专利名称：：一种高产碱性蛋白酶浓缩提取工艺的建立的制作方法
技术领域：
：本发明属于微生物酶制剂领域技术，涉及一种高产碱性蛋白酶浓縮提取工艺的建立。
背景技术：
：随着人们生活水平的提高，含磷洗涤剂将被逐渐淘汰，这使得加酶洗涤剂的市场份额越来越大，发展前景越来越广阔。目前我国洗涤剂总产量为270万吨，而加酶洗涤剂产量只占洗涤剂总量的30%，约80万吨。加酶洗涤剂的主要用酶为碱性蛋白酶，目前，国内洗涤剂生产厂家所用的碱性蛋白酶主要采用丹麦Novoenzyme公司和美国Genencor公司的酶，其原因是由于我国碱性蛋白酶的生产水平较差。建立一种适用于工业化生产的高产碱性蛋白酶生产工艺显得非常必要和重要。这将大大提高我国工业微生物酶制剂的生产技术水平，推动我国酶制剂工业的发展，促进绿色洗涤剂的发展。
发明内容本发明目的是建立一种用于工业化生产的高产碱性蛋白酶的提取工艺，为建充起我国自己的碱性蛋白酶生产体系奠定基础。具体实施例方式首先对本发明中工艺所针对的高产碱性蛋白酶的来源进行简要说明1菌种嗜碱芽孢杆菌(Sac/〃^a/cfl/opM^)ATCC215222种子培养基酵母浸粉0.5胰蛋白胨0.5葡萄糖1.0%磷酸氢二钾1.8%发酵培养基酵母浸粉1.5%棉籽饼粉2.5%麦芽糊精9.0%柠檬酸钠0.3%氯化钙0.2磷酸氢二钾1.8%3发酵条件32°C，发酵时间46小时，所产碱性蛋白酶酶活力为28000-32000U/ml。下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。l絮凝实施例一取刚下罐的发酵液100mL，调整发酵液PH值为8.0后，加入絮凝剂NaA102，加入量0.5%，室温搅拌10min，离心测量菌体的沉淀量，以及酶活力。实施例二取刚下罐的发酵液100mL，调整发酵液PH值为8.0后，加入絮凝剂NaA102，加入量1.0%，室温搅拌10min，离心测量菌体的沉淀量，以及酶活力。实施例三取刚下罐的发酵液100mL，调整发酵液PH值为7.0后，加入絮凝剂NaA102，加入量1.0%，室温搅拌10min，离心测量菌体的沉淀量，以及酶活力。实施例四取刚下罐的发酵液100mL，调整发酵液PH值为7.0后，加入絮凝剂聚丙烯酰胺，加入量1.0%,室温搅拌10min，离心测量菌体的沉淀量，以及酶活力。结果NaA102加入量为0.1%，发酵液PH为8.0时絮凝速度快，絮凝菌体多，菌体离心速度最快，酶活收率为96.4%，达到了所需的最佳絮凝效果。2活性炭脱色发酵液经絮凝离心后加入中颗粒活性炭进行脱色处理，加入量为0.5%，脱色30min，观察发酵液外观，测定酶活力。实施例二发酵液经絮凝离心后加入粉末状活性炭进行脱色处理，加入量为0.5%，脱色30min，观察发酵液外观，测定酶活力。实施例三发酵液经絮凝离心后加入中颗粒活性炭进行脱色处理，加入量为1.0%，脱色30min，观察发酵液外观，测定酶活力。实施例四发酵液经絮凝离心后加入中颗粒活性炭进行脱色处理，加入量为1.0%，脱色20min，观察发酵液外观，测定酶活力。结果采用1。/。中颗粒活性炭进行发酵液脱色处理30min后，发酵液颜色由深褐色变为金黄色，脱色效果最为明显，，酶活收率为90.3%，达到了所需的最佳脱色效果。3超滤浓縮工艺实施例一将经过絮凝、离心、脱色、纸板精滤后的发酵液进行超滤浓縮，采用醋酸纤维膜，超滤温度2(TC，操作压力0.05MP，超滤2小时后，测定浓縮酶液酶活力以及浓縮倍数。实施例二将经过絮凝、离心、脱色、纸板精滤后的发酵液进行超滤浓縮，采用醋酸纤维膜，超滤温度1(TC，操作压力O.IOMP，超滤2小时后，测定浓縮酶液酶活力以及浓縮倍数。实施例三将经过絮凝、离心、脱色、纸板精滤后的发酵液进行超滤浓縮，采用聚丙烯膜，超滤温度20。C，操作压力0.05MP，超滤2小时后，测定浓縮酶液酶活力以及浓縮倍数。实施例四将经过絮凝、离心、脱色、纸板精滤后的发酵液进行超滤浓縮，采用聚丙烯膜，超滤温度1(TC，操作压力0.05MP，超滤2小时后，测定浓縮酶液酶活力以及浓縮倍数。结果采用聚丙烯材料的超滤膜进行碱性蛋白酶的超滤，超滤温度l(TC，操作压力为0.05MP时，单位时间酶的浓縮倍数最高，且酶活回收率最大为96.1%，达到了所需的最佳浓縮效果。结论本试验在絮凝过程中采用了新型的絮凝剂NaA102，结果发现絮凝效果优于其他絮凝剂，而且更有利于下游工艺的顺利进行。经活性炭脱色后用聚丙烯膜超滤，有效提高蛋白酶液澄清度，提高液体酶商品性状。每个浓縮工艺阶段酶的回收率都维持在较高的水平，絮凝离心、脱色过滤和超滤浓縮工艺酶的回收率分别达到96.4%、90.3%和96.1%，最终整个工艺流程的总回收率为83.6%(见下表l)，明显高于采用传统工艺流程时碱性蛋白酶的回收率，而且浓縮酶液澄清透明、色泽金黄。表l提取流程中酶活力检测<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>发酵液经过絮凝离心、脱色过滤和超滤浓縮处理后所得酶液进行SDS-PAGE分析，可以看出酶液经过上述工艺处理后得到了浓縮，而且杂蛋白减少，碱性蛋白酶得到了纯化。有益效果本发明针对目前国内碱性蛋白酶的现状，对高产碱性蛋白酶的提取工艺进行研究，建立了液体蛋白酶浓縮提取工艺0.1%NaAlO2絮凝剂在pH8.0时絮凝速度快、效果好；1%中型颗粒活性碳脱色效果明显；聚丙烯膜超滤温度10°C、压力0.05MPa时酶的回收率最高。优化后的工艺使初始发酵液浓縮了8.3倍，酶回收率达到83.6%。浓縮酶液澄清透明，色泽金黄，杂蛋白减少。因此，确定适宜的提取工艺流程发酵液—絮凝—离心—活性炭脱色—纸板过滤—超滤浓縮，为大规模工业化生产奠定了基础，具有较大经济效益。权利要求1、一种高产碱性蛋白酶的提取工艺，采用了离心、絮凝、脱色、超滤，纸板精滤等提取工艺2、根据权利要求1所述高产碱性蛋白酶的提取工艺，其特征是:发酵液的絮凝采用NaA102，用量0.08-0.15%。3、根据权利要求1所述高产碱性蛋白酶的提取工艺，其特征是:发酵液絮凝的最佳PH值为7.5-8.5。4、根据权利要求1所述高产碱性蛋白酶的提取工艺，其特征是:酶液脱色采用中型颗粒活性碳进行，用量为0.8-1.2%。5、根据权利要求1所述高产碱性蛋白酶的提取工艺，其特征是:超滤浓縮采用聚丙烯膜超滤，操作温度8-15'C、压力0.05Mpa。6、根据权利要求1所述高产碱性蛋白酶的提取工艺，其特征是:提取工艺路线为发酵液—絮凝—离心—活性炭脱色—纸板过滤—超滤浓縮。全文摘要一种高产碱性蛋白酶浓缩酶的提取工艺，为了获得高质量浓缩液体蛋白酶，对提取工艺中不同絮凝剂，不同大小活性炭以及膜过滤条件进行了优化。优化后的工艺使初始发酵液浓缩了8.3倍，酶回收率达到83.6％。浓缩酶液澄清透明，色泽金黄，杂蛋白减少。确定适宜的提取工艺流程发酵液→絮凝→离心→活性炭脱色→纸板过滤→超滤浓缩。文档编号C12N9/52GK101392243SQ20081015288公开日2009年3月25日申请日期2008年11月7日优先权日2008年11月7日发明者靓刘,刘敏尧,张长霞,殷向彬申请人:天津市诺奥科技发展有限公司