专利名称：：一种鉴定全叶延胡索的方法
技术领域：
：本发明属于利用分子生物学方法鉴定全叶延胡索的
技术领域：
，具体地说，是涉及一种鉴定全叶延胡索的核苷酸序列、核酸分子探针和方法。
背景技术：
：元胡是著名中药"浙八味"中的一味，目前一般元胡正品指延胡索(Cbo^ato)，此外同属的一些其它植物在一些地区亦代替元胡入药，但价格和药效均与元胡有较大差别。其中全叶延胡索为最常见的代替品和原材料市场上的混淆品。目前，中药材种植上存在品种混乱问题，原材料市场上存在品质优劣问题。仅仅依靠传统的形态分析已不能进行品种的科学鉴定和种源的遗传分析。但是还没有一种可靠有效的方法可以将全叶延胡索与延胡索区分开来，解决药材道地性问题。近年来，随着中药现代化步伐的加快，中药的标准化已成为中药产业发展和打入国际市场的瓶颈。药用植物或植物药的发展离不开标准化生产，即0前大力推行的GAP(GoodagriculturingPractice,中药材生产质量管理规范)工作的核心。而种(品)质的标准及科学的鉴定方法是质量标准控制和管理的前提。迄今为止，国际上有关延胡索植物化学、药用价值等方面的研究已有不少报导，但是尚未见有关延胡索药材道地性DNA快速鉴定的技术的研究报导。因此，有必要在DNA分子标记水平采用新方法新技术快速将延胡索的最常见混淆品全叶延胡索从中鉴定出来，解决中草药种植上品种混乱和原材料市场上品质优劣等问题。
发明内容本发明的目的是提供一种鉴定全叶延胡索的核苷酸序列，该序列来源于ISSR通用引物UBC836扩增所得的全叶延胡索特异性核苷酸序列，具体序列为SEQNO1:caaaagaggaaBgttggtgttcatatagcacaagacaatgaagatgaagaggattatatgggtgtagggcctctgaatgaaaagctcgagaaggaaaagttgaagaatagtggggaactcgatgcatattaggagcccacagattctgaaagtgaagatgatgagagattctcatctgatgagttgaagaaacgatcggatgagttcgagaagaagttcaaactgcacgaagagttgcttaagaacttcactgatgtcggtaatggatctacatttctgtttaa犯cttg3agcatattttcataaataaattgaacaaatccatatacagaactatactgtgtttgcttttcatgaacttctttaattgggtgggttccctttgttgtatctttttttctcctgatatgaactctcagtatgggctttatatcaaatggagaattgtgatttaatttgcatagcttttcccatttggattggtttattactttagttctccaacattaatcgctaaacaatctaaactgatgcatttttctccactttac。核酸分子探针禾口方法
技术领域：
：本发明的另一个目的是提供全叶延胡索专一性核酸分子探针，该核酸分子探针来源于所述的SEQNO1核苷酸序列中的1段或2段23或20个核苷酸的长的寡核苷酸序列或它们的互补序列；或者是上述这些序列经修饰、变化，且其核苷酸变化量不超过10%的序列。核酸分子探针的核苷酸序列为R印ens31:5，-gcatcagtttagattgtttagcg-3，或Repens32:5，-tatgggtgtagggcctctga_3'或者为R印ens31禾口R印ens32。本发明的再一个目的是鉴定全叶延胡索的方法，是采用PCR方法，以所述的核酸分子探针为PCR引物，进行PCR反应，其步骤和过程按常规PCR方法进行。所说的核酸分子探针为R印ens31和R印ens32。本发明的有益效果是1)样品用量少，仅需少量样品就可以完成整个操作。2)准确、灵敏度高，R印ens31/R印ens32为全叶延胡索的专一性分子探针，若为延胡索，为阴性反应。由于本发明所提供的核酸分子探针为全叶延胡索专一性探针，因此，在样品种源未知的情况下，可以通过检测样品中是否存在该段寡核苷酸序列，鉴定出其是否为全叶延胡索，为延胡索药材道地性的鉴定提供了客观、快速、准确的方法，解决了药材市场上全叶延胡索和延胡索混杂的问题。图l是采用ISSR引物UBC836进行PCR扩增的电泳图(a所指的条带是全叶延胡索特有的条带，分子量为600bp左右)；图中l-6为栽培延胡索，7-11为野生延胡索，12-16为全叶延胡索。M:分子量。图2是采用全叶延胡索专一性核酸分子探针R印ens31和R印ens32对全叶延胡索进行检测的PCR扩增电泳图；M:分子量。图3是采用全叶延胡索专一性核酸分子探针R印ens31和R印ens32对延胡索进行检测的PCR扩增电泳图；M:分子量。具体实施方法本发明可以从遗传本质上客观准确地鉴定全叶延胡索。具体包括l.提供用于全叶延胡索鉴定的DNA片段；2.提供来源于上述DNA片段的全叶延胡索专一性核酸分子探针；3.提供利用上述核酸分子探针鉴定全叶延胡索的方法。在采用ISSR分子标记研究延胡索和全叶延胡索遗传多样性时发现，ISSR通用引物UBC836扩增的带型中，全叶延胡索有特异性条带，能将其与延胡索区别开。因此，可根据此特异性条带合成专一性的核酸分子探针，建立快速、准确鉴定全叶延胡索的分子生物学方法，用于延胡索药材道地性的检测。本发明提供的用于鉴别全叶延胡索的核苷酸序列来源于采用ISSR通用引物UBC836扩增所得的全叶延胡索的特异性序列，该序列的结构特征如序列表中的序列1(<210〉1)所示。该序列(<210〉1)可通过如实施例l所述的方法得到；或者按已知的该序列核苷酸组成与排列，在商业化的DNA自动合成仪上按常规方法合成而得到。本发明的全叶延胡索专一性核酸分子探针是以上述全叶延胡索特异性核苷酸序列为基础，利用PrimerPrimer5.0(VinaySingh,1998)软件设计得出。该分子探针为全叶延胡索特异性核苷酸序列中的1段或2段23或20个核苷酸组成的寡核苷酸序列，或它们的互补序列；或者是上述这些序列再经修饰、变化，且其核苷酸变化量不超过总核苷酸量的10%的序列。。本发明的上述全叶延胡索专一性核酸分子探针为序列表中〈210〉2和<210〉3所示的序列(分别简称为R印ens31和R印ens32)。本发明的上述全叶延胡索专一性核酸分子探针，可按照预先根据全叶延胡索特异性核苷酸序列设计好的序列，通过常规的DNA合成方法合成而得到(例如可以使用商业化的DNA自动合成仪进行合成)。本发明的上述全叶延胡索专一性核酸分子探针，具有极高的专一性，能与全叶延胡索专一性反应，但不与延胡索的DNA发生反应。所以，利用该核酸分子探针，通过PCR方法可以快速、准确地鉴别全叶延胡索。本发明所提供的全叶延胡索的鉴定方法，可采用PCR方法以前面所述的本发明的核酸分子探针(优选为R印ens31和R印ens32)为PCR引物，进行PCR反应。具体步骤和过程按常规PCR方法的操作进行按照经过优化的PCR体系逐一将样品加入PCR管中，放入PCR仪器，采用经过优化的PCR程序进行PCR扩增。采用该PCR方法可快速、准确地检测鉴定全叶延胡索，而且样品用量少。由于本发明所提供的核酸分子探针为全叶延胡索专一性探针，因此，在样品种源未知的情况下，可以通过检测样品中是否存在该段寡核苷酸序列，鉴定5出其是否为全叶延胡索，为延胡索药材道地性的鉴定提供了客观、快速、准确的方法，解决了药材市场上全叶延胡索和延胡索混杂的问题。序列表中的<210〉1序列是全叶延胡索特异性核苷酸序列，其中带下划线的部分(18-40bp和476-495bp)分别为本发明的全叶延胡索专一性寡核苷酸分子探针R印ens31和R印ens32。本发明结合附图和实施例作进一步的说明。实施例l:全叶延胡索特异性核苷酸序列的制备1.基因组DNA的提取采用改良CTAB法(Doyle,1991)提取叶片基因组DNA。步骤如下(1)取约0.05克的硅胶干燥叶片，加入少量PVP粉，置入磨样管中，用BIO101磨样机研磨，SPEED4.0,TIME20s。(2)迅速加入65。C预热的2XCTAB提取缓冲液(含2。/。b-巯基乙醇)800一1000ul，摇均后转入5ml离心管中，再用800—1000ul2XCTAB清洗磨样管，转入同一个5ml管中，65。C水浴30分钟。(3)冷却至室温，加等体积的氯仿异戊醇(24:1)，混合均匀(缓慢颠倒)15-30分钟，室温10000rpm离心10—15分钟。(4)吸取上层水相，加入1/10体积的10%CTAB，轻轻混匀，再加入等体积的氯仿异戊醇(24:1)抽提，重复步骤(3)。(5)吸取上层水相，加入0.5体积的5MNaCl混匀，再加入等体积-2(TC预冷的异丙醇，轻轻摇匀，于放置2小时或过夜。(6)10000rpm离心10min，使DNA附着离心管管底，弃水相。(7)加75%乙醇浸洗2-3次，用无水乙醇清洗一次，去乙醇，风干。(8)用适量O.lxTE溶解DNA沉淀，-20"保存备用。2.ISSR--PCR用ISSR通用引物UBC836进行PCR扩增，扩增体系如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>PCR产物电泳结果见图1，a所指的条带(分子量为600bp左右)是采用ISSR引物UBC836进行PCR扩增时寻找到的全叶延胡索特有的条带。图1显示，全叶延胡索在分子量600bp左右均有条带出现，而延胡索在分子量600bp左右没有条带出现。因此，此条带即为全叶延胡索的特有条带。3.序列测定PCR结束后，PCR产物用2%的琼脂糖凝胶电泳，对只在全叶延胡索中出现的特异性ISSR片段进行切胶，采用PCR产物纯化试剂盒(Sangon，Shanghai,China)回收纯化所切片段。然后将所纯化的DNA片段连接到PUCm-T载体(Sangon，Shanghai,China)上，转化到大肠杆菌感受态细胞中。目的片段采用引物M13+/-于商业化的DNA自动测序仪上测定，得到如序列表中〈210〉1序列所示的核苷酸组成与排列。实施例2:全叶延胡索专一性核酸分子探针R印ens31和R印ens32的制备在获得全叶延胡索特异性核苷酸序列的基础上，利用PrimerPrimer5.0(Vi呵Singh，1998)软件设计，得出R印ens31和R印ens32(分别为序列表中〈400〉1所示的18-40bp和476-495bp)的核苷酸组成与排列是用于鉴定全叶延胡索的良好寡核苷酸片段。根据R印ens31和R印ens32的核苷酸组成的排列(序列表中〈210〉2和〈210〉3序列所示的核苷酸组成与排列)，在DNA自动合成仪上合成得到。实施例3:全叶延胡索的鉴定(常规PCR方法)1、DNA的提取采用改良CTAB法提取植物总DNA。2、PCR反应体系为<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>3、PCR操作取2个0.5毫升PCR管，按照步骤2分别加入22.5微升PCR混合液，然后一管加入DNA2.5微升，另一管加入2.5微升PCR混合液(对照)，放于PCR仪上，按下列程序进行PCR反应<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>PCR扩增结果用含有0.1%EB的1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。电泳结果参见图2和图3。图2显示，全叶延胡索在分子量600bp左右均有条带出现，图3显示延胡索在分子量600bP左右没有条带出现。表明采用R印ens31和R印ens32进行PCR检测，若样品中含有全叶延胡索则为阳性反应，反之则为阴性反应(无PCR扩增带)，说明了R印ens31和R印ens32引物的专一性。<110>浙江大学<120>—种鉴定全叶延胡索的方法<60>3<210>1<211>551<212>DNA<213>全叶延胡索(Corydalisr印ensMandletMuehld)<400>1caaaagaggaaagttggtettcatategcacaagacaateaagatgaagaggattatatg60ggtgtagggcctctgaatgaaaagctcgagaaggaaaagttgaagaatagtggggaactc120gatgcatattaggagcccacagattctgaaagtgaagatgatgagagattctcatctgat180gagttgaagaaacgatcggatgagttcgagaagaagttcaaactgcacgaagagttgctt240aagaacttcactgatgtcggtaatggatctacatttctgtttaaaacttgaagcatattt300tcataaataaattgaacaaatccatatacagaactatactgtgtttgcttttcatgaact360tctttaattgggtgggttccctttgttgtatc賺ttctcctgatatgaactctcagt420atgggctttatatcaaatggagaattgtgatttaatttgcatagc加cccatttegat480tggtttattactttagttctccaacattaatcgctaaacaatctaaactgatgcattttl540ctccactttac551<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>2gcatcagtttagattgtttagcg23<20>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3tatgggtgtagggcctctga20权利要求1.一种鉴定全叶延胡索的核苷酸序列，其特征是具有SEQNO1的序列，该序列来源于ISSR通用引物UBC836扩增所得的全叶延胡索特异性核苷酸序列。2.—种以权利要求1的核苷酸序列为基础而设计的全叶延胡索专一性核酸分子探针，其特征是该核酸分子探针来源于权利要求1所述核苷酸序列中的1段或2段23或20个核苷酸的长的寡核苷酸序列或它们的互补序列；或者是上述这些序列经修饰、变化，且其核苷酸变化量不超过10%的序列。3.根据权利要求2所述的核酸分子探针，其特征是其核苷酸序列为Repens31:5，-gcatcagtttagattgtttagcg-3'或Repens32:5'-tatgggtgtagggcctctga-3'或者为Repens31禾卩Repens32。4.一种用权利要求2或3所述的核酸分子探针鉴定全叶延胡索的方法，其特征是采用PCR方法，以权利要求2或3所述的核酸分子探针为PCR引物，进行PCR反应，其步骤和过程按常规PCR方法进行。5.按照权利要求4所述的方法，其特征是所述的核酸分子探针为权利要求3所述的Repens31禾QRepens32。全文摘要本发明公开了一种鉴定全叶延胡索的核苷酸序列、核酸分子探针和方法。属于利用分子生物学方法鉴定全叶延胡索的
技术领域：
。本发明提供了全叶延胡索(Corydalisrepens)的特异性核苷酸序列及来源于该序列的核酸分子探针，以及利用该探针鉴别全叶延胡索的方法。本发明鉴别方法所用的样品量少，仅需少量样品就可以完成整个操作，鉴别准确、灵敏度高，为延胡索药材道地性的鉴定提供了客观、快速、准确的方法，解决了药材市场上全叶延胡索和延胡索混杂的问题。文档编号C12N15/11GK101440401SQ200810163138公开日2009年5月27日申请日期2008年12月18日优先权日2008年12月18日发明者傅承新,敏宗,赵云鹏,川陈,陈炳龙申请人:浙江大学