除草剂的新靶标和对所述的除草剂有抗性的转基因植物的制作方法

专利名称：除草剂的新靶标和对所述的除草剂有抗性的转基因植物的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有arogenate脱氢酶活性的新酶，具体是植物arogenate脱氢 酶，还涉及编码这些酶的基因。本发明的arogenate脱氢酶催化酪氨酸生物合成 代谢途径的最后一步，由于这一点，构成除草剂的潜在靶标。因此，本发明还涉 及鉴定以这些酶为靶酶的除草剂化合物的方法，所述的除草剂化合物通过附着所 述的酶而防止酪氨酸的生物合成。本发明也涉及以参与酪氨酸生物合成途径的酶 为靶酶，特别是以参与预苯酸转变成L-酪氨酸的酶为靶酶，具体是以arogenate 脱氢酶为靶酶的除草剂化合物具有耐受性的转基因植物。这些植物成为耐受性是 由于在植物组织中表达了预苯酸脱氢酶，此酶对所述的除草剂不敏感并使植物即 使在用所述除草剂化合物处理后仍能合成酪氨酸。
背景技术：
芳香族氨基酸的生物合成途径桅了植物、细菌和真菌必需的代谢途径。除了 生物合成酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸外，这个代谢途径在产生许多次级芳香代谢 产物的过程中，包括诸如植物-微生物相互作用，结构性生物高聚物如木质素和软 木脂生物合成、激素合成、或苯醌合成中都起着非常重要的作用。在具有此代谢 途径的所有生物中，已鉴定到两条预苯酸转变成酪氨酸的途径(图1; Stenmark等， 1974).在大部分含有叶绿素的细菌， 一些微生物和大部分植物中，L-酪氨酸是通 过arogenate合成途径合成的(Abou-Zeid等，1995; Byng等，1981; Co匿ly和 Conn 1986; Frazel和Jensen 1979; Gaines等，1982; Hall等，1982; Keller 等，1985; Mayer等，1985).在此途径中，预苯酸通过一种特殊的转氨酶预苯酸 转氨酶(EC 2. 6. 1. 57)转氨而形成arogermte，然后arogenate通过arogenate脱 氢酶(EC 1.3. 1.43;图1 ADH)转变成L-酪氨酸。以不同的方式，在生物体中如大 肠杆菌或酵母中，预苯酸起初是通过预苯酸脱氢酶(EC 1.3. 1.12， EC 1.3. 1.13)转变成p-羟苯基-丙酮酸，然后p-羟苯基-丙酮酸再转氨成为L-酪氨酸(Lingens等， 1967)。由于其在植物的酪氨酸生物合成途径中的作用，arogenate脱氢酶构成了 新除草剂的一个潜在耙标。
参此代谢途径的其它酶也构成除草剂的主要靶标。例如，可提及的有参与预 苯酸合成途径上游的5-炳烯醇-草莽酸3-磷酸合成酶(EPSPS)，它是所有除草剂草 甘膦的靶酶。还可提及的有参与P-羟苯基丙酮酸转变成尿黑酸的P-羟苯基丙酮酸 双加氧酶(HPPD)。 HPPD是除草剂新家族的靶酶，它的作用导致叶子漂白(Schulz 等，1993; Secorl994)。这些除草剂具体是异唑(EP 418 175， EP 470 856， EP 487 352， EP 527 036， EP 560 482， EP 682 659， US 5 424 276),特别是isoxaf lutole, 一种选择玉米的除草剂;二酮腈(EP 496 630， EP 496 631)具体是2-氰-3-环丙基 -卜(2-S02CH3-4-CF3苯基)丙垸-1，3- 二酮 和 2-氰-3-环丙基 -1-(2-S02CH3-4， 2, 3-Cl2苯基)丙垸-1, 3-二酮;三酮类(EP 625 505， EP 625 508， EP 5，506，195)，特别是sulcotrione或中三酮，或其它的二氢化吡唑类。
以植物必需的代谢途径中的酶为靶酶的除草剂的一个优点，是它们对远亲缘 性植物具有广谱活性。然而，当这些除草剂应用于农作物以除去不需要的植物或
"杂草"时，它们的主要缺点是也作用于种植物。。这个缺点可以通过种植对所述 除草剂有耐受性的植物而得到克服。这些植物通常通过遗传工程获得，即在它们 的基因组中引入编码对所述除草剂有抗性的一种酶的基因，以此方式这些植物在 其组织中过量表达所述的酶。迄今为止，有三种主要运用遗传工程技术的策略得 到应用以使植物对除草剂产生抗性。第一种包括通过用编码一解毒酶的基因转化 植物使之能解毒除草剂。此酶把除草剂或其活性代谢产物转变成没有毒性的降解 物，例如，对bromoxynil或是对basta有耐受性的酶(EP 242 236， EP 337 899)。 第二种策略包括用编码经某种方式突变而对除草剂或其活性代谢物不大敏感的靶 酶的基因转化植物，例如，对草甘膦有耐受性的酶(EP 293 356, Padgette S. R. 等，J.Biol.Chem. ， 266， 33， 1991).第三种策略包括过量表达敏感的靶酶以至于 在植物体中产生大量的靶酶，如果可能的话产生远大于进入植物中的除草剂的量。 采用此策略曾成功的得到了对HPPD抑制剂有耐受性的植物(WO 96/38567)，使得 即使其抑制物存在时也可能维持足量水平的功能性酶。
存在着分类学不同分级的两种L-酪氨酸生物合成途径，尤其是植物中还没有 发现将预苯酸直接转变成p-羟苯基丙酮酸的途径，这些事实使得可能设想第四种 使植物耐受除草剂的策略。具体说，在使用以植物中的arogenate脱氢酶为靶酶
9的除草剂化合物时，有目的地用细菌或酵母预苯酸脱氢酶的编码基因转化植物， 将能使所述植物合成L-酪氨酸而产生耐受性，因此即使所述除草剂化合物能抑制 arogenate脱氢酶，所述植物仍对除草剂化合物有耐受性。因此这种新策略包括通 过走到用arogenate胱氢酶的酪氨酸生物合成天然代谢途径的一个旁路，在植物 中有目的制造对除草剂的抗性，方法是人为地在这些植物中植入踟氨酸生物合成 中利用预苯酸脱氢酶一种新的代谢途径。拥有此旁路的植物宜为农业植物，特别 是杂草，将对所述除草剂化合物敏感。

发明内容
本发明因此涉及编码具有arogenat脱氢酶活性的酶的新分离的多聚核苷酸。 按照本发明，术语"多聚核苷酸"意指天然或人造的核苷酸序列，可以是DNA或 RNA类型，更好的是DNA类型，特别是双链DNA。"有arogenate脱氢酶活性的酶" 这种表达方式意指此酶能将arogenate转变成L-酪氨酸。Arogenate脱氢酶的活 性可以通过检测arogenate底物量的减少，或是通过检测酶反应产物即L-酪氨酸 或辅因子NADPH的积累等方法进行测量。具体讲，可用实施例4所描述的方法检 测arogenate脱氢酶活性。
按照本发明的一个具体实施方案，编码arogenate脱氢酶的多聚核苷酸包括 编码选自序列身份号SEQ ID N0:3， SEQ ID N0:5， SEQ ID N0:7， SEQ ID N0:9， SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 13的多肽序列的多聚核苷酸。本领域技术人员熟知此
定义包括编码相同的氨基酸序列的所有多聚核苷酸尽管有由于遗传密码子的简并 性可导致核苷酸序列不同，这些氨基酸序列由序列号SEQ ID N0:3， SEQ ID N0:5， SEQ ID N0:7， SEQ ID N0:9， SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 13为代表。
本发明还包括编码arogenate脱氢酶选择性与上述多聚核苷酸之杂交的，或 组成探针的这些多聚核苷酸的分离的多聚核苷酸。按照本发明，"能选择性杂交的 多聚核苷酸"含义是指该多聚核苷酸以本领域溶胀的方法(Sambrook等，1989，分
子克隆实验操作手册，Nolan C.编，纽约冷泉港实验室出版社)，与上述多聚 核苷酸杂交或与其衍生的探针杂交，产生的信号水平比背景噪音要强得多。背景 噪音的产生可能与其它存在的多聚核苷酸，例如cDNA文库中存在的其它cDNA杂 交有关。由于能选择性杂交的多聚核苷酸与本发明上述序列号SEQ ID NO所定义
的多聚核苷酸或探针之间的相互作用而产生的信号水平通常要比与产生背景噪 音的其它DNA序列相互作用产生的强10倍，更好是100倍。此种相互作用的水平可以通过，例如，用诸如，等放射性元素标记的上述多聚核苷酸或探针进行测量。
选择性杂交通常可用非常严格的培养条件(例如大约50°C-60°C 0.03MNaCl和 0.03M柠檬酸钠)获得。
本发明还包括编码arogenate脱氢酶的分离的多聚核苷酸和上述多聚核苷酸 的同源物。按照本发明，术语"同源物"含义是与上述核苷酸序列相比有一处或 多处序列修饰的和编码具有arogenate脱氢酶活性的酶的多聚核苷酸。这些修饰 可以是天然的或通过溶胀的突变技术导致加入，去除或置换本发明序列中的一个 或多个核苷酸人为获得的。这些修饰决定了与上述序列的同源性程度。有利的是， 与上述序列相比同源性程度将至少为70%，优选至少80。/。，更优选至少90%。检测
和鉴定核苷酸序列之间同源性的方法是本领域技术人员所熟知。例如，可以采用 PILEUP或BLAST程序(Basic Local Alignment Search Tool; Altschul等，1993， J. Mol. Evol. 36:290-300; Altschul等,1990，丄Mol. Biol. 215:403-10;也可以见 http:〃www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)。
本发明还涉及上述多聚核苷酸的片段关。术语"片段"具体表示至少20个核 苷酸，至少50个核苷酸，优选至少100个核苷酸片段。
按照本发明一项具体实施方案，本发明的多聚核苷酸由序列身份号SEQ ID NO:l， SEQ ID N0:2， SEQ ID N0:4， SEQ ID N0:6， SEQ ID N0:8， SEQ ID NO:IO 或SEQ ID NO: 12所代表。
本发明还涉及至少包括上述一条多聚核苷酸的诸多聚核苷酸。
所有的上述多聚核苷酸编码arogenate脱氢酶。因此，本发明扩充至所有编 码arogenate脱氢酶的所有多聚核苷酸。
按照本发明的一具体实施方案，arogenate脱氢酶是一种酶，其多肽序列选 自序列身份号SEQ IDN0:3、 SEQIDN0:5、 SEQIDN0:7、 SEQIDN0:9、 SEQIDNO:ll 或SEQ ID NO: 13的序列，或这些序列的片段。术语"片段"含义指必需有生物活 性的片段，如arogenate脱氢酶中的具有与完整arogenate脱氢酶相同活性的片 段。
按照本发明的一具体实施方案，上述的多聚核苷酸和arogenate脱氢酶来源 于植物。更具体说，它们来源于拟南芥属植物，优选A^^i'朋s属，或者来源于 尸icea，属，优选尸icea ^/s"ca属植物。
按照本发明的另一特定实施方案，上述的多聚核苷酸和arogenate脱氢酶来 源于细菌。更具体说，它们来源于^777ec力oc/s"s属细菌。本发明还涉及含有功能上相互连接的在宿主中有功能的一个启动子， 一个编 码本发明所定义的arogenate脱氢酶的多聚核苷酸以及一个在同一宿主中有功能 的终止子元件的嵌合基因。首先，此嵌合基因可以包含的各种不同的元件是调控 转录、翻译和蛋白质成熟的元件，如启动子，编码一信号肽或转运肽的序列，或 组成多聚腺苷酸信号的终止子元件；其次，可包含编码一蛋白质的多聚核苷酸。 "功能上相互连接"，含义是所述嵌合基因中的元件相互连接的方式使这些元素中 一个的作用是受到另一个的影响。例如，当启动子与一编码序列功能上相连时它 就能影响所述编码序列的表达，本发明嵌合基因的构建以及其各种元件的装配可 以采用本领域技术人员所熟知的技术，特别是Sambrook等，(1989，分子克隆实 验操作手册，Nolan C.编，纽约冷泉港出版社)所描述的技术进行。选择组成该 嵌合基因的调控元件必须是能在宿主中发挥功能的，本领域技术人员有能力选择 那些在某给定宿主生物中发挥功能的调控元件。术语"能发挥功能的"含义是能 在某给定的宿主中发挥作用。
本发明嵌合基因的启动子包括组成型或可诱导型启动子。本发明的组成型启 动子是能诱导编码序列在宿主的所有组织中表达的并在所述宿主生物的整个生命 周期中表达的启动子。这些启动子中的一些可以是组织特异性的，如持续地表达 该编码序列，但仅是在宿主生物的特定组织中。组成型启动子可来源于任何类型 的生物。在可用于本发明的嵌合基因的组成型启动子中，例如，可提及的有细菌 启动子，如羧乙基精氨酸合成酶基因的启动子或胭脂碱合成酶基因的启动子，或 可提及的有病毒启动子，如花椰菜镶嵌病毒的控制19S RNA或35S RNA转录的基 因的启动子(Odell等，1985， Nature, 313, 810-812)，或是木薯叶脉镶嵌病毒的启 动子(专利申请TO 97/48819有所描述)。在来源于植物的启动子中，可提及的有 核酮糖二羧化酶/加氧酶(RuBisC0)的小亚基基因的启动子，专利申请EP 0 507 698 中所描述的组蛋白基因的启动子，或稻米肌动蛋白基因的启动子(US 5， 641， 876)。
按照本发明的另一特定实施方案，此嵌合基因包括一个可诱导型启动子。可 诱导型启动子，是只有当其自身被一种诱导剂诱导时，才能起作用，即才能诱导 某编码序列表达的启动子。这种诱导剂通常是一种在所述生物受到某种外部刺激 后可以在宿主生物体内合成的物质，这种外部刺激可能是，例如病原因子。这种 诱导剂也可以是一种对于宿主而言是外部的，但能穿透进入宿主生物体内的物质。 有利地是，本发明所用的启动子在病原因子攻击宿主生物后成为可诱导的启动子。 这些已知的启动子是专利申请FR 99 03700所描述的植物0-甲基转移酶II类(C0MT
12II)基因的启动子，拟南芥PR-1启动子(Lebel等，1998， Plant J. 16(2) :223-233)， 烟草倍半萜烯合成酶基因的EAS4启动子(Yin等，1997， Plant Physiol. 115(2): 437-451)，或是编码3-羟基-3甲基-戊二酸辅酶A还原酶基因的启动子(Nelson 等，1994， Plant Mol. Biol. 25(3) :401-412)。
可用于本发明嵌合基因的终止子元件中，可提涉及的如编码根瘤出杆菌胭脂 碱合成酶的基因的刀"终止子元件(Beven等，1983， Nucleic Acids Res. 11(2)， 369-385)，或者专利申请EP 0 633 317中所描述的组蛋白基因的终止子元件。
对于此嵌合基因另外包含一信号肽或一转运肽看来也是重要的，这使得能控 制和导向arogenate脱氢酶的产物运送到宿主生物的某一部分，如细胞质或细胞 膜，细质质的某特定腔室和植物中的某特定类型的细胞腔室，如叶绿体，或细胞 外基质中。
转运肽可以是单体或是双体。双聚体转运肽可任选地用一间隔序列分开，例 如，它们以转录方向包括编码位于质体中一种酶的植物基因的转运肽，编码位于 质体中一种酶的植物基因的成熟N-端部分的序列，以及编码位于质体中一种酶的 植物基因的第二转运肽的序列。例如，这些双体转运肽在专利申请EP 0 508 909 中有所描述。
本发明所用信号肽可提及的包括，当需将本发明的嵌合基因导入植物细胞或 植物中时，具体是Cornelissen等所描述的烟草PR-1 a基因的信号肽(1987， Nucleic Acid Res. 15,6799-6811),或当需将本发明的嵌合基因导入酵母中时，为 Mat a 1因子前体的信号肽(Brake等，1985， In: Gething M.-丄(编)；蛋白运输 和分泌，第103-108页，冷泉港出版社，纽约)。
本发明还涉及含有本发明嵌合基因的载体。本发明的载体可用于转化宿主生 物以及在该宿主生物中表达arogenate脱氢酶。此载体可以是质粒、粘粒、噬菌 体或病毒。总体上，此载体的主要特点应是能在宿主生物细胞中持续存活并能自 身复制，特别是由于存在复制起点而能表达arogenate脱氢酶。这种载体的选择 和将其插入本发明嵌合基因中的技术在Sambrook等所编写的书中(1989，分子克 隆实验操作手册，Nolan C.编，纽约，冷泉港出版社)有广泛的描述，且是本 领域技术人员所具有的一般知识的一部分。有利的是，本发明所使用的载体除了 含有本发明嵌合基因之外，还包括编码选择性标记物的基因。此选择性标记物使 得可能选出受到有效转化的宿主生物，如那些掺入了所述载体的生物。按照本发 明的一具体实施方案，受转化的宿主生物是微生物，具体是酵母、细菌、真菌或病毒。根据另一项具体实施方案，此宿主生物是植物或植物细胞。在编码可以使 用的选择性标记物的基因中，可提及的有抗生素抗性基因，如潮霉素磷酸转移酶
(Gritz等，1983， Gene 25:179-188)，但有对除草剂抗性基因，如对bialaphos 耐受的6,基因(White等，NAR 18:1062,1990)，对草甘膦耐受的EPSPS基因 (US5， 188， 642)或还有对异口恶唑耐受的HPPD基因(W0 96/38567)。还可提及的有 编码容易鉴定的酶如GUS酶的基因，或编码色素的基因，或编码在转化细胞中调 控色素产量的酶的基因。这些选择性标记物基因具体是在专利申请WO 91/02071， W0 95/06128， W0 96/38567和W0 97/04103中有所描述。
本发明还涉及上述含有载体的已转化过的宿主生物。术语"宿主生物"含义 是可引入本发明嵌合基因产生arogenate脱氢酶的任何低等或高等单细胞或多细 胞生物。它们具体是细菌如大肠杆菌；酵母菌特别是酵母菌属，克鲁维酵母属或 毕赤属酵母菌；真菌特别是贡霉菌杆状病毒、或优选植物细胞和植物。
按照本发明，术语"植物细胞"含义是任何从植物中获得的和能形成非分化 组织如愈伤组织，分化组织如胚胎组织的细胞，植物的一部分，植物或种子。
按照本发明，术语"植物"的特定含义是任何有能力进行光合作用的已分化 的多细胞生物，特别是单子叶植物或双子叶植物。
术语"已转化的宿主生物"含义是其基因组中掺入了本发明嵌合基因并随后 在其组织中或其培养基中产生arogenate脱氢酶的宿主生物。本领域技术人员能 按照本发明采用许多已知的转化方法中的一种来获得此种宿主生物。
这些方法中的一种包括使待转化的细胞与本发明的载体和聚乙二醇接触 (Chang and Cohen, 1979， Mol.Gen. Genet. 168(1) ， 111-115); Mercenier和Chassy， 1988， Biochimie 70(4)， 503-517).电穿孔是另外一种方法，它包括将待转化的 细胞或组织和本发明的载体置于电场中(Andreason and Evans ， 1988 ， Biotechniques6(7) ，650-660 ;ShigekawaandDower ，1989 ， Aust. J. Biotechnol. 3(1) ， 56-62).另一种方法包括通过显微注射方法把该载体直 接注射入宿主细胞或组织中(Gordon and Ruddle, 1985， Gene 33(2)， 121-136). 有利的是，可以使用"生物弹击(biolistic)"方法。包括用其上吸附有本发明 载体的粒子轰击细胞或组织(Bruce等，1989， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(24), 9692-9697; Klein等，1992， Biotechnology 10(3) ， 286-291;美国专利 号4,945,050)。优选的是，植物转化将釆用农杆菌属的细菌来进行，更为适宜的 是，可以通过用^//ffe/a"朋s农杆菌(Knopf ， 1979， Subcell. Biochera. 6， 143-173;Shaw等，1983， Gene 23 (3) :315-330)或r力hc^e77es农杆菌(Bevan和Chilton， 1982， Annu. Rev. Genet. 16:357—384 ; T印fer and Casse—Delbart ， 1987， Microbiol. Sci.4(l)，24-28)感染所述植物的细胞或组织.优选的是，用农杆菌 ^/历e/sciey^进行植物细胞的转化可以参照Ishida等描述的方案(1996， Nat. Biotechnol. 14(6) ， 745-750)。
本领域的那些技术人员将能选择恰当的作为待转化宿主生物性能的方法。 本发明因此也涉及制备arogenate脱氢酶的方法，包括在合适的培养基中， 培养已转化的含有编码以上定义的arogenate脱氢酶基因的宿主生物，通过离心 或过滤回收培养基中产生的arogenate脱氢酶，然后使它至少通过一个层析柱以 纯化回收获得的酶的步骤。这些抽提和纯化步骤可以得到所有的或部分的 arogenate脱氢酶。优选转化的生物是微生物，特别是细菌、酵母、真菌或病毒。 本发明还包括鉴定以arogenate脱氢酶为靶酶的除草剂化合物的方法，其特 征如下
(a) 至少准备有两个样品，每一个在溶液中含有等量的arogenate脱氢酶；
(b) 其中的一个样品用化合物进行处理；
(c) 测定所述的每一个样品中的arogenate脱氢酶活性；
(d) 当步骤(c)处理过的样品检测的酶活性明显地比未处理过的样品低时， 可认定(b)步骤中所用的化合物是一种除草剂化合物。
(e) 在(d)步骤中所鉴定化合物的除草活性可以用所述化合物处理植物加 以验证。
按照本方法，arogenate脱氢酶活性可以通过任何能够检测arogenate底物 量的减少或能够检测该酶反应产物，即L-酪氨酸或辅因子NADTO积累的方法予以 测量。具体讲，arogenate脱氢酶活性的测量可以用实施例4中所描述的方法。此 外，本方法步骤(e)中验证的除草剂活性可能是致死性活性，导致处理过的植物死 亡，或是严重减缓处理过的植物的生长率。
按照本发明，术语"化合物"含义是任何的化合物或化合物的混合物，包括 多肽和蛋白质。按照本发明，术语"化合物的混合物"应理解为至少两种不同的 化合物，例如， 一种分子的立体异构体或二面异构体，从生物物质(植物、植物组 织、细菌培养物、酵母培养物或真菌培养物液、昆虫、动物组织等)的抽提物中得 到的天然来源的混合物，或未纯化的或完全的或部分纯化的反应混合物，或组合 化学技术得到的产物的混合物。按照本发明方法的一特定实施方案，所用的arogenate脱氢酶来自植物，优 选来自拟南芥。
按照本发明方法的另一特定实施方案，所用的arogenate脱氢酶来自细菌， 优选分"ec力。c"属细菌。
更为适宜的是，本发明方法中所用的arogenate脱氢酶是本发明的酶，具体 是SEQ ID N0:3， SEQ ID N0:5， SEQ ID N0:7， SEQ ID N0:9， SEQ ID NO:11或 SEQ ID N0:13所代表的那些酶。
本发明还扩展至用上面所提到的方法鉴定的除草剂化合物，特别是以 arogenate脱氢酶为靶酶的除草剂化合物，如那些能抑制此酶活性的除草剂。优选 除草剂化合物不是通用的酶抑制剂。还优选本发明的除草剂化合物不是已知的有 除草活性的化合物。
本发明也涉及含有作为活性物质的本发明除草剂化合物最低有效量的农用化 学组合物。
按照本发明，术语"农用除草化学组合物"含义是能够预防性或治疗性应用 于正在生长的或必定会生长的种植物区域的组合物，以防止不需要的植物或"种 子"在所述种植物区域发育生长，无论它们处于何种发育状态。本发明除草剂化 合物的有效量，相应于能够破坏或抑制不需要植物的生长的化合物量。
本发明的农用除草化学组合物包括本发明的除草剂化合物或其农业上可接受 的一种盐或此化合物的一种金属或非金属复合物，与农业上可接受的固体或液体 运载体或在农业上也可接受的表面活性剂组合而成。特别是，可使用通常的惰性 运载体和通常的表面活性剂。这些组合物不仅覆盖了那些用合适的装置，如喷洒 或撒粉装置易于施用于待处理的植物或种子的组合物，而且覆盖了可通过商业途 径获得的浓縮的组合物，这些组合物在用于农作物之前必须先进行稀释。
本发明的除草剂组合物也包括许多其它成分，如保护性胶体、粘合剂、增稠 剂、触变剂、穿透剂、稳定剂或鳌合剂。更为普通的是，这些活性物质可用常用 的配制技术与任何固体或液体添加剂相混合。
按照本发明，术语"运载体"表示一种与活性物质相混合后有利施用于植物 的天然或合成的、有机或无机物质。此种运载体因此通常是惰性的且必须是农业 上可接受的。此种运载体可以是固体(如粘土、天然或合成的硅酸盐、硅土、树脂、 蜡、固体肥料)或液体(如水、酒精、特别是丁醇)。
表面活性剂可以是一种乳化剂、分散剂或离子型或非离子型的润湿剂，或这些表面活性剂的混合物。例如，可提及的有聚丙烯酸盐、木质素磺酸盐、苯酚磺 酸盐或萘磺酸盐、环氧乙烷与脂肪酒精或与脂肪酸或与脂肪胺的多聚冷凝物，苯 酚的替代物(特别是垸基酚或芳香酚)，琥珀磺酸盐酯，牛磺酸衍生物(特别是烷基 牛磺酸)，己聚氧乙烯化的乙醇磷脂或苯酚磷脂，脂肪酸酯以及多羟基酯，和上述 含有硫酸盐、磺酸盐和磷酸盐功能的化合物的衍生物。当活性物质和/或惰性运载 体为非水溶性时和当应用的载体试剂是水时，通常必须有至少一种表面活性剂。
本发明还涉及把参与预苯酸转变成L-酪氨酸的一个代谢步骤的酶作为靶酶 的，除草剂化合物有耐受性的转基因植物，其特征在于，它们包含了编码预苯酸 脱氢酶的基因并在它们的组织中表达所述的酶。预苯酸脱氢酶是一种催化把预苯 酸变为P-羟基苯丙酮酸反应的酶。具有预苯酸脱氢酶活性的酶可以用任何能够测
量预苯酸底物量减少，或测量该酶反应产物即p-羟苯基丙酮酸或辅因子NADH或 NADra之一积累的方法加以鉴定。具体说，预苯酸脱氢酶活性的测量可以釆用实施 例4中所描述的方法。
按照本发明的一具体实施方案，本发明的转基因植物对以arogenate脱氢酶， 优选本发明所述的arogenate脱氢酶为靶酶的除草剂化合物有耐受性。
按照本发明另一具体实施方案，本发明的转基因植物对以预苯酸氨基转移酶 为靶酶的除草剂化合物有耐受性。
按照本发明的一特定实施方案，在本发明耐受性植物中所表达的编码预苯酸 脱氢酶的基因是一种酵母基因。优选它是编码如Mannhaupt等(1989， Gene 85,303-311)所述的编码酿酒酵母预苯酸脱氢酶的基因(accession No.NC001134) 为序列身份号SEQ ID N0:14所代表。
按照本发明的另一具体实施方案，在本发明耐受性植物中所表达的编码预苯 酸脱氢酶基因是一种细菌基因。优选从杆菌属细菌得到的基因，特别是序列号SEQ ID NO: 16所代表的芽胞杆菌(accession No. M80245)的基因。优选从大肠杆菌属细 菌得到的基因，特别是Hudson等(1984， J. Mol. Biol. 180 (4) ， 1023-1051)所述的 由序列号SEQ ID NO: 18代表的大肠杆菌中得到的基因。优选从^n^/n's属细胞中， 特别是由序列号SEQ ID N0:20代表的A力erZu'co"菌种(accession No. 43343)中 得到的基因。
按照本发明的一项具体实施方案，在本发明耐受性植物中所表达的编码预苯 酸脱氢酶的基因是一种真菌基因。
本发明的转基因植物是通过用编码预苯酸脱氢酶的基因作遗传转化而获得的。优选此基因是一个嵌合基因，包含功能上相互连接的至少一个在宿主体内有 功能的启动子， 一个编码预苯酸脱氢酶的多聚核苷酸和在同一宿主生物中有功能 的终止子元件。此基因通常被导入一个用上述转化方法把所述基因导入所述植物 中的载体。
本发明也涉及产生对以参与预苯酸转变为L-酪氨酸的代谢途径某一步骤的酶
为靶酶的除草剂有耐受性的植物的方法，其特征是用编码预苯酸脱氢酶的基因以 可以在组织中表达的方式转化所述的植物中。
按照本发明的一具体实施方案，现今的方法可用于能耐受以本发明所述的 arogenate脱氢酶为靶酶的除草化合物的植物产品中。
按照本发明的另一具体实施方案，现今的方法可用于能耐受以预苯酸氨基转 移酶为耙酶的除草化合物的植物产品中。
因此现今的方法也包括能够得到能耐受以arogenate脱氢酶为靶酶的除草剂
的植物的方法，其特征是将编码预苯酸脱氢酶的基因用一种能让此基因在植物组
织中表达的方法转化所述的植物。
本发明的转基因植物，除编码预苯酸脱氢酶的基因之外，还可至少包含另一 个含有编码感兴趣蛋白的多聚核苷酸的基因.在这些编码感兴趣蛋白质的多聚核
苷酸中，可提到的有编码对除草剂有抗性的酶的多聚核苷酸，例如编码对 bialaphos有耐受性的&r酶的多聚核苷酸(White等，NAR 18:1062, 1990)，编码 对草甘膦有耐受性的EPSPS酶的多聚核苷酸(US 5,188,642; WO 97/04103),或编 码对异口恶唑有耐受性的HPPD酶的多聚核苷酸(WO 96/38567)。还可提到的有编 码杀虫毒素的多聚核苷酸，例如，编码飽w7^^ "w^7^ey7w、细胞毒素的多聚 核苷酸(例如，见国际专利申请WO 98/40490)。其它对疾病有抗性的多聚核苷酸 也可包含在这些植物中，例如编码专利申请EP 0 531 498或美国专利5， 66， 778 中所描述的oxaylate氧化酶，或编码另一种抗细菌或抗真菌多肽的多聚核苷酸， 如专利申请WO 97/30082、 W0 99/24594、 W0 99/02717、 W0 99/53053和W0 99/91089 中所描述的那些多聚核苷酸。还提到的有编码植物的农艺学特征的多聚核苷酸， 特别是编码美国专利5,552,306和5,614,313，和专利申i青W0 98/46763和W0 98/46764所描述的S -6去饱和酶的多聚核苷酸，或编码专利申请W0 00/01833 和PCT/FR 99/03179中所描述的丝氨酸乙酰转移酶的多聚核苷酸。
以下的实施例可能举例说明了本发明，然而，并没有限制它的范围。


图1是两条预苯酸转变成酪氨酸的途径。
图2(a)显示了用分光光度计鉴测所生成的NADH或NADPH的量来测定 腦germte脱氢酶活性o
图2 (b)显示了 TyrA-Atc、TyrA-ATl、TyrA-AT2对Arogenate和NADP形成NADPH 的催化比活。
图3显示了三种重组酶的KmNADP、 Km arogenate、 Ki酪氨酸和天然分子量。 图4显示了 TyA-Synechocystis arogenate脱氢酶的Vmax、關ADP禾口 Km arogenate。
实施例1:编码拟南芥arogenate脱氢酶基因的鉴定
现今在公共数据库(hUp:〃胃.ncbi. nlm. nih. gov )中可得到所有的预苯酸 脱氢酶和arogenate脱氢酶序列的比较，显示了四个短的同源序列部分。所比较 的酶是酵母预苯酸脱氢酶(登录号Z36065),枯草芽胞杆菌预苯酸脱氢酶(登录号 M80245)和5y"ec力ocj^"s预苯酸脱氢酶(登录号D90910)。这些同源部分使得能 够鉴定拟南芥基因(登录号AF096371)起初表明是编码"与特殊的D-异构体2-羟基酸脱氢酶相似"的酶。此基因包括由一个94bp内含子隔开的两个外显子。第 一个外显子包括1. 08kb长的含有位于第一个ATG密码子下游的推定的叶绿体转运 肽序列的幵放阅读框。第二个外显子可能有一个长892bp的开放阅读框。从两个 外显子推断的蛋白质之间大约有60%的非常强的同源性。如果不考虑位于第一个外 显子中的推定的叶绿体转运肽，则同源性可达到70°/。.此外，这两个预计蛋白质序 列中的每一个都有以预苯酸/arogenate脱氢酶为特征的四个同源部分。此基因命 名为一(SEQ ID N0:1)。
实施例2: 7yw的转录特性
TyrA基因的转录物大小可用Northern杂交和PCR技术测定。将拟南芥新叶 中抽提出来的纯化mRNA与32P放射标记的探针(相应于T)^4两个外显子DNA片段) 杂交。此项分析可能鉴定到一 L8-1.9kb的转录物，与预计的含有该两个外显子 的mRNA的大小非常接近。此外，尽管没有用PCR扩增完整的cDNA，但获得一 1. 5kb 的PCR片段。此片段包含始于513bp位的5'寡聚核苷酸 (P8=5， -GCTAAAACTCTTCTCCTTCAATACTTACCTG-3，)和始于2053bp位的与3' UTR互补的3，寡聚核苷酸(p7二5， -CAGTATMTTAGTAGTCAAGGATCCTGACTGAGAG-3，)。此 片段包括一部分第一编码序列(7>2^」77)和完整的第二编码序列(7>^4^")。此 cDNA的序列分析证实了内含子的剪接。Northern杂交和PCR的分析结果强烈提示 存在一个含有两个编码区域7>2^-^77(SEQ ID N0:4)和7>d-J7^(SEQ ID N0:6)的 mRNA转录物。
实施例3:含有拟南芥arogenate脱氢酶不同编码序列的构建物的制备
用在第一个ATG密码子处引入NdeI限制性切割位点(下划线所示)的寡聚核苷 酸P1(5' -TCTCCATATGATCTTTCMTCTCATTCTCATC-3')和与第一个外显子3，端互 补并与内含子5'端互补且引入一终止子(下划线所示)的寡聚核苷酸 P2 (5， -CTAACTAACTAACTACATACCTCATCATATCC-3，)，对拟南芥基因组DNA进行PCR 扩增，得到第一外显子7>^4-力77。三个缺少编码转运肽序列的构建物也可用127 位第二个ATG密码子处(M43)引入了 Nde I限制性切割位点的寡聚核苷酸 P3(5， -CCTCTCTTTCCATATGCTCCCTTCTC-3，)，在距第一个ATG密码子(V58M)起的 第174位引入起始密码子ATG /限制性切割位点(下划线所示)的寡聚核苷酸 P4 (5 ， -CCGCCAGCCACCTCCATATGACCGACACCATCC-3 ，)，和在距第 一 个ATG密码子 (L75M)起的第222位引入起始密码子ATG和/限制性切割位点(下划线所示) 的寡聚核苷酸P5(5， -CGCCACCCCTCATATGCGTATCGCC-3，)产生。将所有对应于第一 外显子的OCR片段，它们可能或不能编码转运肽，都克隆入质粒 pPCR-Script (Strategene)中。然后无论有没有转运肽序列，将含有此编码序列的 Nde I-BaraH I DNA片段克隆入质粒pET21 a(+) (Novagen)中，导致产生有或没有 转运肽序列的质粒pET21- 7>rJ-^77(pET21-7y州-力77-Ml ， pET21-7)^4-^77-M43， pET21-:Tj^-力77-M5&和pET21-7yr"77-M75)。
用另两个寡聚核苷酸扩增第二编码序列(7yrHi)。寡聚核苷酸 P6(5' -GATGCATCTTTGCATATGATGAGGTCAGAAGATG-3，)在第二个开放阅读框的ATG 密码子处(距第一个ATG密码子起的第1081位)引入一个y^/e 了限制酶切位点(下 划线所示)，和寡聚核苷酸P7(5， -CAGTATAATTAGTAGTCAAGGATCCTGACTGAGAG-3，) 与3' -UTR的起始处互补，引入^fe历^I的限制酶切位点(下划线所示)。与第二编 码序列相对应的PCR片段用Nde I-BamH I酶消化，然后克隆入质粒pET21 a (+)， 产生质粒pET21-7)^4-力Z 。
完整的编码序列通过拼接第一个外显子失去的5'端与用起始于距第一个ATG密码子513bp处的寡聚核苷酸P8(5' -GCTMAACTCTTCTCCTTCAATACTTACC TG-3，)和3，寡聚核苷酸P7PCR扩增拟南芥cDNA获得的部分TyrA-ATcDNA(1.5kb) 而得到重组。位于离第一个ATG密码子起的812bp处和部分7yW-^7 cDNA的5' 末端处的^6Wiy限制酶切位点用于重组的。将部分7>W-JrCDNA克隆进入粒 pPCR-Script中。EcoRV-EcoRV片段从质粒pPCR-Script-7yW-^7中获得然后其隆 入用EcoRV酶消化后的质粒pPCR-Script-7>2^」77中。此项操作导致获得质粒 pPCR-Script-7yW-^c。将含有完整编码序列的Ndel-BamHl片段从质粒 pPCR-Script-7>i^-J7b中剪切下来，然后克隆入用Ndel和BamHl酶消化后的质粒 pET21a(+) (Novagen)中，得到质粒pET21a(+)-7>州-X7b。然后对于第一外显子用 同样的方法得到4个质粒pET21a(+)-7>T^-J7b; —个质粒含有完整编码序列具有 编码推定的转运肽的序列，缺少此转运肽序列的三个质粒已在三个不同的位点经 过切割(M43， V58和L75,见上)。
对于上述的所有构建物，对cDNA插入片段测序以保证在PCR扩增反应时没有 导入不需要的突变。
实施例4:酶活性的测量
在25°C、以340nm的波长，在总体积为200u 1的含有50mM Tris-HC1， pH 8. 6, 300 u M arogenate和ImM NAD或NADPH的溶液中用分光光度计鉴测所生成的 NADH或NADra的量来测定arogenate脱氢酶活性。
在25°C，以340nra的波长，在总体积为200 u 1的含有50mM Tris-HC1， pH 8.6，300uM预苯酸和ImM的NAD或NADPH的溶液中用分光光度计鉴测所生成的 NADH或NADra的量来测定预苯酸脱氢酶活性。
实施例5:重组arogenate脱氢酶的产生
用实施例3中所得到的每一种pET21-77d J7质粒转化大肠杆菌AT2471细 胞，然后37。C在加有lOOn g/ml的羧苄青霉素的2升Luria-Bertani培养基中培 养。当培养液600nm(A600)波长的吸收值达到等于0.6时，在培养液中加入ImM 的异丙基-3-D-硫代半乳糖苷以诱导重组蛋白合成。然后将细胞28。C下培养16 小时，收集，然后40 OOOg离心20min。沉淀重悬于含有ImM EDTA， ImM 二硫苏糖 醇，lfflM苄脒盐酸和5mM氨基己酸的50mMTris-HC1缓冲液中，pH7.5，然后用震 动细胞搅碎器(Sonics and Marterials， Danbury， CT, USA)进行超声破碎(每3秒100脉冲功率5)。 40 000g离心20分钟获得粗提取物，上清夜直接用于酶试验。
含有不同构建物pET21-7>j^」tc、 pET21-7y^"v477和pET21-7yi^-^7^的大 肠杆菌菌株AT 2471的总蛋白抽提物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明，存在 三种重组蛋白，分子量分别是66-68kDa、 35kDa和33-34kDa。这些分子量与推测 的各自编码序列十分相符(68786 Da为7)^4-力7b， 34966 Da为7>rU77, A069 Da 对应于7>^-^7^)。对于含有完整编码序列(7>州-X7b)和第一编码序列(7>^-力77) 的转化株，重组蛋白仅在编码蛋白M58-7>^-^Tb和M58-7yrJ-^n的构建物中观 察到。这三种重组蛋白主要见蛋白包涵体中。然而，大肠杆菌中可溶性蛋白抽提 物中存在的少量重组蛋白使特征鉴定其生化特征成为可能。
实施例6:拟南芥arogenate脱氢酶的鉴定和分析生化特征 重组arogenate脱氢酶的生化特征分析采用转化的大肠杆菌菌株的可溶性蛋 白抽提物来进行。按照实施例4中所描述的方法测量了 Arogenate脱氢酶活性。 这三个重组酶中的每一个均显示了严格依赖NADP的arogenate脱氢酶活性。当存 在NAD时检测不到arogenate脱氢酶活性，不论釆用何种辅因子(NADP或NAD)或 不论测试何种蛋白质(TyrA-ATc，TyrA-ATl或TyrA-AT2)都不能检测到预苯酸脱氢 酶的活性。此外，lmM浓度的预苯酸不能抑制这三种重组酶的arogenate脱氢酶活 性。这些酶中的每一种都具有Michaelis-Menten类型的行为，它们的arogenate 和NADP的Km值大致相同(图2和3) 。 NADP的Michaelis常数分别是TyrA-ATc 40 u M， TyrA-ATI 60 u M禾口 TyrA-AT2 20 u M。 Arogenate的Michaelis常数分别是 TyrA-ATc 70 uM， TyrA-ATI 45 uM和TyrA-AT2 45 uM。此外，像其它植物的 arogenate脱氢酶一样(Byng等，1981， Phytochemistry 6， 1289-1292; Connelly and Conn， 1986， Z. Naturforsch 41c, 69—78; Gaines等，1982 Planta 156， 233—240)， 拟南芥arogenate脱氢酶都对酪氨酸，(此酶的反应产物)非常敏感，但对ImM的 苯基丙氨酸以及ImM的p-羟苯基丙酮酸不敏感。酪氨酸的抑制作用与arogenate 竞争(TyrA-ATc的Ki值是14 u M， TyrA-ATc的Ki值是8 u M和TyrA-ATc的Ki值 是12ixM)，但不与NADP竞争。
实施例7: 5>Z7ec/ oc7l^is的arogenate脱氢酶的鉴定和生化特征分析 实施例1中鉴定了编码拟南芥arogenate脱氢酶的基因序列(7>_^)，这使得 鉴定菌株6y/jec力oc7s"s (登录号1652956)中的arogenate脱氢酶成为可能。最初曾把此基因描述为编码"预苯酸脱氢酶"的基因。它从5y/3M力^j^"s基因
组库中分离出并按照实施例5所描述的步骤产生此酶，方式与拟南芥此酶的产生 方式相同。所产生的酶的生化特征分析可证明它是一种arogenate脱氢酶而不是 预苯酸脱氢酶。6y/7ec力oc义s"sarogenate脱氢酶的生化特征分析可用从转化的大 肠杆菌菌株纯化的可溶性蛋白抽提物进行。Arogenate脱氢酶的活性测定按照实施 例4所描述的方法进行。此酶显示了严格依赖NADP的arogenate脱氢酶活性。当 存在NAD时则不能检测到arogenate酶活性，无论用何种辅因子(NADP或NAD)都 不能检测到预苯酸脱氢酶活性。此外，lmM浓度的预苯酸不能抑制此酶的arogenate 脱氢酶活性。加ec/ o，"s arogenate脱氢酶具有Michaelis-Menten类型的行 为(图4)。其米氏常数对NADP是6uM，对arogenate是107 uM。
实施例8:其它植物arogenate脱氢酶的鉴定
实施例1中鉴定了编码拟南芥arogenate脱氢酶的基因序列(7>2力，这使得 鉴定拟南芥中的其它arogenate脱氢酶成为可能。此新基因(登录号AC0342561; SEQ ID N0:8)起初的注释是"含有与尸icea Wa〃cs的胚胎丰富蛋白(EMB20)相似 的基因"。它也有一个推定的叶绿体转运肽序列，但没有重复区域。
TyrA基因序列也使得可能鉴定公众EST(表达序列标签)数据库中的另外两个 编码arogenate脱氢酶的cDNA序列。这些cDNA中的一个不完整，对应于西红柿 cDNA(TC41067; SEQ IDN0:22).此cDNA的不完整特性使得不能确定它是否是TyrA 的复制本，因为它的3'末端终止在对应于Tyr-ATl的D356密码子之后。第二个 cDNA对应于尸ices ^Zawca的完整cDNA(登录号L47749; SEQ ID N0: 10)且没有 重复区域。此尸&朋^朋cs的柱释是一种"胚胎丰富蛋白"。序列表
<110>阿方蒂农科股份有限公司(Avetrtis Cr。pSci匿SA)
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〈160〉 30
<170〉 Patentln Ver. 2. 1
<210〉 1 〈211> 2082 <212〉腿
<213〉拟南芥(Arabidopsis thaliana) <220〉
<221>转运肽 <222> (1). . (174)
<220〉
<221〉内含子
<222〉 (1089).. (1181)
<400〉 1
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<213〉拟南芥(Arabidopsis thaliana)
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〈222〉 (1).. (1980)
<220〉
<221〉转运肽 <222> (1)., (174)
<400> 2
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210 215 220
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245 250 255
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260 265 270
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290 295 300
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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500 505 510
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515 520 525
gat aga aga aaa teg agg tgt aac agt ttt ctt gat att ttt gcc cgt 1632 Asp Arg Arg Lys Ser Arg Cys Asn Ser Phe Leu Asp lie Phe Ala Arg
530 535 540
gaa gga tgt cgt atg gtg gag atg teg tgt get g犯cat gat tgg cat 1680 Glu Gly Cys Arg Met Val Glu Met Ser Cys Ala Glu His Asp Trp His 545 550 555 560
get get gga tea cag ttt ate aca cac aca gtg gga agg ctt ctg gag 1728 Ala Ala Gly Ser Gin Phe lie Thr His Thr Val Gly Arg Leu Leu Glu
565 570 575
aag ctg age ttg gaa tct act cct ata gat acc aaa ggt "tat gag aca 1776 Lys Leu Ser Leu Glu Ser Thr Pro lie Asp Thr Lys Gly Tyr Glu Thr
580 585 590
Ug cta aaa ctg gtg gag aat act get ggt gac age ttt gat ctg tac 1824 Leu Leu Lys Leu Val Glu Asn Thr Ala Gly Asp Ser Phe Asp Leu Tyr
595 600 605
tat gga cta ttt tta tac aat cct aat gca atg gaa cag ctt gag agg 1872 Tyr Gly Leu Phe Leu Tyr Asn Pro Asn Ala Met Glu Gin Leu Glu Arg
610 615 620
ttt' cat gtg get ttt gaa tea ttg aag aca cag etc ttt gga cga cta 1920 Phe His Val Ala Phe Glu Ser Leu Lys Thr Gin Leu Phe Gly Arg Leu 625 630 635 640
cat tct c.aa cat tct cat gag cta get aaa tea tct tec cca aag aca 1968 His Ser Gin His Ser His Glu Leu Ala. Lys Ser Ser Ser Pro Lys Thr
645 650 655
act aag cta tta a 1981
27<210> 3 〈211> 660 <212〉 PRT
<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400〉 3
Met lie Phe Gin Ser His Ser His His Leu Leu Leu Tyr Gin Ser Ser
15 10 15
Ser Ser Ser Ser Phe Phe Phe Leu Pro Lys Leu lie Thr Lys Pro Pro
20 25 30
Leu Ser Leu Ser Phe Thr Ser Leu Ser Ser Met Leu Pro Ser Leu Ser
35 40 45
Leu Ser Thr Ala Asn Arg His Leu Ser Val Thr Asp Thr lie Pro Leu
50 55 60
Pro Asri Ser Asn Ser Asn Ala Thr Pro Pro Leu Arg lie Ala lie lie 65 70 75 80
Gly Phe Gly Asn Tyr Gly Gin Phe Leu Ala Glu Thr Leu lie Ser Gin
85 90 95
Gly His lie Leu Phe Ala His Ser Arg Ser Asp His Ser Ser Ala Ala
100 105 110
Arg Arg Leu Gly Val Ser Tyr Phe Thr Asp Leu His Asp Leu Cys Glu
115 120 125
Arg His Pro Asp Val Val Leu Leu Cys Thr Ser lie Leu Ser lie Glu
130 135 140
Asn lie Leu Lys Thr Leu Pro Phe Gin Arg Leu Arg Arg Asn Thr Leu 145 150 155 160
Phe Val Asp Val Leu Ser Val Lys Glu Phe Ala Lys Thr Leu Leu Leu
165 170 175
Gin Tyr Leu Pro Glu Asp Phe Asp lie Leu Cys Thr His Pro Met Phe
180 185 190
Gly Pro Gin Ser Val Ser Ser Asn His Gly Trp Arg Gly Leu Arg Phe
195 200 205
Val Tyr Asp Lys Val Arg lie Gly Glu Glu Arg Leu Arg Val Ser Arg
210 215 220
Cys Glu Ser Phe Leu Glu lie Phe Val Arg Glu Gly Cys Glu Met Val 225 230 235 240
Glu Met Ser Val Thr Asp His A印Lys Phe Ala Ala Glu Ser Gin Phe
245 250 255
lie Thr His Thr Leu Gly Arg Leu Leu Gly Met Leu Lys Leu lie Ser
260 265 270
Thr Pro lie Asn Thr Lys Gly Tyr Glu Ala Leu Leu Asp Leu Ala Glu
275 280 285
Asn lie Cys Gly Asp Ser Phe Asp Leu Tyr Tyr Gly Leu Phe Val Tyr
290 295 300
Asn Asn Asn Ser Leu Glu Val Leu Glu Arg lie Asp Leu Ala Phe Glu 305 310 315 320
Ala Leu Arg Lys Glu Leu Phe Ser Arg Leu His Gly Val Val Arg Lys 325 330 335Gin
Gly
Val
Ser 385 Leu
Arg
Ser
Cys
Gin 舰 Glu
Ser
Glu
Lys 370 Arg
Gly
Ser
Asp
Thr 450 Arg
Asn
Glu 545 Ala
Lys
Leu
Tyr
Phe 625 His
Thr
Arg 530 Gly
Ala
Leu
l>eu
Gly 610 His
Ser
Lys
Phe
Asn 355 Tyr
Leu
Lys
Asp
Leu 435 Ser
Glu 340 Asp
Glu
Lys
Thr
Tyr 420 Asp
Gly
Ala
Tyr
lie
Met 405 Thr
Glu
Ser
Asn
Gly 390 Val
II
Phe Pro Arg
Asp Leu
e Leu Ser
Asp
Leu Lys Arg
lie Leu Cys Trp Asp
Asn 515 Arg
Cys
Gly
Ser
Lys 595 Leu
Val
Gin
Leu
Thr 500 !>eu
匕ys
Arg
Ser
Leu 580 Leu
Phe
Ala
His
Leu 660
Asn 485 His
Ala
Ser
Met
Gin 565 Glu
Val
Leu
Phe
Ser 645
Ser 470 Leu
Pro
Phe
Arg
Val 550 Phe
Ser
Glu
Tyr
Glu 630 His
Ala
Leu
Ser 375 lie
Lys
Glu
Phe
Thr 455 Thr
Phe
Met
Val
Cys 535 Glu
lie
Thr
Asn
Asn 615 Ser
Glu
Lys
Asp 360 Gin
Val
Gin
Ala
Glu 440
Glu
Leu
Leu
Phe
Phe 520 Asn
Met
Thr
Pro
Thr 600 Pro
Leu
Leu
345 Met
Val
Gly
Gly
Ala 425 Glu
Lys
Phe
Gin
Gly 505 Asp
Ser
Ser
His
lie 585 Ala
Asn
Lys
Ala
Val
Met
Ser
Phe
His 410 Lys
His
Val
Val
Thr 490 Pro
Lys
Phe
Cys
Thr 570 Asp
Gly
Ala
Thr
Lys 650
His
Arg
Gly
Gly 395 Thr
Leu
Pro
Leu
Asp 475 Leu
Glu
Val
Leu
Ala 555 Val
Thr
Asp
Met
Gin 635 Ser
Val
Ser
Ser 380 Asn
Val
Gly
Glu
Glu 460 Val
Pro
Ser
Arg
Asp 540 Glu
Gly
Lys
Ser
Glu 620 l>eu
Ser
Phe
Glu 365 Val
Phe
Leu
Val
Val 445 Ser
Leu
Gin
Gly
lie 525 lie
His
Arg
Gly
Phe 605 Gin
Phe
Ser
Pro 350 Asp
Asn
Gly
Ala
Ser 430 lie
Leu
Ser
Asp
Lys 510 Gly
Phe
Asp
Leu
Tyr 590 Asp
Leu
Gly
Pro
Asn
Val
Asp
Gin
丁yr 415 Tyr
lie
Pro
Val
Phe 495 Asn
Met
Ala
Trp
Leu 575 Glu
Leu
Glu
Arg
lys 655
Cys
Val
Gly
Phe 400 Ser
Phe
Leu
Phe
卿 Asp
Gly
Asp
Arg
His 560 Glu
Thr
Tyr
Arg
Leu 640 Thr
<210〉 4
<211> 933 〈212〉腿
<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<220>
〈221> CDS
29<222〉 (1).. (933) <400〉 4
atg acc gac acc atc cct ctt ccc aac tcc aac tcc aac gcc acc cct 48 Met Thr Asp Thr lie Pro Leu Pro Asn Ser Asn Ser Asn Ala Thr Pro
15 10 15
cct etc cgt ate gcc ate ate gga ttc gga aac tac ggc caa ttc ctt 96 Pro Leu Arg lie Ala lie lie Gly Phe Gly Asn Tyr Gly Gin Phe Leu
20 25 30
gcc gaa acc eta att tct c犯ggc cac att etc ttc get cac tcc cga 144 Ala Glu Thr Leu工le Ser Gin Gly His lie Leu Phe Ala His Ser Arg
35 40 45
tcc gat cac tcc tcc gcc get cgc cgt etc ggt gtc tea tac ttc acc 192 Ser Asp His Ser Ser Ala /Ua Arg Arg乙eu Gly Val Ser Tyr Phe Thr
50 55 60
gat ctt cac gat etc tgc gaa cgt cat cct gac gta gtc ctt etc tgt 240 Asp Leu His Asp Leu Cys Glu Arg His Pro Asp Val Val Leu Leu Cys 65 70 75 80
act tea ate etc tcc ata gag aat att etc aaa acg "ttg ccg ttt cag 288 Thr Ser lie Leu Ser lie Giu Asn lie Leu Lys Thr Leu Pro Phe Gin
85 90 95
aga etc cgt cgc aac act etc ttc gtt gat gtt etc tcc gtt aaa gag 336 Arg Leu Arg Arg Asn Thr Leu Phe Val Asp Val Leu Ser Val Lys Glu
100 105 110
ttt get aaa act ctt etc ctt caa tac tta cct gaa gat ttc gat att 384 Phe Ala Lys Thr Leu Leu Leu Gin Tyr Leu Pro Glu Asp Phe Asp lie
115 120 125
ctt tgt aca cat cca atg ttt ggt cct cag agt gtg agt tea aat cat 432 Leu Cys Thr His Pro Met Phe Gly Pro Gin Ser Val Ser Ser Asn His
130 135 M0
ggc tgg aga gga tta aga ttt gtg tat gat a犯gU agg att ggg gaa 480 Gly Trp Arg Gly Leu Arg Phe Val Tyr Asp Lys Val Arg lie Gly Gtu 145 150 155 160
gag aga ttg aga gtc tea agg tgt gag agt ttt ctt gag att ttt gU 528 Glu Arg Leu Arg Val Ser Arg Cys Glu Ser Phe Leu Glu lie Phe Val
165 170 175
aga gaa gga tgt gag atg gtg gag atg agt gtt act gat cat gat aag 576 Arg Glu Gly Cys Glu Met Val Glu Met Ser Val Thr Asp His Asp Lys
180 185 190
Ut get get gaa tea cag ttt ata act cat act ctt ggt agg ctt ttg 624 Phe Ala Ala Glu Ser Gin Phe lie Thr His Thr Leu Gly Arg Leu Leu
195 200 205
ggg atg ttg aag ttg ata teg acg ccg att aat acg aaa ggg tac gag 672 Gly Met Leu Lys Leu lie Ser Thr Pro lie Asn Thr Lys Gly Tyr Glu
210 215 220
gcg Ug ctt gat tta get gag aat att "tgt ggg gat agt ttt gat ttg 720 Ala Leu Leu Asp Leu Ala Glu Asn lie Cys Gly Asp Ser Phe Asp Leu 225 230 235 240
tat tat ggg ttg ttt gtg tat aat aac aac tct ttg gag gtg tta gag 768 Tyr Tyr Gly Leu Phe Val Tyr Asn Asn Asn Ser Leu Glu Val Leu Glu 245 250 255agg Arg
ctt Leu
gtt Val
atg Met 305
lie
His
cat His 290 agg
gat ttg get Asp Leu Ala
260 ggt gtt gtg Gly Val Val 275
gtt ttt cca Val Phe Pro
tat gta gtt Tyr Val Val
ttc Phe
agg Arg
犯t Asn
agt Ser 310
gag Glu
卿
tgt Cys 295 tag
get ttg Ala Leu 265 cag tct Gin Ser 280
ggt gaa Gly Glu
cgt Arg
ttt Phe
aat Asn
aag gag Lys Glu
gaa ggt Glu Gly
gat Asp
get Ala 300
ctt Leu
gaa Glu 285 tct Ser
ttt Phe 270 gca Ala
ttg leu
agt Ser
aag Lys
gat Asp
egg 816 Arg
aaa 864
atg 912 Met
933
<210〉 5
<211> 310
<212〉 PRT
<213〉拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400〉 5 Met 1
Pro
Ala
Ser
Asp 65 Thr
Arg
Phe
Leu
Gly 145 Glu
Arg
Phe
Gly
Ala 225 Tyr
Thr
Leu
Glu
Asp 50 Leu
Ser
Leu
Ala
Cys 130 Trp
Arg
Glu
Ala
Met 210 Leu
Tyr
Asp
Arg
Thr 35 His
His
lie
Arg
Lys 115 Thr
Arg
Leu
Gly
Ala 195 Leu
Leu
Gly
Thr
lie 20 Leu
Ser
Asp
Leu
Arg 100 Thr
His
Gly
Arg
Cys 180 Glu
Lys
Asp
Leu
lie
5
Ala lie Ser Leu
Ser 85 Asn
Pro
lie
Ser
Ala
Cys 70 lie
Leu
lie
Gin
Ala 55 Glu
Glu Leu Leu Leu leu
Thr
Pro
Leu
Val 165 Glu
Ser
Leu
Leu
Phe 245
Met
Arg 150 Ser
Met
Gin
lie
Ala 230 Val
Phe 135 Phe
Arg
Val
Phe
Ser 215 Glu
Tyr
Pro
Gly
Gly 40 Arg
Arg
Asn
Phe
Gin 120 Gly
Val
Cys
Glu
lie 200 Thr
Asn
Asn
Asn
Phe 25 His
Arg
His
lie
Val 105 Tyr
Pro
Tyr
Glu
Met 185 Thr
Pro
lie
Asn
Ser 10 Gly
lie
Leu
Pro
Leu 90 Asp
Leu
Gin
Asp
Ser 170 Ser
His
lie
Cys
Asn 250
Asn
Asn
Leu
Gly
Asp 75 Lys
Val
Pro
Ser
Lys 155 Phe
Val
Thr
Asn
Gly 235 Ser
Ser
Tyr
Phe
Val 60 Val
Thr
Leu
Glu
Val 140 Val
Leu
Thr
Leu
Thr 220 Asp
Leu
Asn
Gly
Ala 45 Ser
Val
Leu
Ser
Asp 125 Ser
Arg
Glu
Asp
Gly 205 Lys
Ser
Glu
Ala Thr Pro
Gin 30 His
Tyr
Leu
Pro
Val 110 Phe
Ser
lie
lie
His 190 Arg
Gly
Phe
Val
Thr 15 Phe
Ser
Phe
Leu
Phe 95 Lys
Asp
Asn
Gly
Phe 175 Asp
Leu
Tyr
Asp
Leu 255
leu
Arg
Thr
Cys 80 Gin
Glu
lie
His
Glu 160 Val
Lys
Leu
Glu
Leu 240 GluArg lie Asp Leu Ala Phe Glu Ala Uu Arg Lys Glu Leu Phe Ser Arg
260 265 270
Leu His Gly Val Val Arg Lys Gin Ser Phe Glu Gly Glu Ala Lys Lys
275 280 285
Val His Val Phe Pro Asn Cys Gly Glu Asn Asp Ala Ser Leu Asp Met
290 295 300
Met. Arg Tyr Val Val Ser 305 310
<210〉 6 〈211〉 909 <212〉 DNA
<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)
〈221〉 CDS <222> (1), (909)
6
<400〉 stg自 Met Met 1
gtg tct Val Ser
ggg ttt Gly Phe
ggt cac Gly His 50
gca肌g Ala Lys
65 gag cat Glu His
agg Arg
ggt Gly
gga Gly 35 act Thr
etc Leu
cct Pro
aaa gtt etc Lys Val Leu
ttt gtg Phe Val
cm set Gin Thr 130 ggg cca Gly Pro 145
gat aag Asp Lys
tea Ser
agt Ser 20 aat Asn
gat Asp 115 etc Leu
gag Glu
gtt Val
Glu
gag Glu 100 gta Val
agt Ser
agg Arg
gaa Glu 5
gtt Val
Ut Phe
gtg tta Val Leu
ggt gtt Gly Val
Pro Gin
gat Asp
Asn
gtt Val
gac Asp
gtt gtg Val Val
gga cag Gly Gin
gtt Val 85 tea Ser
etc Leu
get Ala
teg Ser 70 att lie
tat Tyr 55 tat Tyr
att lie
ggt Gly
ttt Phe 40 tec Ser
eta ccg Leu Pro
tea gta Ser Vsl
ggt Gly
lie
gat Asp
肌3 Lys 150 gga Gly
ttt Phe 135 aat Asn
atg Met
ttt Phe
Lys 120 gat Asp
teg Ser 25 eta Leu
aga Arg
犯g Lys 10 agg Arg
tat Tyr
etc Leu
agt gac Ser Asp
ttt tea Phe Ser
etc tgt Leu Cys
cag Gin
卿 Glu
att lie
gat Asp
acg Thr 90
ttc ccg Phe Pro
,tgg Gly Trp
gat gat Asp Asp
ttg Leu
Arg
tgc Cys
aat Asn 155 卿 Arg
g肌 Glu
aag Lys
ggt肌a acc Gly Lys Thr
ctt Leu 75 tea Ser
ctg Leu
tac Tyr 60 gat Asp
acg Thr 140 ctt Leu
tat Tyr
att lie
atg Met 45 act Thr
gat Asp
gcc Ala
Asn
ggt Gly 30 gtc Val
3tC Ctt
lie Leu
犯g aga Lys Arg
3gg犯t Arg Asn 125 cat His
aaa teg Lys Ser
m Phe
agg Arg
tec Ser 15 ate lie
胆g lys
eta Leu
teg Ser
age Ser 110 tta Leu
cag Gin
gtc Val
Gin
gat gaa gCEt Asp Glu Ala
ttt Phe
3Ct
Thr 95 aca Thr
Ut Phe
Glu 80 g犯 Glu
ctt 乙eu
ctt Leu
cct atg ttt Pro Met Phe
Val
tgt Cys
tu
Phe 160 aac Asn
48
96
144
192
240
288
336
384
432
480
528agt Ser
tcg Ser
His
lie
225 get Ala
ttt Phe
tgt Cys
鲫
get Ala
丁hr
290
165
ctt gat att leu Asp lie
180 get gaa cat Ala Glu His 195
gtg gga agg Val Gly Arg
Thr 210
gat acc aaa Asp Thr Lys
ggt Gly
朋t gC3
Asn Ala
gac age Asp Ser
atg gaa Met Glu 260 cag etc Gin Leu 275
tea tct Ser Ser
Gly
ttt Phe 245
Gin
ttt Phe
tec Ser
Ut Phe
gat Asp
ctt Leu
城 Tyr 230 gat Asp
ctt Leu
gga Gly
gcc cgt Ala Arg
tgg Trp
ctg Leu 215 gag Glu
cat His 200 gag Glu
Thr
ctg tac Leu Tyr
g服鄉 Glu Arg
Pro
cga Arg
犯g Lys 295
eta Leu 280
Thr
g肌 Glu 185 get Ala
卿 Lys
ttg Leu
城 Tyr
ttt Phe 265 cat His
170 gga Gly
get Ala
ctg Leu
eta Leu
gga Gly 250 cat. His
tct Ser
act aag Thr Lys
tgt cgt atg Cys Arg Met
gga Gly
age Ser
235 eta Leu
tea Ser
ttg Leu 220 ctg Leu
Ut Phe
cag Gin 205 gaa Glu
gtg
Val
tta Leu
gtg get ttt Val Ala Phe
Gin
eta leu
cat His
tta Leu 300
tct Ser 285 act Thr
gtg Val 190
tu
Phe
175 gag Glu
￡ltC
lie
atg Met
Thr
gag Glu
tac Tyr
g犯 Glu 270 cat His
Asn
犯t Asn 255 tea Ser
gag Glu
act Thr 240 cct Pro
ttg Leu
eta Leu
3gC t33
Ser
576
624
tct act cct 672 Ser Thr Pro
720
768
816
864
909
〈210〉 7
〈211〉 302
〈212〉 PRT
<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 7 Met Met
1
Val
Gly
Gly
Ala 65 Glu
Lys
Phe
Gin
Gly
Ser
Phe
His 50 Lys
His
Val
Val
Thr 130 Pro
Arg
Gly
Gly 35 Thr
Leu
Pro
Leu
Asp 115 Leu
Glu
Ser
Ser 20 Asn
Val
Gly
Glu
Glu 100
Val
Pro Ser
Glu 5
Val
Phe
Leu
Val
Val 85 Ser
Leu
Gin
Gly
Asp
Asn
Gly
Ala
Ser 70 lie
Leu
Ser
Asp
Val
Asp
Gin
Tyr 55 Tyr
lie
Pro
Val
Phe 135 Asn
Val
Gly
Phe 40 Ser
Phe
Leu
Phe
Val
Ser 25 Leu
Arg
Ser
Cys
120 Asp
Gin 105 Glu
10
Arg
Gly
Ser
Asp
Thr 90 Arg
Tyr
Leu
Lys
Asp
Leu 75 Ser
Leu Pro Cys
Gly Trp Asn Asn
lie
Phe Leu
Glu
Lys
Thr
Tyr 60 Asp
lie
匕ys
Arg
Thr 140 Leu
丁yr
lie
Met 45 Thr
Asp
Leu
Arg
Asn 125 His
Ala
Asn
Gly 30 Val
Asp
Leu
Ser
Ser 110 Leu
Pro
Phe
Ser 15 lie
Lys
Phe
Thr 95 Thr
Phe
Met
Val
Gin
Val
Gin
Ala
Glu 80 Glu
Leu
leu
Phe
Phe145
Asp Lys Val Ser Phe Leu
Ser Cys
His Thr 210 lie Asp 225
Ala Gly
195 Val
Thr Asp Asn Ah Met
Lys Thr
Ala Lys 290
Gin 275 Ser
150
Arg lie Gly Met 165
Asp lie Phe Ala 180
Glu His Asp Trp
Gly Arg Leu Leu 215
Lys Gly Tyr Glu 230
Ser Phe Asp Leu 245
Glu Gin Leu Glu 260
Leu Phe Gly Arg
Ser Ser Pro Lys 295
Asp
Arg
His 200 Glu
Thr
Tyr
Arg
Leu 280 Thr
Asp
Glu 185 Ala
Lys
Leu
Tyr
Phe 265 His
Arg 170 Gly
Ala
Leu
Leu
Gly 250 His
Ser
155
Arg Lys
Cys
Gly
Ser
Lys 235 Leu
Val
Gin
Thr Lys Leu
Arg
Ser
leu 220 Leu
Phe
Ala
His
Leu 300
Met
Gin 205 Glu
Val
Leu
Phe
Ser 285 Thr
Arg
Val 190 Phe
Ser
Glu
丁yr
Glu 270 His
Ser
Cys 175 Glu
lie
Thr
Asn
Asn 255 Ser
Glu
160 Asn
Met
Thr
Pro
Thr 240 Pro
Leu
Leu
<210〉 8 〈211> 1077 <212〉隱
<213〉拟南芥(Arabid叩sis thaiiana)
<220〉
<221〉 CDS
<222> (1).. (1077)
〈400〉 8
atg cta etc cat Met Leu Leu His 1
etc cgc cgc aat Leu Arg Arg Asn 20
cga att cga gca Arg lie Arg Ala 35
etc aaa tec gag Leu Lys Ser Glu 50
ggt ttc ggc aat Gly Phe Gly Asn 65
ggc cac gat cta Gly His Asp Leu
aac tea ate gga
ttc tct ccg gcg Phe Ser Pro Ala 5
tea ccc aca ttc Ser Pro Thr Phe
ate gac gcc gcc lie Asp Ala Ala 40
tac cgc犯a tec Tyr Arg Lys Ser 55
ttc ggc caa ttc Phe Gly Gin Phe 70
ate act cac tec lie Thr His Ser 85
get cgt ttc ttc
aaa ccc etc att tct Lys Pro Leu lie Ser 10
etc att tec ccg ccg Leu lie Ser Pro Pro 25
c犯ate ttc gat tac Gin lie Phe Asp Tyr 45
tct get etc aaa ate Ser Ala Leu lys lie 60
etc tec aaa acc cta Leu Ser Lys Thr Leu 75
cgc tec gat tac tec Arg Ser Asp Tyr Ser 90
gat aac cct cac gat
cca ccc aat 48 Pro Pro Asn 15
cga tct ctt 96 Arg Ser Leu 30
gaa acc caa 144 Glu Thr Gin
gcc gtc ttg 192 Ala Val Leu
att cga cac 240 lie Arg His 80
gac gcc gca 288 Asp Ala Ala 95
etc tgt gaa 336Asn Ser lie Gly Ala Arg Phe Phe Asp Asn Pro His Asp Leu Cys Glu
100 105 110
caa cat ccc gac gtt gtc etc etc tgt acc tea ate etc tec aca gaa 384 Gin His Pro Asp Val Val Leu Uu Cys Thr Ser lie Leu Ser Thr Glu
115 120 125
tea gtc etc aga tea ttc cct ttc caa cgt etc cgt cgt age aca etc 432 Ser Val Uu Arg Ser Phe Pro Phe Gin Arg Leu Arg Arg Ser Thr Leu
130 135 140
ttc gtc gat gtt etc tec gtt aag gaa ttc cca aaa gcc etc ttc att 480 Phe Val Asp Val Leu Ser Val Lys Glu Phe Pro Lys Ala Leu Phe lie 145 150 155 160
aaa tac ctt cct aag gag ttt gac att etc tgt act cat cca atg ttt 528 Lys Tyr Leu Pro Lys Glu Phe Asp lie Leu Cys Thr His Pro Met Phe
165 170 175
gga cct gag agt ggt aag cat tct. tgg tct ggc ttg ccc ttt. gtc tac 576 Gly Pro Glu Ser Gly Lys His Ser Trp Ser Gly Leu Pro Phe Val Tyr
180 185 190
gat aag gtg aga ate gga gac gca get tea aga caa gag agg tgt gag 624 Asp Lys Val Arg lie Gly Asp Ala Ala Ser Arg Gin Glu Arg Cys Glu
195 200 205
aag ttt eta aga att ttt gag aat gaa ggt tgc aag atg gtt gaa atg 672 Lys Phe Leu Arg lie Phe Glu Asn Glu Gly Cys Lys Met Val Glu Met
210 215 220
age tgt gag aag cat gat tat tac gca get gga teg caa ttc gtg acg 720 Ser Cys Glu Lys His Asp Tyr Tyr Ala Ala Gly Ser Gin Phe Val Thr 225 230 235 240
cat act atg gga agg gtt ttg gag aaa tat gga gtt gag tct teg ccg 768 His Thr Met G〗y Arg VaLeu G〗u Lys 丁yr Gy Val Gu Ser Ser Pro
245 250 255
att aac acc aaa ggt tat gag acg "ttg ttg gat ttg gtg gag aac aca 816 lie Asn Thr Lys Gly Tyr Glu Thr Leu Leu Asp Leu Val Glu Asn Thr
260 265 270
tcg agt gat age ttt gag ctt ttc tac ggt ttg ttt atg tat aat ccg 864 Ser Ser Asp Ser Phe Glu Leu Phe Tyr Gly Leu Phe Met Tyr Asn Pro
275 280 285
aat get ctt gaa cag ttg gag aga ttg gat atg get ttt gag tct gtt 912 Asn Ala Leu Glu Gin Leu Glu Arg Leu Asp Met Ala Phe Glu Ser Val
290 295 300
aag aag gag ctg Ut ggg aga tta cat cag caa tac agg aag caa atg 960 Lys Lys Glu Leu Phe Gly Arg Leu His Gin Gin Tyr Arg Lys Gin Met 305 310 315 320
ttt ggt ggg gag gtt caa tcg ccc aag aaa act gag cag aaa ttg etc 1008 Phe Gly Gly Glu Val Gin Ser Pro Lys Lys 丁hr Glu Gin Lys Leu Leu
325 330 335
aat gat ggt ggt gtt gtt cct atg aat gat ata tea tea tea tea tea 1056 Asn Asp Gly Gly Val Val Pro Met Asn Asp lie Ser Ser Ser Ser Ser
340 345 350
tea tea tea tea tea tct taa 1077 Ser Ser Ser Ser Ser Ser 355
35<210> 9 <211〉 358 〈212〉 PR丁
<213>拟南芥(Arabid叩sis thaliana)
<400> 9 Met Leu
Leu His
1
Leu
Arg
Leu
Gly 65 Gly
Asn
Gin
Ser
Phe 145 Lys
Gly
Asp
Lys
Ser 225 His
lie
Ser
Asn
Lys 305 Phe
Asn
Ser
Arg
lie
l'ys 50 Phe
His
Ser
His
Val 130 Val
Tyr
Pro
Lys
Phe 210 Cys
Thr
Asn
Ser
Ala 290 Lys
Gly
Asp
Ser
Arg
Arg 35 Ser
Gly
Asp
lie
Pro 115 Leu
Asp
Leu
Glu
Val 195 Leu
Glu
Met
Thr
Asp 275 Leu
Glu
Gly
Gly
Ser
Asn 20 Ala
Glu
Asn
Leu
Gly 100 Asp
Arg
Val
Pro
Ser 180 Arg
Arg
Lys
Gly
Lys 260 Ser
Glu
Leu
Glu
Gly 340 Ser
Phe 5
Ser
lie
Tyr
Phe
lie 85 Ala
Val
Ser
Leu
Lys 165 Gly
lie
lie
His
Arg 245 Gly
Phe
Gin
Phe
Val 325 Val
Ser
Ser
Pro
Asp
Arg
Gly 70 Thr
Arg
Val
Phe
Ser 150 Glu
Lys
Gly
Phe
Asp 230 Val
Tyr
Glu
Leu
Gly 310 Gin
Val
Ser
Pro
Thr
Ala
Lys 55 Gin
His
Phe
Leu
Pro 135 Val
Phe
His
Asp
Glu 215 Tyr
teu
Glu
Leu
Glu 295 Arg
Ser
Pro
Ala
Phe
Ala 40 Ser
Phe
Ser
Phe
Leu 120 Phe
Lys
Asp
Ser
Ala 200 Asn
Tyr
Glu
Thr
Phe 280 Arg
Leu
Pro
Met
Lys
Leu 25 Gin
Ser
Leu
Arg
Asp 105 Cys
Gin
Glu
lie
Trp 185 Ala
Glu
Ala
Lys
Leu 265 Tyr
Leu
His
Lys
Asn 345
Pro 10 lie
lie
Ala
Ser
Ser 90 Asn
Thr
Arg
Phe
Leu 170 Ser
Ser
Gly
Ala
Tyr 250 Leu
Gly
Asp
Gin
Lys 330 Asp
Leu
Ser
Phe
Leu
Lys 75 Asp
Pro
Ser
Leu
Pro 155 Cys
Gly
Arg
Cys
Gly 235 Gly
Asp
Leu
Met
Gin 315 Thr
lie
lie
Pro
Asp
Lys 60 Thr
Tyr
His
lie
Arg 140 Lys
Thr
Leu
Gin
Lys 220 Ser
Val
Leu
Phe
Ala 300 Tyr
Glu
Ser
Ser
Pro
Tyr 45 lie
Leu
Ser
Asp
Leu 125 Arg
Ala
His
Pro
Glu 205 Met
Gin
Glu
Val
Met 285 Phe
Arg
Gin
Ser
Pro
Arg 30 Glu
Ala
lie
Asp
Leu 110 Ser
Ser
Leu
Pro
Phe 190 Arg
Val
Phe
Ser
Glu 270 Tyr
Glu
Lys
Lys
Ser 350
Pro 15 Ser
Thr
Val
Arg
Ala 95 Cys
Thr
Thr
Phe
Met 175 Val
Cys
Glu
Val
Ser 255 Asn
Asn
Ser
Gin
Leu 335 Ser
Asn
Leu
Gin
teu
His 80 Ala
Glu
Glu
Leu
lie 160 Phe
Tyr
Glu
Met
Thr 240 Pro
Thr
Pro
Val
Met 320 Leu
Ser355
<210〉 10 <211〉 1476 <212〉瞧
<213>灰绿云杉(Picea glauca)
<220〉
<221> CDS
<222〉 (96),. (980)
<400〉 10
accagtttta gatattcatc aaggtcttgc ctgctttgtt ttaggcaatt ccctccagta 60 ccaagccctc ttctcagaaa actccctccg cggca atg cct ctt cat ttc tea 113
Met Pro Leu His Phe Ser 1 5
tgg aat cca aca gaa gac cct cac aca gta cgc cct act gag get etc 161 Trp Asn Pro Thr Glu Asp Pro His Thr Val Arg Pro Thr Glu Ala Leu
10 15 20
agg aat cag age aat gga cgt cgc ggg gcc cct cga tta aga aga ata 209 Arg Asn Gin Ser Asn Gly Arg Arg Gly Ala Pro Arg Leu Arg Arg lie
25 30 35
aaa tec att aaa tat tgg cat cgt agg gtt tgg aaa eta cca ccei att 257 Lys Ser lie Lys Tyr 丁rp His Arg Arg Val 丁rp Lys Leu Pro Pro lie
40 45 50
tct ggt gaa aac cat ggt gaa gcc ggg cca ccc ggt get cgc cca ttc 305 Ser Gly Glu Asn His Gly Glu Ala Gly Pro Pro Gly Ala Arg Pro Phe 55 60 65 70
cag gac gga eta tac gga ggc cac tgc gag ate ggg gtt caa ttc ttc 353 Gin Asp Gly Leu Tyr Gly Gly His Cys Glu lie Gly Val Gin Phe Phe
75 80 85
aga gac gcg gac gat ttc tgc gaa gag cat cca gag ate ata ctg atg 401 Arg Asp Ala Asp Asp Phe Cys Glu Glu His Pro Glu lie lie Leu Met
90 95 100
tgc gca tec ate act ttg gtg gga gga cgt get gaa gtc tct gcc aac 449 Cys Ala Ser lie Thr Leu Val Gly Gly Arg Ala Glu Val Ser Ala Asn
105 110 115
aca gcg cct gaa gag gag tac get ttt cgc aga cgt cct gtc tgt gaa 497 Thr Ala Pro Glu Glu Glu Tyr Ala Phe Arg Arg Arg Pro Val Cys Glu
120 125 130
aga gtt tec gca ccg gtt gtt cct gca ggt ttt gtc gcc cga gtc gat 545 Arg Val Ser Ala Pro Val Val Pro Ala Gly Phe Val Ala Arg Val Asp 135 140 145 150
gtg ctg tgc act cat ccc atg ttt ggt cca gag age age aag gac gat 593 Val Leu Cys Thr His Pro Met Phe Gly Pro Glu Ser Ser Lys Asp Asp
155 160 165
ttg ggc gac etc cct ttc gtt tac gat aag gtt agg gtt tct aac gaa 641 Leu Gly Asp Leu Pro Phe Val Tyr Asp Lys Val Arg Val Ser Asn Glu
170 175 180
ggt ttg aga gcc aag cac tgc gag cgt ttt etc eiac ata ttt teg tgc 689 Gly Leu Arg Ala lys His Cys Glu Arg Phe Leu Asn lie Phe Ser Cysgag Glu
gtc Val 215 鄉 Arg
tta Leu
t^t Tyr
tta Leu
ggc Gly 200 gcg Ala
ctg Leu
ctg Leu
gga Gly
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185 tgc Cys
Glu
ggc Gly
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etc Leu 265 atg Met
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Ser
ttg Leu
atg Met
Gin
Glu 235 gcc Ala
gtg Val 250
ttx atg Phe Met
gcg Uc Als Phe
gtc Val
Uc Phe 220 tec Ser
tgg Trp
tat Tyr
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gag Glu 205 att lie
set Thr
朋t Asn
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tea Ser 285
190 atg Met
teg Ser
ccg Pro
lie
gtc Val 270 etc Leu
tgt Cys
Thr His Thr
att lie
gcc Ala 255 aat Asn
卿
gca gaa Ala Glu 210
get Ala 240
ggg Gly
teg Ser
Asn
gU Vai 225
3CC
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Asp
att lie
哪 Glu
ggg Gly
朋g tys
Ser
g朋 Glu
gtt Val 290
195 cat His
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tu
Phe
Gin 275 teg Ser
gat Asp
atg Met
城 Tyr
gat Asp 260 ate lie
ggt Gly
cgc tat Arg Tyr
Ug ggg Leu Gly 230
Glu Lys 245
att t3t lie Tyr
gag agg Glu Arg
tea ast Ser Asn
taa gaattttaaa ggtttcgatt tgettgaage ggcttgtgta tgaagtacca
737
785
833
881
929
977
1030
295
tttgtagacaataatgaattcgag犯tgttgttcaagatgaaatggttaa gaaggatggg1090
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C3CttgtC3g犯aacttctatgtttgtagctttccgaaagtggaactttt1390
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tttctcatttcatttcatttttgtct1476
<210〉 11
〈211〉 294
<212〉 PRT
〈213〉灰绿云杉(Picea
glauca)
<■〉 11 Met Pro Leu
1
Arg
Pro
Trp
Pro 65 工le
Pro
Pro Arg
50 Gly
Gly
Glu
Thr
Leu 35 Leu
Ala
Val
lie
His Phe Ser Trp Asn Pro Thr Glu Asp Pro His Thr Val
5 10 15
Glu Ala Leu Arg Asn Gin Ser Asn Gly Arg Arg Gly Ala
20 25 30
Arg Arg lie Lys Ser lie Lys Tyr Trp His Arg Arg Val
40 45 Pro Pro lie Ser Gly Glu Asn His Gly Glu Ala Gly Pro
55 60 Arg Pro Phe Gin Asp Gly Leu Tyr 。y Gly His Cys Glu 70 75 80
Gin Phe Phe Arg Asp Ala Asp Asp Phe Cys Glu Glu His
85 90 95
lie Leu Met Cys Ala Ser lie Thr Leu Val Gly Gly Arg 100 105 110
38Ala Glu Val Ser Ala Asn Thr Ala Pro Glu Glu Glu Tyr Ala Phe Arg
115 120 125
Arg Arg Pro Val Cys Glu Arg Val Ser Ala Pro Val Val Pro Ala Gly
130 135 140
Phe Val Ala Arg Val Asp Val Uu Cys 丁hr His Pro Met Phe Gly Pro 145 150 155 160
Glu Ser Ser Lys Asp Asp Leu Gly Asp Leu Pro Phe VaTyr Asp Lys
165 170 175
Val Arg Val Ser Asn Glu Gly Leu Arg Ala Lys His Cys Glu Arg Phe
180 185 190
Leu Asn lie Phe Ser Cys Glu Gly Cys Arg Met Val Glu Met Ser Cys
195 200 205
Ala Glu His Asp Arg Tyr Val Ala Glu Ser Gin Phe lie Thr His Thr
210 215 220
Val Gly Arg Met Leu Gly Arg Leu Gly Leu Glu Ser Thr Pro lie Ala 225 230 235 240
Thr Lys Gly Tyr Glu Lys Leu Leu Glu Val Ala Trp Asn lie Ala Gly
245 250 255
Asp Ser Phe Asp lie Tyr Tyr Gly Leu Phe Met Tyr Asn Val Asn Ser
260 265 270
lie Glu Gin lie Glu Arg Leu Asp Met Ala Phe Asn Ser Leu Lys Asn
275 280 285
Glu Val Ser Gly Ser Asn 290
〈210> 12 <211> 840 <212〉陽
<213〉集胞藻属(Synechocystis sp.)
<220〉 <221> CDS <222〉 (1). ， (840)
<400〉 atg Eaa Met Lys 1
gga gac Gly Asp
C犯3gC
Gin Ser
ggt c犯 Gly Gin 50
act cct Thr Pro
65 eta tcg
12
lie
ttg Leu
Thr 35
Asp
ata lie
ggt Gly
cgt Arg 20 tgt Cys
Val 5
cgt Arg
g犯 Glu
tta tct Leu Ser
caa tta Gin Leu
gcc
gtt ggt
Val Gly
egg ggc Arg Gly
犯￡1 gC3
ctt Leu
att lie 70
ttg ggt Leu Gly
cat His
gtg Val 40
etc Leu 55 ttg Leu
tat Tyr 25 g犯 Glu
Gin Thr
cct Pro
Thr
gtc act gat
Ua aU Leu lie 10
ttg att Leu lie
Arg Gin
gca a犯 Ala Lys
eta gag Leu Glu 75
gtg gcc
ggg get Gly Ala
ggg gtt Gly Val
ttg gtg Leu Val 45
ata att lie lie 60 aag ctt lys leu
tec Ser
tct Ser 30 gat Asp
Ug Leu 15 egg Arg
gaa Glu
gcg Ala
Gin
gcg Ala
48
96
144
Ut ctt tgt 192 Phe Leu Cys
att ccc cat 240 lie Pro His 80
tct gts a犯acg gcg 288Leu Ser Pro Thr
ate gcc lie Ala
ccc. atg Pro Met
Ua tU Leu Phe 130 cca gag Pro Glu 145
Lys lie
3tt tec lie Ser
gcc ggt Ala Gly
agt tcg Ser Ser 210 ttg ggc Leu Gly 225
ttg
Leu Gin
gag Glu
gcc Ala 115 gtx Val
ccg Pro 100 ggc Gly
Asn
c犯ttg Gin Leu
tac etc Tyr丄eu
cat His
g朋 Glu 195 ggt Gly
tta Leu 180 s犯 Lys
ttt Phe
acc atg Thr Met
g3C t3t
Asp Tyr
Asn Gin Gin
g3t egg Asp Arg
gac Asp 275
tgg Trp 260 犯g Lys
Ala 85 gcc Ala
lie Val Thr Asp Val Ala Ser Val 90
tct ggg ttc att Ser Gly Phe lie
agt Ser
get Ala
tgc Cys 165 cct Pro
atg Met
cgt Arg 245 cct Pro
Gin
ctt Leu
aca gcg Thr Ala
get ccc Ala Pro
tgt Cys 150 act Thr
gta Val
印t ggg Asp Gly
egg gat Arg Asp
Ala 230
C3g
Gin Glu
tat gtt Tyr Val
gcc Ala
tat Tyr 135 tta Leu
Pro
atg Met
Asp
Thr 215 acc Thr
His
etc Leu
g貼 Glu
cag Gin 120 gtg Val
tgg Trp 105 ggc Gly
etc Leu
cgt tea Arg Ser
gca gac Ala Asp
gtg
Val
att lie 200 agt Ser
agt Ser 185 etc Leu
egg
3tC gac
lie Asp
set ccc Thr Pro
gtg ttg Val Leu 155 cat gac His Asp 170
get get Ala Ala
Lys Leu
gtg gga Val Gly
tat貼c Tyr Asn
ggg gcg Gly Ala 125
3CC g33
Thr Glu 140
gaa ccc Glu Pro
c犯ges Gin Ala
tta ate Leu lie
gCC
Ala Gin 205 ggc ggc Gly Gly 220
get ttg Ala Leu
ctg Leu
His taa 280
g3t
Asp
cgt Arg 265
caa egg Gin Arg 235 cag eta Gin Leu 250
ctt tta caa caa Leu Leu Gin Gin
3tt acc lie Thr
Lys Thr Ala 95
ggt ggt cac Gly Gly His 110
gaa gaa犯t Glu Glu Asn
tat act gac Tyr Thr Asp
ctg ggg gta Leu Gly Val 160
gta gcc tgg Val Ala Trp 175
caa gcc tgt Gin Ala Cys 190
朋t ttg gcc Asn Leu Ala
aac ccg gag Asn Pro Glu
eta aaa郞t Leu Lys Ser 240
eta att agt leu lie Ser
255 acc aac ggc Thr Asn Gly 270
336
384
432
480
528
576
624
672
720
768
816
840
<210〉 13 〈211〉 279 <212〉 PRT
<213〉集胞藻属(Synechocystis sp.)
〈400〉 13
Met Lys lie Gly Val Val Gly Leu Gly Leu lie Gly Ala Ser Leu Ala
15 10 15
Gly Asp Leu Arg Arg Arg Gly His Tyr Leu lie Gly Val Ser Arg Gin
20 25 30
Gin Ser Thr Cys Glu Lys Ala Val Glu Arg Gin Leu Val Asp Glu Ala 35 40 45
40Gly Gin 50
Thr Pro 65 Leu Ser
lie Ala
Pro Met
Leu Phe 130 Pro Glu 145
Lys lie
Asp
lie
Pro
Glu
Ala 115 Val
Gin Tyr lie Ser His
Ala Gly
Ser Ser 210 Leu Gly 225
Leu Gin
Glu 195 Gly
Thr Asp Asn Gin Gin
Asp Arg
Asp 275
Leu
Gin
Thr
Pro 100 Gly
Asn
Leu
Leu
Leu 180 Lys
Phe
Met
Tyr
Trp
Lys
Ser
Leu
Ala 85 Ala
丁hr
Ala
Ala
Cys 165 Pro
Asp
Arg
Met
Arg 245 Pro
丁yr
Leu
lie 70 lie
Ser
Ala
Pro
Cys 150 丁hr
Val
Gly
Asp
Ala 230 Gin
Glu
Val
Leu 55 Leu
Val
Gin
Ala
Tyr 135 Leu
Pro
Met
Asp
Thr 215 Thr
His
leu
Glu
Gin
Pro
Thr
Leu
Gin 120 Val
/\rg
Ala
Val
lie 200 Ser
丁yr
Leu
His
Thr
Thr
Asp
Trp 105 Gly
Leu
Ser
Asp
Ser 185 Leu
Arg
Asn
Asp
Arg 265
Aia
Leu
Val 90 Ser
lie
Thr
Val
His 170
Ala
lys
Val
Gin
Gin 250 Leu
Lys
lie lie Phe 60
Lys Leu lie
Glu
75
Aid Ser Vsl l>ys
Gly
Asp
Pro
leu 155 Asp
Ala
Leu
Gly
Arg 235 Leu
Leu
Phe lie Gly 110
Gly Ala Glu 125
Thr Glu Tyr 140
Glu Pro Leu
Gin Ala Val
Leu lie Gin 190
Ala Gin Asn
205 Gly Gly Asn 220
Ala Leu Leu
lie Thr Leu
Gin Gin Thr 270
Leu
Pro
Thr 95 Gly
Glu
Thr
Gly
Ala 175
Ala
Leu
Pro
Lys
lie 255 Asn
Cys
His 80 Ala
His
Asn
Asp
Val 160 Trp
Cys
Ala
Glu
Ser 240 Ser
Gly
<210〉 14
<211> 1359 <212>薩
<213〉酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<220>
〈221> CDS
〈222〉 (1).. (1359)
〈400〉 14
atg gta tea gag gat aag att gag c犯 Met Val Ser Glu Asp Lys lie Glu Gin
1 5 ggt ata att ggt ctg ggt gat atg ggc Gly lie lie Giy Leu Gly Asp Met Gly 20 25 ac3 gat get gga tgg ggt gtt ata tgt Thr Asp Ala Gly Trp Gly Val lie Cys
35 40 gat gaa ctg犯a gaa aaa tat gcc tea
tgg aaa gcc aca aaa gtc att 48 Trp Lys Ala Thr Lys Val lie
10 15 eta tta tac get aat aaa ttt 96 Leu Leu Tyr Ala Asn Lys Phe 30
tgt gat agg gaa g犯tat tat 144 Cys Asp Arg Glu Glu Tyr Tyr 45
get aaa ttc gaa ctg gtg aaa 192Asp
￡131
Asn 65
Glu
卿 I'ys
a_tc lie
Glu 50 ggt Gly
gca Ala
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Leu Lys Glu Lys
gtg cat Val His 130 gtt att Val lie 145
83t tCt
Asn Ser
g犯gsg Glu Glu
get ttc Ala Phe
tgg act Trp Thr 210 gtt aat Vsl Asn 225
Gly Leu Ala Thr Gin Glu
犯g C3t
Lys His 290 tcg eta Ser Leu 305
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tec Ser
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tec Ser
ttg Leu
Asn
Thr 100 Uc Phe
ctt Leu
ate aat lie Asn
gtt atg Val Met
cat His
tta !>eu 195 ctg Leu
gac Asp 180 agt Ser
ggt Gly
ata tea lie Ser
gcc ata Ala lie
agt Ser
ctt Leu 275 act Thr
gca Ala 260 act Thr
ggt
gta tec Val Ser
att lie 85 att lie
g犯 Glu
cat His
His
gca Ala 165 犯g Lys
atg Met
gta Val
eta Leu
Thr
245
Thr
gat Asp
etc Leu
tea aaa age age Ser I>ys Ser Ser 310
tC3 Cat tt3 tea
丁yr 55 agg Arg
Ala Ser Ala Lys
Gin
70 agt Ser
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犯g Lys
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卿 Arg 150 tgt Cys
att lie
Asn
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tac 丁yr
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cat His 250 tta Leu
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g犯 Glu 155
Gin
gaa Glu 140 tct Ser
gtt Val
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ggc Gly
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eta Leu 220 tgg Trp
Gin
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犯g cas Lys Gin
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Thr
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ate tat lie Tyr
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cat gtt His Val
att ctt lie Leu
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tn Phe 285 tta Leu
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att lie
Pro
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Thr 175 cat His
tat 丁yr
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gtt Val 80 tct Ser
g犯 Glu
Thr
cts Leu
gtt Val 160 Ut Tyr
get Ala
cct Pro
Gin
255
gca Ala 240 tat 丁yr
g￡ Glu
ttt gga Phe Gly
Lys 丁yr
Pro
Asn 315
ttg tt.g gcg att gtt gat tcg tgg ttt caa 1008
gtg Val 320
240
288
336
384
432
■
528
576
624
672
720
768
816
864
912
960
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ctt ggt Leu Gly
aga 3ta Arg lie
tta gaa Leu Glu 370 gat gst Asp Asp 385
tct ttt Ser Phe
aag ttc Lys Phe
Met lie
a朋sga. Lys Arg 450
3tt lie
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gcc Ala
ttt Phe
貼3
435 Asn
gat Asp 340 ctg Leu
Thr
g犯 Glu
aat Asn
gag Glu 420 acc Thr
Leu Ser Leu Leu Ala lie 325 330 cca tat gat cat atg att Pro Tyr Asp His Met lie
ggt gtg tec Gly Val Ser
att lie
ttt Phe
ttt Phe 405 cca Pro
gat Asp
gtt Val 390 gat Asp
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gca Ala 375 aU lie
lie
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att ctg sgt lie Leu Ser
g犯 Glu 360 get Ala
Met 345 tat Tyr
ate lie
Val Asp Ser Trp Phe 335
tgt tcg acg cca tta Cys Ser 丁hr Pro Leu
Pro
cat His 440
gag Glu 425 tct Ser
cU Leu
ttt Phe
cat gat His Asp
tcg get Ser Ala
tac肪a Tyr Lys
聊 Arg
肌g Lys 410 get Ala
gaa Glu 395 c犯 Gin
aat Asn
Ser Asp
tta aaa leu Lys 365 aaa tea Lys Ser 380
tgg age 丁rp Ser
ttt cag Phe Gin
etc att Leu lie
cgt tcg Arg Ser 445
Thr
Pro 350 cct Pro
ggc Gly
Gin
ttc Phe
Leu
ttc ata aaa Phe lie Lys
tcg Ser
agt Ser
ggc Gly 430 gcc Ala
gtt Val
gtt Val 415 犯c Asn
get Ala
gtt Val 400 ca^ Gin
gag Glu
Glu
1056
1104
1152
1200
1248
1296
1344
1359
<210〉 15
<211> 452
<212〉 PRT
<213〉酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400〉 15
Met Val Ser Glu Asp Lys lie Glu Gin Trp Lys Ala Thr Lys Vai lie
15 10 15
Gly lie lie Gly Leu Gly Asp Met Gly Leu Leu Tyr Ala Asn Lys Phe
20 25 30
Thr Asp Ala Gly Trp Gly Val lie Cys Cys Asp Arg Glu Glu Tyr Tyr
35 40 45
Asp Glu Uu Lys Glu Lys Tyr Ala Ser Ala L^s Phe Glu Leu Val Lys
50 55 60
Asn Gly His Leu Vai Ser Arg Gin Ser Asp Tyr lie lie Tyr Ser Val 65 70 75 80
Glu Ala Ser Asn lie Ser Lys lie Val Ala Thr Tyr Gly Pro Ser Ser
85 90 95
Lys Val Gly Thr lie Val Gly Gly Gin Thr Ser Cys Lys Leu Pro Glu
100 105 110
lie Glu Ala Phe Glu Lys Tyr Leu Pro Lys Asp Cys Asp lie lie Thr
115 120 125
Val His Ser Leu His Gly Pro Lys Val Asn Thr Glu Gly Gin Pro Leu 130 135 140Val 145 Asn
Glu
Ala
Trp
Val 225 Gly
Ala
Gin
Lys
Ser 305 Pro
Leu
Arg
Leu
Asp 385 Ser
Lys
Met
lie
Glu
Phe
Thr 210 Asn
Leu
Thr
Glu
His 290 Leu
Asn
Gly
lie
Glu 370 Asp
Phe
Phe
lie
Arg 450
lie Asn His His
Met
Leu 195 Leu
lie
Ala
Ser
Leu 275 Thr
Ser
Ser
lie
Phe 355 Gin
Leu
Ala
Phe
Lys 435 Asn
Asp 180 Ser
Gly
Ser
lie
Ala 260 丁hi'
Gly
Lys
His
Asp 340 Leu
Thr
Glu
Asn
Glu 420 Thr
Thr
A. la 165
Met
Val
Leu
Thr 245 Thr
Asp
Leu
Ser
Leu 325 Pro
Gly
lie
Phe
Phe 405 Pro
lie
Arg 150
Cys
lie
Gly
Asn
Arg 230 Asn
Glu
Arg
Leu
Ser 310 Ser
Tyr
Val
Asp
Val 390 Asp
Met
Leu
Ser
Leu
Thr
Ser
lys 215 lie
Pro
Leu
Leu
Leu 295 lie
Leu
Asp
Ser
Ala 375 lie
lie
Leu
Ser
Gin
Lys
Ala
Ala 200 Trp
Tyr
Ser
Phe
Leu 280 leu
Gly
Leu
His
Glu 360 Ala
Ser
Tyr
Pro
His 440
丁yr
Pro Glu Ser Phe 155
Lys Gin Val Tyr 170
Thr Gin Ala Val
Asp 185
Trp Ala Lys lie Lys 205 Glu
Tyr Ser Ala
Gly Gly Leu 220
Asn Lys Trp
235 His Gin Gin 250
Leu Met lie
Ser 265
Lys Ala Lys Gin
Asp Asn Ala
Met
345 Tyr
lie
Ala
Lys
Glu 425 Ser
Asp Thr lie 300
Ser Asn Asn
315 lie Val Asp 330
lie Cys Ser
Leu Phe Leu
His Asp Lys 380
Arg Glu Trp
395 Lys Gin Phe 410
Ala Asn Leu Ser Asp Arg
His
lie
Asp
Phe 285 Leu
Cys
Ser
Thr
Lys 365 Ser
Ser
Gin
lie
Ser 445
Glu
Leu
Thr 190 lie
Asn
Val
Leu
Asn 270 Val
Glu
Lys
Trp
Pro 350 Pro
Phe
Ser
Ser
Gly 430 Ala
Phe
Thr 175 His
Tyr
Val
Tyr
Gin 255 Lys
Phe
Lys
Pro
Phe 335 [>eu
Gly
lie
Val
Val 415 Asn
Ala
Val 160 Tyr
Ala
Pro
Lys
Ala 240 Tyr
Glu
Gly
Tyr
Val 320 Gin
Phe
Leu
Lys
Val 400 Gin
Glu
Glu
<210〉 16 〈211> 1116 〈212〉 DNA
<213〉枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<220〉
<221> CDS
<222〉 (1).. (1116)
<400> 16atg Met 1
ggc Gly
aat Asn
ggt Gly
C犯3tg
Gin Met
att ate lie lie
Leu
g站 Glu 65 atg Met
acg Thr
gtg Val
tea Ser
Ala 145 gaa Glu
ggc Gly 50
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ctt Leu
gat Asp
ctg Leu
cat His 130 ttt Phe
cag Gin
Asn
lie 225 tta Leu
ctg Leu 210
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tcg Ser
Gly 35 gtg
att lie 20 ate lie
sts lie
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Pro 115 犯s Lys
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tta Leu
gga Gly 100 age Ser
tea Ser
stt lie
atg tcg Met Ser
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gaa att Glu lie
Pro
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aat Asn
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ccg Pro
lie
Lys 260
5
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gat Asp
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get aca Ala Thr
g貼gag Glu Glu
gta Val
ctg [,eu 85 郎c Ser
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cgc tat Arg Tyr
gga gtg Gly Val
Leu
Asn 165 gag Glu
Thr 150 ctg Leu
cat His
gca Ala
Asp 245 ate lie
tea Ser 230 犯a Lys
cgt
aca ats Thr lie
gcc ate Ala lie
gac ate Asp lie
gac gat Asp Asp
tct Ser
cgt Arg 55
lie
gat Asp 40 get Ala
gcg Ala
cat tea His Ser
caa Lys Gin
gca get Als Ala
ctt gtt Leu Val
Gin
gcc Ala 135
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Pro
ctg Leu
gat Asp
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卿
215 age Ser
ate lie
Thr
ttt Phe 120 get Ala
ggc Gly
aag 匕ys
ggc Gly
ctt leu 200 cgt Arg
3gc Ser
tta Leu
tat Tyr
ttg Leu
25 gaa Glu
gat Asp
Thr
gga Gly
Lys 105 gtc Val
etc leu 10 3站 Lys
cag Gin
tcg Ser
cct Pro
3tt
lie 90 gtg Val
ggs Gly
gcc Ala
aat Asn
ggt Gly
est His
gcg gta Ala Val
gcg犯g Ala Lys
Gin Lys
3Cg
Thr 170
Thr
ggg Gly
gtt Val 185 gtt Val
ttt get Phe Ala
ttt Phe
gtt Val 75 g犯 Glu
gtt Val
ggg Gly
gag Glu
Thr 155 犯t Asn
att lie 60 g肌 Glu
cat His
gst Asp
cat His
ttc Phe 140
g3C
Asp
gcc Ala
etc Leu
Pro
gcg Ala 45 age Ser
gga Gly
ggc Gly 30 ges Ala
ggt Gly
Gin Thr
gag ctt Glu Leu
Tyr
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get Ala 110 atg Met
ttt Phe
ttg Leu 15 犯a Lys
Leu
gtg Val
ctg Leu
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Lys Gin
cat His
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3gc gta ate agt Ser Val lie Ser 190
cac c犯acc cat cat His Gin Thr His His 205
ggg ttc Gly Phe
ccg gca Pro Als
gac Asp
gta Val 265
cgt Arg 250
Glu
Ala
atg Met 235 ttt Phe
ggc Gly 220 tgg Trp
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c犯g肌 Gin Glu
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gag Glu
gat Asp
Asp
tgg Trp
gcg Ala 270
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egg Arg
lys
gtt Val 80 att lie
Gin
gcg ggt Ala Gly
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get Ala
gtg Val 175 cat His
tcg Ser
卿 Arg
att lie
att lie 255 g83 Glu
Val 160 g犯 Glu
m
Phe
g犯 Glu
gat Asp
Ua Leu 240 cgt Arg
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48
96
兩
192
240
288
336
384
432
480
528
576
624
672
720
768
816
45cta ttt
Leu Phe
ctt Leu
gta Val 305 gcg Ala
egg Arg 290 ccc Pro
gag Glu
gat att Asp lie
tat Tyr
agg Arg
get Ala 370
cgt Arg 275 ca_g Gin
gat Asp
cgc
Asn
gca Ala 355 gat Asp
丁yr
卿 Lys
cat His
lie
ggg Gly 340
Glu
"tga
tu Phe
gga Gly
ccg Pro
agt Ser 325 stt lie
gcg Ala
ggt Gly 310 ate lie
tta Leu
caa tgc Gin Cys
gcc Thr Ala
280 ata cct lie Pro 295 gts Val
acg aat Thr Asn
agg Arg
att lie
ate lie
gaa Glu 360
aag Lys
gca Ala
gat Asp
tu
Phe
ata lie
tec gag Ser Glu
ate lie
agt Ser 345 gcc Ala
cgc Arg 330 ttt Phe
egg Arg
tat cgc Tyr Arg
tat gat Tyr Asp 300 ats ￡ica lie Thr 315
stt ate lie lie
C3g tCt
Gin Ser
gcg g犯 Ala Glu
gac Asp 285 tta Leu
ggg Gly
tat Tyr
ctg Leu
gtg Val
gcg ate tta Ala lie Leu
Glu
gat Asp
tat Tyr 365
Thr
Asp 350 g犯 Glu
cga Arg 335 gac Asp
act Thr
ccg Pro
gst Asp
get Ala 320 gag Glu
cgc Arg
ttt Phe
864
912
960
1008
1056
1104
1116
<210> 17
〈211〉 371
<212> PRT
<213〉枯草芽孢杆菌(Bacillus subtiiis)
<400〉 17 Met Asn 1
Gly
lie
Leu
Glu 65 Met
Thr
Val
Ser
Ala 145 Glu
Met
Gly
lie
Gly 50 Ala
leu
Asp
Leu
His 130 Phe
Gin
Ser
Gin
Ser
Gly 35 Val
Ala
Glu
Val
Pro 115 Lys
Tyr
Leu
Pro
Met
lie 20 I]e
lie
Thr
Glu
Gly 100 Ser
Ser
lie
Lys
Glu
Lys 5
Ala
Asp
Asp
Val
Leu 85 Ser
Arg
Gly
Leu
Asn 165 Glu
Asp
Leu
lie
Asp
lie 70 Ala
Thr
Tyr
Val
Thr 150 Leu
His
Thr
Ala
Ser
Arg 55 lie
His
Lys
Gin
Ala 135 Pro
Leu
Asp
lie
lie
Asp 40 Ala
Ala
Ser
Gin
Phe 120 Ala
Gly
Lys
Gly
Leu
lys 25 Glu
Asp
Thr
Gly
Lys 105 Val
Ala
Gin
Gly
Val
Leu 10 Lys
Gin
Ser
Pro
lie 90 Val
Gly
匕ys
Lys
Ala Gly Leu
Asn His Pro
Ala Val Ala 45
Phe lie Ser 60
Val Glu Gin 75
Glu His Glu
Val Asp Tyr
Gly His Pro 125
Glu Phe Leu
140 Thr Asp Lys 155
Asn Ala His
Thr 170
Thr Ser Val lie
Gly
Gly 30 Ala
Gly
Thr
leu
Ala 110 Met
Phe
Gin
Phe
Ser
Leu 15 Lys
Leu
Val
Leu
Leu 95 Asp
Ala
Glu
Ala
Val 175 His
lie
Arg
Lys
Lys
Val 80 lie
Gin
Gly
Asn
Val 腦 Glu
Phe180 185 190
Pro His lie Val Ala Ala Ser Leu Val His Gin Thr His His Ser Glu
195 200 205
Asn Leu Tyr Pro Leu Val Lys Arg Phe Ala Ala Gly Gly Phe Arg Asp
210 215 220
lie Thr Arg lie Ala Ser Ser Ser Pro Ala Met Trp Arg Asp lie Leu 225 230 235 240
Leu His Asn Lys Asp Lys lie Leu Asp Arg Phe Asp G]u 丁rp lie Arg
245 250 255
Glu lie Asp Lys lie Arg Thr Tyr Val Glu Gin Glu Asp Ala Glu Asn
260 265 270
Leu Phe Arg Tyr Phe Lys Thr Ala Lys Asp Tyr Arg Asp Gly Leu Pro
275 280 285
Leu Arg Gin Lys Gly Ala lie Pro Ala Phe Tyr Asp Leu Tyr Val Asp
290 295 300
Val Pro Asp His Pro Gly Val lie Ser Glu lie Thr Ala lie Leu Ala 305 310 315 320
Ala Glu Arg lie Ser lie Thr Asn lie Arg lie lie Glu Thr Arg Glu
325 330 335
Asp lie Asn Gly lie Leu Arg lie Ser Phe Gin Ser Asp Asp Asp Arg
340 345 350
Lys Arg Ala Glu Gin Cys lie Glu Ala Arg Ala Glu Tyr Glu Thr Phe
355 360 365
Tyr Ala Asp 370
〈210〉 18 <212〉 DNA
<213〉大肠杆菌(Escherichia coli)
<220>
<221〉 CDS
〈222〉 (1)., (1122)
<400〉 18
atg gU get g犯
Met Val Ala Glu
aaa gcg ctg ctg Lys Ala Leu Leu 20
gtg ggc gag gtg Val Gly Glu Val 35
cgc gag gca tct Arg Glu Ala Ser 50
ggt gta ccg cca Gly Val Pro Pro 65
ttg acc gca tta Leu Thr Ala Leu 5
aat tta tta gcg Asn Leu Leu Ala
aaa age cgc ttt lys Ser Arg Phe 40
atg Ug gcc teg Met Leu Ala Ser 55
gat ctg att gag Asp Leu lie Glu 70
cgc gat c犯3tt gst Arg Asp Gin lie Asp 10
aag cgt ctg gaa ctg Lys Arg Leu Glu Leu 25
gga ctg cct att tat Gly Leu Pro lie Tyr 45
cgt cgt gca gag gcg Arg Arg Ala Glu Ala 60
gat gtt Ug cgt egg Asp Val Leu Arg Arg 75
gaa gtc gat 48 Glu Val Asp 15
gtt get gaa 96 Val Ala Glu 30
gtt ccg gag 144 Val Pro Glu
gaa get ctg 192 Glu Ala Leu
gtg atg cgt 240 Val Met Arg 80
47gaa tct tac tec agt gaa aac gac aaa gga ttt a犯aca ctt tgt ccg 288 Glu Ser Tyr Ser Ser Glu Asn Asp Lys Gly Phe Lys Thr Leu Cys Pro
85 90 95
tea ctg cgt ccg gtg gtt ate gtc ggc ggt ggc ggt cag atg gga cgc 336 Ser Leu Arg Pro Val Val lie Val Gly Gly Gly Gly Gin Met Gly Arg
100 105 110
ctg ttc gag aag atg ctg acc etc teg ggt tat cag gtg egg att ctg 384 Leu PFie Glu Lys Met Leu Thr Leu Ser Gly Tyr Gin Val Arg lie Leu
115 120 125
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130 135 140
atg gtg att gtt agt gtg cca ate esc gtt act g兆ess gtt att ggc 480 Met Val Ie Val Ser Val Pro lie His Val Thr Glu Gin Val lie Gly 145 150 155 160
aaa tta ccg cct tta ccg aaa gat tgt att ctg gtc gat ctg gca tea 528 Lys Leu Pro Pro Leu Pro Lys Asp Cys lie Leu Val Asp Leu Ala Ser
165 170 175
gtg aaa aat ggg cca Ua cag gcc atg ctg gtg gcg cat gat ggt ccg 576 Val Lys Asn Gly Pro Leu Gin Ala Met Leu Val Ala His Asp Gly Pro
180 185 190
gtg ctg ggg eta cac ccg atg ttc ggt ccg gac age ggt age ctg gca 624 Val Leu Gly Leu His Pro Met Phe Gly Pro Asp Ser Gly Ser Leu Ala
195 200 205
aag caa gtt gtg gtc tgg tgt gat gga cgt aaa ccg gaa gca tac caa 672 Lys Gin Vai Val V'al Ti，p Cys Asp Gly Arg Lys Pro Glu Ala Tyr Gin
210 215 220
tgg ttt ctg gag caa att cag gtc tgg ggc get egg ctg cat cgt att 720 Trp Phe Leu Glu Gin lie Gin Val Trp Gly Ala Arg Leu His Arg lie 225 230 235 240
age gcc gtc gag cac gat cag aat atg gcg Ut att cag gca ctg cgc 768 Ser Ala Val Glu His Asp Gin Asn Met Ala Phe lie Gin /Ua Leu Arg
245 250 255
cac ttt get act ttt get tac ggg ctg cac ctg gca gaa gaa aat gtt 816 His Phe Ala Thr Phe Ala Tyr Gly Leu His Leu Ala Glu Glu Asn Val
260 265 270
cag ctt gag caa ctt ctg gcg etc tct teg ccg att tac cgc ctt gag 864 Gin Leu Glu G]n Leu Leu Ala Leu Ser Ser Pro lie 丁yr Arg Leu Glu
275 280 285ctg gcg atg gtc ggg cga ctg ttt get cag gat ccg cag ctt tat gcc 912 Uu Ala Met Val Gly Arg Leu Phe Ala Gin Asp Pro Gin Leu Tyr Ala
290 295 300
gac ate att atg teg tea gag cgt aat ctg gcg Ua ate aaa cgt tac 960 Asp lie lie Met Ser Ser Giu Arg Asn Leu Ala Leu lie Lys Arg Tyr 305 310 315 320
tat aag cgt Uc ggc gag gcg att gag "ttg ctg gag cag ggc gat aag 1008 Tyr Lys Arg Phe Gly Glu Ala lie Glu Leu Leu Glu Gin Gly Asp Lys
325 330 335
cag gcg Ut att gac agt Uc cgc aag gtg gag cac tgg ttc ggc gat 1056 Gin Ala Phe lie Asp Ser Phe Arg Lys Val Glu His Trp Phe Gly Asp
340 345 350tac gca cag Tyr Ala Gin 355
aat gac aat Asn Asp Asn 370
cgt ttt cag agt Arg Phe Gin Ser
cgc cag taa Arg Gin
g犯age cgc Glu Ser Arg 360
gtg ttg Val Leu Leu 365
cgt Arg
C3g
Gin
gcg 1104 Ala
1122
<210〉 19
<211〉 373
<212〉 PRT
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400〉 19
Met 1
Lys
Val
Arg
Gly 65 Glu
Ser
Leu
Glu
Met 145
Lys
Val
Val
Lys
Trp 225 Ser
His
Gin
Leu
Val Ala Glu Ala
Gly
Glu 50 Val
Ser
Leu
Phe
Gin 130 Val
Leu
tys
Leu
Gin 210 Phe
Ala
Phe
Leu
Ala 290
Leu
Glu 35 Ala
Pro Pro Asp
Tyr
Arg
Glu 115 His
lie
Pro
Asn
Gly 195 Val
Leu
Val
Ala
Glu 275 Met
Leu 20 Val
Ser
Pro
Ser
Pro 100 Lys
Asp
Val
Pro
Gly 180 Leu
Val
Glu
Glu
Thr 260 Gin
Val
leu 5
Asn
Lys Ser Arg
Met
Ser 85 Val
Met
Trp
Ser
Leu 165 Pro
His
Val
Gin
His 245 Phe
Leu
Gly
Thr
Leu
Ser
Leu
Leu 70 Glu
Val
Leu
Asp
Val 150 Pro
Leu
Pro
Ala Leu
Ala 55 lie
Asn
lie
Thr
Arg 135 Pro
Lys
Gin
Met
Trp Cys 215 Gin
lie 230 Asp
Ala
Leu
Arg
Gin
丁yr
Ala
Leu 295
Leu
Ala
Phe 40 Ser
Glu
Asp
Val
Leu 120 Ala
lie
Asp
Ala
Phe 200 Asp
Val
Asn
Gly
Leu 280 Phe
Arg Asp 10
Lys Arg
25 Gly Leu
Arg Arg
Asp Val
Gin lie Asp
Leu Glu Leu
Pro lie Tyr 45
Ala Glu Ala 60
Leu Arg Arg 75
Phe Lys Thr
Lys Gly 90
Gly Gly Gly Gly Gin 105
Ser Gly
Ala Asp
His Val
Cys lie 170 Met Leu 185
Gly Pro
Gly Arg
Trp Gly
Met Ala 250 leu His 265
Ser Ser Ala Gin
Tyr Gin Val 125
lie Val Ala 140
Thr Glu Gin 155
Leu Vsl Asp
Val Ala His
Asp Ser Gly 205
Lys Pro Glu
220 Ala Arg Leu 235
Phe lie Gin
Leu Ala Glu
Pro lie Tyr 285
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Glu
Val 30 Val
Glu
Val
Leu
Met 110 Arg
Asp
Val
Leu
Asp 190 Ser
Ala
His
Ala
Glu 270 Arg
Leu
Val 15 Ala
Pro
Ala
Met
Cys 95 Gly
lie
Ala
lie
Ala 175 Gly
Leu
Tyr
Arg
Leu 255 Asn
Leu
Tyr
Asp
Glu
Glu
Leu
Arg 80 Pro
Arg
Leu
Gly
Gly 160 Ser
Pro
Ala
Gin
lie 240 Arg
Val
Glu
AlaAsp 305 Tyr
Gin
Tyr
Asn
lie lie
Lys Arg
Ala Phe
Ala Gin 355 Asp Asn 370
Met Ser Ser Glu Arg Asn Leu Ala Leu lie Lys Arg Tyr 310 315 320
Phe Gly Glu /Ua lie Glu Leu Leu Glu Gin Gly Asp Lys
325 330 335
lie Asp Ser Phe Arg Lys Val Glu His T卬Phe Gly Asp 345 350 Glu Ser Arg Val Leu Leu Arg Gin Ala 360 365
340
Arg Phe Gin Ser
Arg Gin
<210〉 20
〈211〉 1152 <212〉纖
<213〉草生欧文氏菌(Envinia herbicola〉
<220〉 <221〉 <222〉
CDS (1).
(1119)
<400〉 20 atg gtg get Val
Met 1
a朋
Val
cgt Arg
ggc Gly 65 gas Giu
gcg Ala
ggt Gly
gag Glu 50 gta Val
tec Ser
Ala
ctg Leu
gsg Glu 35 gcg Ala
gaa
ctg Leu 20 gtg Val
ctg Leu
明t Asp
atg Met 145
ttt Phe
130 gtg Val
ctg Leu
5
gat Asp
朋g 匕ys
acc gcg Thr Ala
ctg ctg Leu Leu
sgc cgt Ser Arg
Pro
tat 丁yr
teg atg Ser Met
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g￡ia Ctg CgC
Glu Leu Arg
g朋 Glu 115 gag Glu
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Thr
ccg Pro 100 d站 Lys
gac Asp
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tgg Trp
3gc Ser
ctg Leu
ctg Leu 70 gag Glu
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gtg
150
cag Gin 135 ccg Pro
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get Ala
tac Tyr 40 teg Ser
cgc Arg
犯g 匕ys 25 ggc Gly
cgt Arg
gat Asp 10 cga Arg
ctg Leu
cgc Arg
gag gat gtg Glu Asp Val
gtg att Val lie
etc ggg Leu Gly
gat Asp
gtc Val
eta Leu 120 get Ala
Lys
ggt Gly 105 tea
Ser
gag Glu
ggc Gly 90 ggt Gly
ggc Gly
act Thr
att cac ctg lie His Leu
caa att Gin lie
ctg gaa Leu Glu
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ctg cgt Leu Arg
75 ttt犯s Phe lys
aag ggc Lys Gly
tac acg Tyr Thr
ctg etc Leu Leu 140
3CC gag
Thr Glu 155
gac agt Asp Ser
ctg Leu
Tyr 45 gcc Ala
cgc Arg
3CC
Thr
cag Gin
gtt Val 125 age Ser
cag Gin
gtg Val 30 gtg Val
gaa Glu
gtg Val
etc Leu
atg Met, 110 犯s lys
gat Asp
gtg Val
g"ta Val 15 gcc Ala
gat Asp
gag Glu
cct gag Pro Glu
gcg etc Ala Leu
atg Met
tgt Cys 95 ggc Gly
egg Arg 80 cct Pro
egg
acg ctg Thr Leu
gcc gg3 Ala Gly
lie
gcc Ala 160
48
144
192
240
288
336
384
432
480
50Gin
Val
gta Val
ctg Leu
lys Asn
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528
576
624
672
720
768
816
864
912
960
1008
1056
1104
1152
<210〉 21
〈211〉 373
<212> PRT
<213〉草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)
<400〉 21
Met Val Ala Glu Leu Thr Ala Leu Arg Asp Gin He Asp Ser Val 15 10 15
AspLys
Val
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Gly 65 Glu
Glu
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Gin
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Glu
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Val
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Ala
lie
Asp
Ala
Phe 200 Asp
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Gly
Leu 280 Phe
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Glu 360
Lys 25 Gly
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Trp
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Leu 265 Ser
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Arg Leu Glu Leu Leu Pro Arg Lys
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Leu Thr 155 lie Leu 170
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Gly Ala 235 Ala Phe 250
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60 Arg Arg
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Val Asp
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Leu AI3 315 Leu Leu 330
Val Glu Gin Trp
Val 30 Val
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Leu
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Leu
Asn 190
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Ala
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Ala
Glu 270 Arg
Leu
Glu Gin Gly
Arg Ser
Leu Leu 365
Phe 350 Arg
Ala
Pro
Ala
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Cys 95 Gly
Thr
Ala
lie
Ala 175 Gly
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Leu
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Arg
Leu
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Ala 160 Ser
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Asp
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<210〉 22 <211〉 1129 <212>脆
〈213>番琉(Lycopersicon esculent咖)〈400> 22
atgttttccctttcatctatacaatctaeic
ctcttcaatcatceitcaccagcattcaact
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gattttagtaaga犯attg1129
〈210〉 23
〈211〉 32
〈212〉 DNA <213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸PI <400〉 23
tctccatatg atctttcaat ctcattctca tc 32
<210〉 24 <211> 32 <212> DNA <213>人工序列
<220>
<223〉人工序列的描述寡核苷酸P2 〈400〉 24
ctaactaact aactacatac ctcatcatat cc 32
〈210> 25 <211〉 26 <212> DNA <213>人丁序列
<220〉
<223〉人工序列的描述寡核苷酸P3<400> 25
cctctctttc catatgctcc cttctc 26
<210〉 26 <211> 33 〈212〉 DNA <213〉人工序列
<220〉
〈223>人工序列的描述寡核苷酸P4 <400> 26
ccgccagcca cctccatatg accgacacca tcc 33
<210> 27
<211> 25 <212>飄 <213〉人工序列
<220〉
<223〉人工序列的描述寡核苷酸P5 〈400〉 27
cgccacccct catatgcgta tcgcc 25
<210> 28 〈211> 34 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
<220〉
<223>人工序列的描述寡核苷酸P6 <400> 28
gatgcatctt tgcatatgat gaggtcagaa gatg 34
<210〉 29
<211〉 35
<212〉 DNA <213>人工序列
<220〉
<223〉人工序列的描述寡核苷酸P7 <400〉 29
cagtataatt agtagtcaag gatcctgact gagag 35
<210> 30 <211> 31 〈212〉腿
54<213>人工序列 <220>
〈223>人工序列的描述寡核苷酸P8 <400〉 30
gctaaaactc ttctccttca atacttacct g
权利要求
1.一种能耐受以参与预苯酸转变为L-酪氨酸的代谢步骤中任一步骤的酶为靶酶的除草化合物的植物细胞，其特征在于，它包括了一个编码预苯酸脱氢酶的基因并在它的组织中表达所述的酶。
2. 如权利要求1所述的植物细胞，其特征在于，它能耐受以arogenate脱氢 酶为耙酶的除草剂化合物。
3. 如权利要求2所述的植物细胞，其特征在于，它能耐受除草剂化合物，所 述除草剂化合物以arogenate脱氢酶为耙酶。
4. 如权利要求3所述的植物细胞，其特征在于，所述arogenate脱氢酶是以 多核苷酸编码的。
5. 如权利要求4所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸包含以下的多 核苷酸.-(a) 编码由序列标示符SEQ ID N0: 3 ， SEQ ID NO: 5 ， SEQ ID NO: 7或SEQ ID N0:13所描述的多肽的分离的多核苷酸；(b) 与(a)的多聚核苷酸杂交的分离的多核苷酸。(c )与(a )或(b )的多聚核苷酸有同源性的分离的多核苷酸； (d) (a)， (b)或(c)所述的多核苷酸的片段。
6. 如权利要求5所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸包含选自序列 标示符SEQ ID NO:l， SEQ ID N0:2， SEQ ID N0:4， SEQ ID N0:6或SEQ ID N0:8的多核苷酸。
7. 如权利要求4所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸包含选自以下 的多核苷酸(a) 编码由序列标示符SEQ ID N0:11所描述的多肽的分离的多核苷酸；(b) 与(a)所述的多核苷酸杂交的分离的多核苷酸；(c) 与(a)或(b)所述多核苷酸同源的分离的多核苷酸；(d) (a)， (b)或(c)所述的多核苷酸的片段。
8. 如权利要求7所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸包含选自序列 标示符SEQ ID NO:IO的多核苷酸。
9. 如权利要求4-8任一所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸来源于植物。
10. 如权利要求6所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸来源于拟南芥
11. 如权利要求8所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸来源于灰绿云 衫(尸j'ces ^卵cs)。
12. 如权利要求11所述的植物细胞，其特征在于，所述酶来源于植物。
13. 如权利要求10所述的植物细胞，其特征在于，所述arogenate脱氢酶是 以多核苷酸编码的，所述多核苷酸选自以下的一个多聚核苷酸(a) 编码由序列标示符SEQ ID N0:13所描述的多肽的分离的多核苷酸；(b) 与(a)所述多核苷酸杂交的分离的多核苷酸。(c) 与(a )或(b )所述多核苷酸同源的分离的多核苷酸；(d) (a)、 (b)或(c)所述多核苷酸的片段。
14. 如权利要求13所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸包括选自序 列标示符SEQ ID NO: 11的多核苷酸。
15. 如权利要求13或14所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸来源于 细菌。
16. 如权利要求15所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸来源于集胞 藻属的细菌。
17. 如权利要求16所述的植物细胞，其特征在于，所述酶来源于细菌。
18. 如权利要求13-17任一所述的植物细胞，其特征在于，所述除草剂化合物 是用鉴定以具有arogenate脱氢酶活性的酶为靶酶的除草化合物的方法得到的， 该方法包括步骤(a) 至少准备两个样品，每一个在溶液中含有等量的arogenate脱氢酶；(b) 其中的一个样品用一种化合物处理；(c) 测定所述的每一样品的arogenate脱氢酶活性；(d) 当(c)步骤测定的经处理样品的酶活性比未处理样品的酶活性明显低 时，则可以认定步骤(b)中所用的化合物是一种除草化合物；(e) 将步骤(d)中所鉴定的化合物的除草活性通过用所述的化合物处理植物 予以验证。
19. 如权利要求18所述的方法，其特征在于，步骤(a)中所用的具有arogenate 脱氢酶活性的酶是由多核苷酸编码的。
20. 如权利要求19所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸包含以下的多核苷酸(a) 编码由序列标示符SEQ ID NO: 3 ， SEQ ID NO: 5 ， SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 13所描述的多肽的分离的多核苷酸；(b) 与(a)的多聚核苷酸杂交的分离的多核苷酸。(c )与(a )或(b )的多聚核苷酸有同源性的分离的多核苷酸； (d) (a)， (b)或(c)所述的多核苷酸的片段。
21. 如权利要求20所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸包含选自序 列标示符SEQ ID NO:l， SEQ ID N0:2， SEQ ID N0:4， SEQ ID N0:6或SEQ ID N0:8的多核苷酸。
22. 如权利要求19所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸包含选自以 下的多核苷酸(a) 编码由序列标示符SEQ ID N0:11所描述的多肽的分离的多核苷酸；(b) 与(a)所述的多核苷酸杂交的分离的多核苷酸；(c )与(a )或(b )所述多核苷酸同源的分离的多核苷酸； (d) (a)， (b)或(c)所述的多核苷酸的片段。
23. 如权利要求22所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸包含选自序 列标示符SEQ ID N0:10的多核苷酸。
24. 如权利要求19-23任一所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸来源 于植物。
25. 如权利要求21所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸来源于拟南
26. 如权利要求23所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸来源于灰绿 云衫(尸ices W卵C3)。
27. 如权利要求1所述的植物细胞，其特征在于，它能耐受以预苯酸氨基转移 酶为靶酶的除草剂化合物。
28. 如权利要求1至27任一项所述的耐受性植物细胞，其特征在于，它的编 码预苯酸脱氢酶的基因是一种酵母基因。
29. 如权利要求28所述的耐受性植物细胞，其特征在于，它的编码预苯酸脱 氢酶的基因来源于酵母菌属的酵母菌。
30. 如权利要求28所述的耐受性植物细胞，其特征在于，它的编码预苯酸脱氢酶的基因的由序列标示符是SEQ ID NO: 14。
31. 如权利要求1至27任一项所述的耐受性植物细胞，其特征在于，它的编 码预苯酸脱氢酶的基因是来源于细菌。
32. 如权利要求31所述的耐受性植物细胞，其特征在于，它的编码预苯酸脱 氢酶的基因是来源于芽胞杆菌属细菌。
33. 如权利要求32所述的耐受性植物细胞，其特征在于，它的编码预苯酸脱 氢酶的基因的序列标示符是SEQ ID NO: 16.
34. 如权利要求31所述的耐受性植物细胞，其特征在于，它的编码预苯酸脱 氢酶的基因是来源于大肠杆菌属细菌。
35. 如权利要求34所述的耐受性植物细胞，其特征在于，它的编码预苯酸脱 氢酶的基因的序列标示符是SEQ ID NO: 18.
36. 如权利要求31所述的耐受性植物细胞，其特征在于，它的编码预苯酸脱 氢酶的基因是来源于Erwinia属细菌。
37. 如权利要求36所述的耐受性植物细胞，其特征在于，它的编码预苯酸脱 氢酶的基因的序列标示符是SEQ ID N0:20.
38. 如权利要求1至37任一项所述的耐受性植物细胞，其特征在于，它除了 含有嵌合基因外，至少还含有编码一个感兴趣蛋白质的多聚核苷酸的另一个基因， 所述嵌合基因至少包含功能上相互联系的以下成分(a) 在宿主生物中有功能的启动子；(b) 编码arogenate脱氢酶的活性的酶的多核苷酸；(c) 在宿主生物中有功能的终止子元件。
39. 如权利要求38所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸包含以下的 多核苷酸(a) 编码由序列标示符SEQ ID N0: 3 ， SEQ ID NO: 5 ， SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 13所描述的多肽的分离的多核苷酸；(b) 与(a)的多聚核苷酸杂交的分离的多核苷酸。(c )与(a )或(b )的多聚核苷酸有同源性的分离的多核苷酸；(d) (a)， (b)或(c)所述的多核苷酸的片段。
40. 如权利要求39所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸包含选自序 列标示符SEQ ID NO:l， SEQ ID NO:2， SEQ ID NO:4， SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8的多核苷酸。
41. 如权利要求38所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸包含选自以 下的多核苷酸(a) 编码由序列标示符SEQ ID N0:11所描述的多肽的分离的多核苷酸；(b) 与(a)所述的多核苷酸杂交的分离的多核苷酸；(c )与(a )或(b )所述多核苷酸同源的分离的多核苷酸； (d) (a)， (b)或(c)所述的多核苷酸的片段。
42. 如权利要求41所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸包含选自序 列标示符SEQ ID N0:10的多核苷酸。
43. 如权利要求38-42任一所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸来源 于植物。
44. 如权利要求40所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸来源于拟南 芥(^rs^it/op57'51 t力sJis/ a)。
45. 如权利要求42所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸来源于灰绿 云衫(尸ices ^朋cs)。
46. 如权利要求38所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸选自以下的 一个多聚核苷酸(a) 编码由序列标示符SEQ ID N0:13所描述的多肽的分离的多核苷酸；(b) 与(a)所述多核苷酸杂交的分离的多核苷酸。(c) 与(a )或(b )所述多核苷酸同源的分离的多核苷酸；(d) (a)、 (b)或(c)所述多核苷酸的片段。
47. 如权利要求46所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸包括选自序 列标示符SEQ ID NO:ll的多核苷酸。
48. 如权利要求46或47所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸来源于细菌。
49. 如权利要求48所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸来源于集胞 藻属的细菌。
50. 如权利要求38所述的耐受性植物细胞，其特征在于，所述启动子是组成 型启动子。
51. 如权利要求38所述的耐受性植物细胞，其特征在于，所述启动子是诱导 型启动子。
52. 如权利要求38-51任一所述的耐受性植物细胞，其特征在于，所述嵌合基因还包括在所述的宿主生物中有功能的信号肽或转运肽。
53. 如权利要求38-52任一所述的耐受性植物细胞，其特征在于，所述宿主生 物是微生物。
54. 如权利要求38-52任一所述的耐受性植物细胞，其特征在于，所述宿主生 物是植物细胞或植物。
55. —种获得对以参与预苯酸转变为L-酪氨酸的代谢步骤中任一步骤的酶为 靶酶的除草剂化合物有耐受性的植物的方法，其特征在于，该方法用编码预苯酸 脱氢酶的基因通过一种使它能在植物组织中表达的方法转化所述的植物。
56. 如权利要求55所述的方法，其特征在于，该方法用于产生对以arogenate 脱氢酶为耙酶的除草剂化合物有耐受性的植物。
57. 如权利要求55所述的方法，其特征在于，该方法用于产生对以预苯酸脱氢酶为靶酶的除草剂化合物有耐受性的植物。
58. 如权利要求55至57任一项所述的方法，其特征在于，预苯酸脱氢酶来源于酵母。
59. 如权利要求55至57任一项所述的方法，其特征在于，预苯酸脱氢酶来源 于真菌。
60. 如权利要求55至57任一项所述的方法，其特征在于，预苯酸脱氢酶来源 于细菌。
全文摘要
本发明涉及除草剂的新靶标和对所述的除草剂有抗性的转基因植物。本发明涉及具有arogenate脱氢酶活性的新酶，特别是植物的arogenate脱氢酶以及编码所述酶的基因。本发明的arogenate脱氢酶催化酪氨酸生物合成代谢途径的最后一步并因此构成除草剂的潜在靶标。因此本发明也涉及鉴定以所述的酶为靶酶的除草剂的方法，所述的除草剂化合物通过与所述的酶结合而防止酪氨酸的生物合成。本发明还涉及对以参与酪氨酸生物合成途径的酶为靶酶，特别是以参与转化L-酪氨酸为预苯酸的酶，具体是arogenate脱氢酶为靶酶的除草剂，有耐受性的转基因植物。这些植物成为耐受性是由于在植物组织中表达了预苯酸脱氢酶，此酶对所述的除草剂不敏感并使植物即使在用所述的除草剂处理后仍能合成酪氨酸。
文档编号C12N15/55GK101560499SQ20081017670
公开日2009年10月21日 申请日期2001年12月5日 优先权日2000年12月5日
发明者M·马特林格, P·里珀特 申请人:阿方蒂农科股份有限公司