红海榄逆转运蛋白基因及其克隆与应用的制作方法

专利名称：红海榄逆转运蛋白基因及其克隆与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及红树植物红海榄(^&，力ow s^A^g) Na7H+逆向转运蛋白基 因RsNHXl及其克隆与应用，属于分子生物学和植物基因工程学范畴。 技术背景我国目前的耕地面积只有18.89亿亩，人均耕地面积不足1.5亩，而且还 处在不断下降的趋势，但我国目前有盐碱化土壤5.2亿亩还未开发。因此培育 耐盐的作物品种，充分利用盐渍地发展农业已显得十分紧迫。地球上有丰富的耐 盐植物资源，耐盐植物是在亿万年长期进化过程中，经过大自然各种严酷考验 和筛选留存下来的一种能够适应在盐碱环境生长的宝贵的种质资源。在我国境 内目前已知的盐生维管植物就有423种，分属66科199属，占世界盐生植物总 数的27%左右。这些植物种类，是发展耐盐耐旱农业的宝贵基因资源。近20年 来，各种植物耐盐相关基因，如脯氨酸合成关键基因P5CS、甜菜碱合成相关基 因甜菜碱脱氢酶(BADH)、 SOD保护酶基因、和离子区域化相关的基因NaYH'逆向 转运蛋白等都相继得到克隆。Na7H+逆向转运蛋白是一种Na+离子通道蛋白，分 布在液泡膜上，负责将细胞质中的^+逆着Na+浓度梯度运送到液泡中区隔化处 理，细胞质膜上的Na7H+逆向转运蛋白将细胞质中的Na+逆向运送到胞外环境， 从而减轻钠离子对细胞质中的其他化合物及细胞器的损害，进而提高植物的耐 盐水平。过度表达拟南芥的J^ft37基因，能使油菜在200 mM盐分条件下开花 结果，可见NaYH+逆向转运蛋白是植物一个重要的耐盐相关基因。红海榄是生长 在热带亚热带海边潮间带的一种红树植物品种，可以忍耐海水长期浸泡，说明 该植物具有一套有效的耐盐机制。 发明内容本发明首次从红树植物红海榄(朋^，力orss0^oss)克隆出Na7H'逆向转 运蛋白基因的全长cDNA，名称RsNHXl。该基因的核苷酸序列为含2051个碱基 对的SEQ ID No. 1，蛋白质序列为含537个氨基酸SEQ ID No. 3.本发明是根据已知的其他植物Na7H+逆向转运蛋白基因中的保守序列，设计 一对简并引物反向引物5 ， -GCATCCAT(A/G/C/T)GG(C/T)TGTAT(A/C)T-3'利用这对简并引物，通过RT-PCR扩增得到一个大约550bp的DNA片段(图 1)，将PCR产物连接到pGEM -T Easy载体上，转化DH5 a大肠杆菌感受态，挑 选单菌落培养，然后进行DNA测序。根据测序结果分别设计用于扩增5'和 3， cDNA末端的PCR引物，然后在分别与5'和3， cDNA末端的接头引物进行PCR 扩增，之后，将PCR产物连接到pGEM _T Easy载体上，转化DH5 a大肠杆菌感 受态，挑选单菌落培养，然后进行DNA测序得知5'和3' cDNA序列，经过比对 拼接可以得到红海榄Na7H+逆向转运蛋白基因RsNHXl的全长cDNA序列(SEQ ID No. 1)。该基因全长2052bp，包括5' UTR，开放阅读框，和3' UTR序列，其 中开放阅读框序列为1614bp，由此推算出该基因全长蛋白有537个氨基酸，将 此氨基酸序列在NCBI基因库进行BLAST检索发现，与水稻，拟南芥Na7H+逆向 转运蛋白相比，氨基酸的同源性分别为70%和69%。该基因的序列信息如下(1) SEQ ID No. 1(a) 序列特征 *长度2094bp *类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b) 分子类型cDNA(C)最初来源红海榄(d) 开放阅读框位置138-1811(e) 序列描述:SEQ ID No. 19011021藤11411201126113211381144115011561162116811741蘭1861192119812041 AAAAAAAAAAA (2) SEQ ID N。. 3(a) 序列特征 *长度537氨基酸*类型氨基酸 *链型单链*拓扑结构线性(b) 分子类型蛋白质 (C)最初来源红海榄(d)序列描述SEQ ID No. 361 FTGn:K丄STGWRSSRTLLFSEELFFIYLLPPIIFNAGFQVKKKQFFRNFmVLFGAVG361 FPLSFISNLTKKSQTDKIGLRQQVIIWWAGLMRGAVSMALAYNKFTMSGHTQLQGDAlLl48i ggsnvtrpislrmllstptntvhycwrkfddafmrpvfggrgf:pyhpgsptesfiq '利用任何一种可以诱导外源基因在植物体中表达的载体，将本发明所提供的编 码红海榄(/ 力2'z，力o2-s^y7oss) Na7H+逆向转运蛋白RsNHXl的基因导入植物细胞， 可提高植物对盐胁迫的耐受力。本发明的基因在构建到植物表达载休中时，在其转录起始核苷酸前加上任何一种强启动或诱导性强启动子，如花椰菜花叶病毒35S启 动子，uniquitin启动子。转化该基因对培育耐盐植物品种，提高作物耐盐水平具 有重要应用价值。


图1为几种植物Na7H+逆转运蛋白RsNHXl基因的氨基酸序列同源性比较。 图2为几种植物Na7H+逆转运蛋白RsNHXl基因的氨基酸序列的系统进化树。
具体实施方式
实施方式1:红海榄Na7H+逆向转运蛋白基因/&tWX/的克隆1. 总RNA提取，利用CTAB法从红海榄根部组织提取总RNA。2. cDNA第一条链的合成取2毫克总RM，分别加入5x反应缓冲液4微升， 10mM dNTP 2微升，核糖核酸酶抑制剂0. 5微升，Superscript II反转录酶2 微升，poly d (T) 3。 l微升，lOmM DTT 2微升，42。C反应60分钟，合成cDNA 第条链。3. 红海榄Na+ZH+逆向转运蛋白cDNA片段的分离本发明是根据已知的其他植物Na7FT逆向转运蛋白基因中的保守序列，设计一对 简并引物正向引物5， -CTTGC(A/T)ATTGG(G/A/T)GC(A/T/C)AT(A/C)TT--3， 反向引物5， -GCATCCAT(A/G/C/T)GG(C/T)TGTAT(A/C)T-3， 然后通过PCR反应来扩增，反应体系为2 wl 第一条cDNA链80 ti 1 H2010 ix 110X PCR缓冲液2 u 1 50X dNTP Mix2 li 1 正向引物(IOuM)2 " 1 反向引物(IOuM)2 1 Taq PolymerasePCR的反应程序为95"C2分钟，然后进入循环95"C1分钟，52 <'C 1分钟， 72"C 1.5分钟，共35个循环，最后72"C 5分钟。PCR琼脂糖凝胶电泳显示扩 增出一条550bp左右的DNA片段。4. 基因片段克隆将PCR扩增得到的DNA片段连接到pGEM -T Easy载体上， 转化DH5a大肠杆菌感受态，挑选单菌落培养，然后进行DNA测序。5.基因全长序列克隆根据己知的cDNA片段设计出用于RACE全长cDNA鉴定 的特异性引物，3'和5，序列的鉴定按Clontech公司SMART RACE cDNA Amplification Kit说明书进行。经过比对拼接可以得到红海榄Na7H+逆向转运 蛋白基因RsNHXl的全长cDNA序列(SEQ ID No. 1)，该基因全长cDNA有2052bp， 包括5' UTR，开放阅读框，和3' UTR序列，其中开放阅读框序列为1614bp， 由此推算出该基因全长蛋白有537个氨基酸，将此氨基酸序列在NCBI基因库进 行BLAST检索发现，与水稻，拟南芥Na7H+逆向转运蛋白相比，氨基酸的同源性 分别为70%和69%。实施方式2:红海榄Na7H+逆向转运蛋白RsNHXl序列分析为了鉴定红海榄Na7tT逆向转运蛋白RsNHXl的功能，发明人将RsNHXl的氨 基酸序列与拟南芥AtNHXl "rs力iobA is ^s7i朋a， AF056190)，盐角草SeNHXl(53./画/co277j'3 ewri9/ ses， AY131235); 水禾舀0sNHXl (5\37a/7o/ /c3， AB021878);云南小麦TaNHXl ( 7yai"朋aeWira/ff, AY040245)等四种已知的 Na7H+逆向转运蛋白进行比较。如图1所示，这些蛋白的氨基酸序列具有-定的 同源性，图中加黑部分为相同序列。其中与水稻，拟南芥Na7H+逆向转运蛋白的 氨基酸的同源性分别为70%和69%。另外，Na7H+逆向转运蛋白的跨膜保守序列"FFIYLLPPI"在所有参比的蛋白中都存在。为了进一步了解红海榄Na7H+逆向转运蛋白与其他耐盐植物Na7H+逆向转运 蛋白的进化关系，发明人再选取几种己知耐盐植物Na7H+逆向转运蛋白，如盐爪 爪KfNHXl (7feh'c/i， /bh'st脂，AY825250);盐地碱蓬SsNHXl (A/sec/a /z ari"/z s subsp. Salsa， AF370358); 番杏TtNHXl (7e^rsgo/7J's z^rw。/^Wofe5"， AF527625);和獐毛A1NHX1 "eA〃，"i",仏，EF590262)进行氨基酸 序列的系统进化树分析，如图2所示，RsNHXl与其他不同耐盐植物该基因遗传 距离较远，与水稻0sNHXl相对最近(70%同源)。 实施方式3:植物表达载体的构建1. 根据鉴定红海榄Na7H+逆向转运蛋白基因7feTWi7的核苷酸序列设计引物 正向引物aattccatgggtttcagtctgggttca反向引物ggaaggtcaccttattgattaaaactttcagta2. 利用这两条引物，通过RT-PCR扩增yfeVy^7基因的开放阅读框，将PCR产物 连接到pGE!P)-T Easy载体上，转化DH5 a大肠杆菌感受态，然后进行序列。3. 碱法提取质粒DNA，用AfcoI和&出II两个限制性内切酶将该基因片段从质粒上切割下来，与用相同两个限制性内切酶酶切的pCAMBIA 1302载体连接， 转化DH5a大肠杆菌感受态，然后在含卡那霉素的LB平板上筛选培养，对 筛选菌落进行PCR检测和质粒DNA酶切鉴定分析。
权利要求
1.一种红海榄钠离子逆向转运蛋白基因，其特征在于该基因全长cDNA具有下述所示的核苷酸序列1GGCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCAAGATTAAGCAGTGGTATCAACGCAG61 AGTGGCCTTTACGGCCGGGGAAGAAGACGAGCTACAGTTTTTCGAAAAGGTTAGGCTACG121 GGGGCTGCGATTGGAGGATGGGTTTCAGTCTGGGTTCAATTGTTTCAAGATTGGTGGCGC181 CATTGGAGGCTGATGAAGCCTCTGTTCACTCTGTTACTCTGTTTGTTGCACTCCTCTGTG241 CTTGCGTACTGATTGGTCAACTTCTTGAGAAGAATCGCTGGGTTAACGAGTCAATCACTG301 CCCTCGCCATCGGTCTCTTCACTGGGATTATTATCCTGTTAAGCACCGGATGGAGAAGCT361 CACGCATATTGTTATTTAGTGAAGAACTTTTCTTCATATATCTTCTGCCCCCTATCATAT421 TCAATGCTGGGTTCCAGGTAAAAAAGAAGCAGTTTTTCCGGAACTTTATAACGATTGTGT481 TGTTTGGTGCTGTGGGGACTTTAATATCCTTTGCCATAGTATCACTAGGTTCGGCGCAGA541 TTTTCAGCAAGATGGATGTGGGTCTCTTGGAAACAGTGGATTATCTTGCACTTGGGGCAA601 TCTTTTCAGCCACAGATACCGTTTGCACATTACAGATCCTTAGTCAGGAAGAGACACCTT661 TACTGTACAGTCTAGTCTTTGGGGAAGGTGTGGTGAATGACGCCACTGCTGTTGTACTAT721 TCAATGCAATCCAGCGTTTCGACCTCTCTCATACCACCTCAAGCATTGCCATGCAATTGT781 TTGGCAATTTCTTATATCTGTTCACTACAAGCACATTGCTTGGTGTGGCGGTTGGATTGT841 TGAGTGCTTACATCATAAAGAAGCTTTACTTTGGCAGGCACTCCACTGATCGTGAAGTGG901 CTTTGATGATACTCATGGCGTATCTTTCATATATGATAGCTGAATTATTCAATTTAAGTG1021 GCATTCTCACAGTGTTCTTCTGCGGGATTGCCATGTCCCACTACACCTGGCATAATGTAA1081 CTGAAAGCTCAAGAGTCACAACAAGACATGCTTTTGCAACATTGTCATTTATATCAGAGA1141 TTTTCATTTTCCTTTATGTTGGTATGGATGCCTTGGACATTGAGAAGTGGAAATTTGTGA1201 GCAAAAGTCCTGGGAAGTCACTTGGTGTCAGTTCTATACTGCTTGGACTAACTCTGATTG1261 GAAGAGCAGCTTCTGTATTTCCCTTATCTTTCATATCCAATCTGACAAAGAAGTCTCAGA1321 CTGACAAGATTGGGTTAAGGCAGCAGGTCATTATCTGGTGGGCTGGACTTATGAGAGGAG1381 CTGTATCTATGGCACTTGCATATAATAAGTTTACTATGTCAGGGCATACTCAATTGCAAG1441 GAGATGCAATCTTGATCACTAGCACCATCACAGTTGTTCTCTTTAGTACTGTGGTATTTG1501 GATTGGCGACCAAGCCTCTTATAAGGTGGTTGTTACCGCAGAAACACTCGAGTGGCATGG1561 TGTCTTCTGGCTTTGACGAGTCGAAGTCTATTGTTCTACCTCTTATTGCAAACGGACAAG1621 ATGCAGAATCTGAGGGCGGTGGAAGTAATGTAACGCGTCCAATTAGTCTACGAATGCTCC1681 TGTCTACGCCAACCAATACTGTCCACTATTGTTGGCGGAAATTTGATGATGCCTTCATGC1741 GTCCGGTGTTTGGTGGGAGGGGATTTGCACCTTATCATCCTGGCTCACCTACTGAAAGTT1801 TTATTCAATAATGGCAACAAGAAGCGCATACTAGATTGTAAATGCTGGGAATATGAGGTA1861 TATATTCCAAACATCAGAGGATTCAAAGGTTCATTTTGTGTAAATAGAATAGGAGTAATA1921 ATTGAGATTGGAGGCTTCCACTGATTATTAGGCGGAATATGCCTGACGCCGAGGAAAAAG1981 TCGTATTAATTTATTTGGCAAATGTGATAATTGGGTAATTACACGCAAAAAAGAAAAAAA2041 AAAAAAAAAAA。
2.根据权利要求l所述的一种红海榄钠离子逆向转运蛋白基因，其特征在于该 基因全长CDNA包含的开放阅读框的核苷酸序列如下述所示
3.根据权利要求1所述的一种红海榄钠离子逆向转运蛋白基因，其特征在于该 基因的开放阅读框编码的蛋白的氨基酸序列如下述所示
4.根据权利要求1所述的克隆的一种红海榄钠离子逆向转运蛋白基因的应用，其特征在于该基因的cDNA或者与之同源性超过909()的DNA序列在植物中过i 表达，能提高转基因植物的耐盐性。
全文摘要
本发明公开一种红海榄钠离子逆向转运蛋白基因及其克隆与应用。本发明所提供的红海榄中Na⁺/H⁺逆向转运蛋白来源于红海榄Rhizophora stylosa，命名为RsNHX1。RsNHX1基因的全长cDNA序列为序列表中的SEQ LD No.1；RsNHX1基因的开放阅读框为序列表中的SEQ LD No.2；RsNHX1基因的蛋白质氨基酸序列为序列表中的SEQ LD No.3。该基因可用于构建的植物表达载体并转化植物，将会提高这些植物的耐盐性，使得这些植物可以在盐碱地上种植或者耐盐水浇灌，具有非常重要的经济效益和社会效益。
文档编号C12N15/29GK101402957SQ20081017599
公开日2009年4月8日 申请日期2008年10月30日 优先权日2008年10月30日
发明者徐远峰, 林栖凤, 翟金玲, 惜 黄 申请人:海南大学