为(800-4800)U纤维素酶/g根和(10-40)U果胶酶/g根，优选为(800-3200)U纤维素酶/g根。本发明方法特别适合于蔷薇科植物的白色幼嫩初生根，优选为通过组织培养得到的。上述蔷薇科植物可以为苹果属、梨属、桃属、杏属、李属或樱属植物；优选为珠美海棠(A/b/wszwm/Mats)禾口山定子[Afo/ws6accfl^afLJBorkh]。本发明方法主要是依据植物根细胞壁的特性，应用两步酶解法，通过控制酶解时间，来获得完整的根原生质体的。本发明方法得到的原生质体的产量和活力均高于一步酶解法，而且提取时间明显短于一步酶解法，一般需要2-3小时就可以完成，从而对原生质体的伤害相对较小。通过本发明方法获得的原生质体可用于各种相关科学研究，如根的生理生化特性、细胞信号转导特性的研究，植物细胞分子结构的研究。应用本发明方法提取的原生质体，在植物的杂交育种领域还具有较大应用前景，通过同一来源或不同来源的原生质体相互融合，可以重新发育成新的植株，即体细胞杂交，是创新种质的重要手段。本发明以苹果属植物珠美海棠为试材，对影响其根系原生质体分离效果的诸因素进行研究，确定获取高产优质原生质体的适宜条件，为利用原生质体研究苹果电转化和基因枪细胞中离子跨膜运输和转基因过程中转化等提供材料和技术基础。因此，本发明方法在木本植物的杂交育种等领域有较大应用前景。具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。实施例1、材料的培养本实施例中以耐盐的珠美海棠(Mfl/wsz,/Mats)为实验材料。用到的培养基如下(1)MS培养基<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>(2)生长培养基为MS+IAA(0.2(ag/L)(3)生根培养基为MS+IAA(l吗/L)材料的培养过程如下-(1)组培方法步骤①获得无菌的外植体将充分成熟的珠美海棠的种子(国家苹果种质资源圃中的编号为PGB0484)在4。C条件下进行层积处理，待种子发芽后，将胚根长度为2cm的种子插入含0.5%琼脂的未灭菌的MS培养基中预培养得到预培养苗。取脱去种皮的预培养苗，使其留有子叶但切去茎尖，用0.P/。HgCl2消毒5分钟，无菌水冲洗3遍，将其接种于上述生长培养基上培养4周，获得无菌的外植体。②获得基因型一致的试管苗取上述无菌外植体，切取0.5-lcm茎尖并将其接种于继代增殖的分代培养基上(MS+BA1.0mg/L+NAA0.05mg/L+GA30.5mg/L)培养30天，分化出侧芽；将分代出的侧芽接种到增殖培养基(MS+BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L)中培养40天，获得试管苗；再将生长健康的试管苗接种到分化培养基(MS+BA1.0mg/L+NAA0.05mg/L+GA30.5mg/L)中培养30天，分化出侧芽；再将侧芽接种到增殖培养基中，培养40天，获得试管苗，如此在分化培养基和增殖培养基中交替转接，多次继代后可得到基因型一致的试管苗。③获得生根试管苗将基因型一致的高于1.5cm的试管苗接种到生根培养基上，30天后试管苗长出细嫩白色根系。(2)水培苗的培养将步骤(1)中得到的生根组培苗生根移入营养液，在培养室中进行通气培养，培养条件为白天温度22-28。C，夜间15-20°C，相对湿度(RH)白天为45-50%，夜间为60-70%，叶面光强为800nmoHn—2's—、光照时间为12h/d。如此培养3-6个月，至幼苗的根培养至白色初生根在6-8条以上，这样才能脱离植株在培养基中时根系不正常的状态。其中，营养液的组成及各组分浓度如下<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>ZnS04.7H201.12g/LCuS04.5H200.648g/L(NH4)2Mo04.4H200.0408g/L实施例2、提取根原生质体1、酶解液的制备酶基础液2mmol/LCaCl2，1mmol/LMgCl2，0.05mg/mL牛血清白蛋白(BSA)，0.044mg/mL抗坏血酸(VC)，0.5mg/mL聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，其余为水。酶解液I:在酶基础液中加入纤维素酶(Cellulysin)(上海贝基生物科技有限公司，XS-16010)，使纤维素酶的浓度为280U/ml酶解液，并调节酶解液的pH值为5.8。酶解液经0.22pm混合纤维素孔滤膜过滤灭菌。酶解液II:在酶基础液中加入纤维素酶RS(CellulaseRS)(Yakult公司，L0011);和果胶酶Y-23(PectolaseY-23)(上海迈坤化工有限公司，25M0460)，使纤维素酶RS的浓度为240U/ml酶解液，使果胶酶Y-23的浓度为2U/ml酶解液，并调节酶解液的pH值为5.8。酶解液经0.22混合纤维素孔滤膜过滤灭菌。2、用酶解液提取原生质体将实施例1中水培3-6个月的珠美海棠幼苗的白色幼嫩初生根切成0.5-1.0mm小段。取上述根段加入酶解液I中，使根段与纤维素酶的配比为2800U纤维素酶/g根段，在水浴振荡器中(25°C，100r/min，旋转半径为25mm)酶解40分钟；酶解结束后，经100目尼龙滤网过滤，收集滤液，加入步骤1中酶基础液进行稀释，再次过滤，收集滤液，再用步骤1中酶基础液进行稀释，得到去除表皮细胞的组织；然后向其中按照24oou纤维素酶/g根段和2ou果胶酶/g根段的比例加入酶解液n(CellulaseRS、PectolaseY-23(pH5.8))，在水浴振荡器中(25°C，100r/min，旋转半径为50mm)酶解100分钟。酶解结束后，经400目尼龙滤网过滤，以除去未酶解完全的细胞团或组织，将滤液转移至离心管中，以1000r/min的速度离心5min，弃上清，留沉淀，再加入步骤1中的酶基础液，充分混匀后，离心5min。此过程重复3次，收集原生质体备用。3、原生质体的产量和活力的测定检测原生质体产量的方法上述实验中一共取了lg根段进行实验，将步骤2中收集到的所有原生质体稀释4倍后共得到8ml原生质体稀释液，取其中的0.1ml滴加在血球计数板上，计算原生质体数，每个样品计数6个重复，求出原生质体密度，再根据原生质体密度最后计算出原生质体产量，其中，计算原生质体密度和产量的公式为原生质体密度(个/mL^原生质体个数x稀释倍数x10、原生质体产量(个/g)"原生质体密度X稀释前体积)/根质量。实验重复3次，得到的原生质体密度分别是26.05xl(^个原生质体/mL、17.2><106个原生质体/mL、10.2xl(^个原生质体/mL，原生质体的产量分别是52.1><106个原生质体/g根、34.4><106个原生质体/8根、20.4xl()S个原生质体/g根，平均35.5><106个原生质体/g根。检测原生质体活力的方法取洗涤过的原生质体悬浮液0.5ml(与稀释4倍后的浓度一致)，置于10X100mm的小试管中，加入FDA溶液(荧光素双醋酸酯)(FDA是一种非极性物质，能自由地穿越细胞质膜，在活细胞内，FDA被酯酶裂解即发荧光(荧光素)，由于荧光素不能自由通过质膜，因而可以在荧光显微镜下通过具荧光的细胞的观察确定细胞活性，百分比表示有活力的原生质体占所有原生质体的比例)使其最终浓度为0.01%,混匀、置于室温5min后用荧光显微镜观察。激发光滤光片用QB24,压制滤光片用JB8。发绿色荧光的原生质体为有活力的，不产生荧光的为无活力的；计算原生质体活力的公式为染色的原生质体个数/观察到的总原生质体个数(注均一个视野中的原生质体个数)。实验重复3次，结果分别为50/79=63.3%、34/71=47.9%、26/82=31.7%，平均47.6%。实施例3、原生质体的提取1、酶解液的制备酶基础液0.5mmol/LCaCl2，0.5mmol/LMgCl2，0.15mg/mL牛血清白蛋白(BSA)，0.022mg/mL抗坏血酸(VC)，0.25mg/mLPVP，其余为水。酶解液I:在酶基础液中加入纤维素酶(Cellulysin)(上海贝基生物科技有限公司，XS-16010)，使纤维素酶的浓度为210U/ml酶解液，并调节酶解液的pH值为5.8。酶解液经0.22nm混合纤维素孔滤膜过滤灭菌。酶解液II:在酶基础液中加入纤维素酶RS(CellulaseRS)(Yakult公司，L0011);和果胶酶Y-23(PectolaseY-23)(上海迈坤化工有限公司，25M0460)，使纤维素酶RS的浓度为80U/ml酶解液，使果胶酶Y-23的浓度为1U/ml酶解液，并调节酶解液的pH值为5.8。酶解液经0.22pm混合纤维素孔滤膜过滤灭菌。2、用酶解液提取原生质体将实施例1中水培3-6个月的珠美海棠幼苗的白色幼嫩初生根切成0.5-1.0mm小段。取上述根段加入酶解液I中，使根段与纤维素酶的配比为2100U纤维素酶/g根段，在水浴振荡器中(24°C，150r/min，旋转半径为25mm)酶解50分钟；酶解结束后，经100目尼龙滤网过滤，收集滤液，加入步骤1中酶基础液进行稀释，再次过滤，收集滤液，再用步骤1中酶基础液进行稀释，得到去除表皮细胞的组织；然后向其中按照8oou纤维素酶/g根段和iou果胶酶/g根段的比例加入酶解液n(CellulaseRS、PectolaseY-23(pH5.8))，在水浴振荡器中(24°C，150r/min，旋转半径为50mm)酶解80分钟。酶解结束后，经400目尼龙滤网过滤，以除去未酶解完全的细胞团或组织，将滤液转移至离心管中，以1000r/min的速度离心5min，弃上清，留沉淀，再加入步骤l中的酶基础液，充分混匀后，离心5min。此过程重复3次，收集原生质体备用。3、原生质体的产量和活力的测定检测原生质体产量的方法方法同实施例2所述一致。检测原生质体活力的方法方法同实施例2所述一致。实验重复3次，得到的原生质体密度分别是10.2xl0S个原生质体/mL、1.35"06个原生质体/mL、5.65xl(^个原生质体/mL;原生质体的产量分别是20.4><106个原生质体/g根、2.7xl()S个原生质体/g根、11.3><106个原生质体/§根，平均11.5x106个原生质体/g根。实验重复3次，结果分别为29/79=36.7%、15/71=21.1%、26/98=26.5%，平均28.1%。实施例4、原生质体的提取1、酶解液的制备酶基础液4mmol/LCaCl2，2mmol/LMgCl2，0.25mg/mL牛血清白蛋白(BSA),0.055mg/mL抗坏血酸(VC)，lmg/mLPVP，其余为水。酶解液I:在酶基础液中加入纤维素酶(Cellulysin)(上海贝基生物科技有限公司，XS-16010)，使纤维素酶的浓度为420U/ml酶解液，并调节酶解液的pH值为5.8。酶解液经0.22pm混合纤维素孔滤膜过滤灭菌。酶解液II:在酶基础液中加入纤维素酶RS(CellulaseRS)(Yakult公司，L0011);和果胶酶Y-23(PectolaseY-23)(上海迈坤化工有限公司，25M0460)，使纤维素酶RS的浓度为320U/ml酶解液，使果胶酶Y-23的浓度为4U/ml酶解液，并调节酶解液的pH值为5.8。酶解液经0.22pm混合纤维素孔滤膜过滤灭菌。2、用酶解液提取原生质体将实施例1中水培3-6个月的珠美海棠幼苗的白色幼嫩初生根切成0.5-1.0mm小段。取上述根段加入酶解液I中，使根段与纤维素酶的配比为4200U纤维素酶/g根段，在水浴振荡器中(26°C，200r/min，旋转半径为25mm)酶解60分钟；酶解结束后，经100目尼龙滤网过滤，收集滤液，加入步骤1中酶基础液进行稀释，再次过滤，收集滤液，再用步骤1中酶基础液进行稀释，得到去除表皮细胞的组织；然后向其中按照3200U纤维素酶/g根段和40U果胶酶/g根段的比例加入酶解液II(CellulaseRS、PectolaseY-23(pH5.8))，在水浴振荡器中(26°C，200r/min，旋转半径为50mm)酶解120分钟。酶解结束后，经400目尼龙滤网过滤，以除去未酶解完全的细胞团或组织，将滤液转移至离心管中，以1000r/min的速度离心5min，弃上清，留沉淀，再加入步骤l中的酶基础液，充分混匀后，离心5min。此过程重复3次，收集原生质体备用。3、原生质体的产量和活力的测定检测原生质体产量的方法方法同实施例2所述一致。实验重复3次，得到的原生质体密度分别是4.6xl(^个原生质体/inL、4.1><106个原生质体/mL、6.7xl(^个原生质体/mL，原生质体的产量分别是9.2><106个原生质体/g根、8.2xl()S个原生质体/g根、13.4><106个原生质体/8根，平均10.3><106个原生质体/g根。检测原生质体活力的方法方法同实施例2所述一致。实验重复3次，结果分别为12/49=24.5%、17/58=29.3%、19/60=31.7%，平均28.5%。权利要求1、一种提取蔷薇科植物根原生质体的方法，是将蔷薇科植物根先用酶解液I进行酶解，再用酶解液II进行酶解，得到蔷薇科植物根原生质体；所述酶解液I为含有210-420U/ml纤维素酶的溶液，所述酶解液II为含有80-320U/ml纤维素酶和1-4U/ml果胶酶的溶液。2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述酶解液I为含有280U/ml纤维素酶的溶液，所述酶解液II为含有240U/ml纤维素酶和2U/ml果胶酶的溶液。3、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述酶解液I和酶解液II均用含0.5-4mmol/LCaCl2，0.5-2mmol/LMgCl2，0.05-0.25mg/mL牛血清白蛋白，0.022-0.055mg/mL抗坏血酸，0.25-1mg/mL聚乙烯吡咯垸酮的水溶液进行配制。4、根据权利要求l、2或3所述的方法，其特征在于所述酶解液I和酶解液n均用含2mmol/LCaCl2，lmmol/LMgCl2，0.05mg/mL牛血清白蛋白，0.044mg/mL抗坏血酸，0.5mg/mL聚乙烯吡咯垸酮的水溶液进行配制。5、根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述方法中，用所述酶解液I和所述酶解液II进行酶解的温度为24-26°C，用所述酶解液I进行酶解的时间为40-60分钟；用所述酶解液II进行酶解的时间为80-120分钟。6、根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述酶解在转速为100-200r/min的震荡条件下进行，旋转半径为50mm或25mm。7、根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述蔷薇科植物根在酶解前先切成0.5mm-lmm的小段。8、根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述蔷薇科植物根与所述酶解液I中的所述纤维素酶的配比为(2100-5600)U纤维素酶/g根，优选为(2100-4200)U纤维素酶/g根；所述蔷薇科植物根与所述酶解液II中的所述纤维素酶和所述果胶酶的配比为(800-4800)U纤维素酶/g根和(10-40)U果胶酶/g根，优选为(800-3200)U纤维素酶/g根。9、根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于所述蔷薇科植物根是蔷薇科植物的白色幼嫩初生根，优选为通过组织培养得到的。10、根据权利要求1-9中任一所述的方法，其特征在于所述蔷薇科植物为苹果属、梨属、桃属、杏属、李属或樱属植物；优选为珠美海棠(Afetowm/Mats)和山定子[Afo/w"a簡如(1.)Borkh]。全文摘要本发明公开了一种提取蔷薇科植物根原生质体的方法。本发明所提供的提取蔷薇科植物根原生质体的方法是将蔷薇科植物根先用酶解液I进行酶解，再用酶解液II进行酶解，得到蔷薇科植物根原生质体；所述酶解液I为含有210-420U/ml纤维素酶的溶液，所述酶解液II为含有80-320U/ml纤维素酶和1-4U/ml果胶酶的溶液。本发明方法得到的原生质体的产量和活力均高于一步酶解法，而且提取时间明显短于一步酶解法，一般需要2-3小时就可以完成，从而对原生质体的伤害相对较小。因此，本发明方法有广阔应用前景。文档编号C12N5/04GK101289652SQ200810115069公开日2008年10月22日申请日期2008年6月16日优先权日2008年6月16日发明者于立杰,李天忠,忆王,许雪峰,韩振海申请人:中国农业大学