专利名称：一种融合穿透肽的神经细胞营养因子gdnf的制作方法
技术领域：
本发明涉及融合穿透肽的人源神经营养因子GDNF(GDNF，下同)的表达质粒构建 及其表达纯化，其所在的技术领域与生命科学和生物医药技术有关。
背景技术：
人脑神经胶质细胞源性神经营养因子(GDNF，下同)是由脑组织中的神经胶质细 胞产生、分泌的一种有着重要神经生物功能的神经细胞营养因子。GDNF对中枢和外周的 多种神经细胞具有有较广泛的促进神经元生长和分化的神经营养作用，是目前发现的对多 巴胺神经元和运动神经元作用最为显著的一类神经营养因子，尤其对多巴胺神经元作用最 强(Lin LT et al. Science 1993.260(5111) :1130-2 ;Henderson et al. Science 1994， 266(5183) :1062-4)。 国内外对GDNFF的功能进行了广泛的研究，证明GDNF通过PI3K/Akt通路介导，明 显缓和6-羟基多巴胺(6-0HDA)诱发的染色质浓縮和DNA断裂；启动一系列抗凋亡信号途 径而保护神经元，被认为是一种有希望的神经保护治疗药物。 由于血脑屏障的存在，GDNF本身无法经外周血液进入脑组织发挥冶疗功效。近 年国外在动物或人体通过病毒载体的基因治疗或导管直接给药，对GDNF治疗中枢神经系 疾病的作用进行研究(Do Thi NA， Sail lour P， Ferrero L， DedieuJF， Mallet J， Pa皿io T.Gene Ther. 2004 Jan 15 ;Patel NK et al， AnnNeurol. 2005 Feb ;57(2) :298-302)表明 GDNF对多种神经系统疾病，包括帕金森氏病、肌萎縮侧索硬化症和缺血性脑损伤有较好临 床治疗效应，是当今国际上治疗帕金森氏病的热门研究领域之一。国内尚末有在活体开展 研究的报道。 不过，这些途径既增加痛苦和治疗成本，也无助于GDNF在临床上的广泛应用。因 此，克服大脑的血脑屏障，使GDNF能经外周血液循环系统穿越血脑屏障进入脑组织，发挥 其生物活性，达到治疗相关神经系统疾病的目的是关健之所在。 近年来，在科学家发现爱兹病毒HIV的TAT蛋白具有穿透细胞膜和血脑屏障的 功能，并证明融合这种病毒多肽的、具有潜在治疗作用的基因产物蛋白质也同样能够穿 越血-脑屏障，发挥其生物功能之后(Ruzza P， et al. ， J P印t Sci. 2004 Jul ;10(7): 423-6.)，己证实有数种多肽也具有类似HIV-TAT的功能，这些多肽有人时钟基因(clock gene)的N-末序列中的某些氨基酸多肽(Peng T， etal. ， Acta. Biochim. Biophys. Sin (Shanghai). 2004 S印；36(9) :629-36)和由多个赖氨酸(KKKKKKKKK)构成的氨基酸多 肽(Park，J，et al. ，Mol. Cells 2002，April 30 ;13(2) :202-8)等，这类多肽统称为细胞穿 透月太(penetrating p印tideof cells, PPCs)。。 由于HIV-TAT介导的蛋白质转导受到预变性以获得高转导率和依赖细胞内分子 伴侣HSP90拆叠、才能发挥其生物学效应的影响以及更重要的是对HIV-TAT的安全性问题 的担扰，故对这项技术的应用有所限制。 近来，国内外许多研究证明Morris根据天然细胞膜穿透肽特性设计的21个氨
3基酸多肽PEP-1，具有能直接携带有生物活性的蛋白质进入细胞和穿越血脑屏障进入脑组 织，并发挥生物学效应的功能，又同时具有转导效率高、对血清不敏感、在生理缓冲液中有 高度的稳定性和无毒性等优点，因而被认为更适合于蛋白质治疗的载体工具(Morris MC.， et al， J. Nat. Biotech. 2001. 19(12) :1173-6 ;董晓等，南方医科大学学报2006， 26 (8): 1114 :Choi HS,Free Radic Biol Med. 2006 Oct 1 ;41 (7) :1058-68 :Choi SH,et a,Mol Cells. 2005 Dec 31 ;20(3) :401-8 :Choi HS, et al. ， Free Radic Biol Med. 2006 0ctl ; 41(7) :1058-68. Epub 2006 Jun 15)。 因此，基于以上的研究，构建穿透肽/神经营养因子GDNF融合基因，研制能经血管 输入、穿越血脑屏障进入脑神经组织发挥其生物功能的GDNF融合蛋白，成为一种对某些神 经系统疾病具有较好治疗作用的生物治疗药物将是可能的。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种融合穿透肽的神经细胞营养因子GDNF表达结构及 其表达蛋白质纯化的方法。 本发明的目的之二是提供上述融合穿透肽重组人GDNF蛋白质的应用。
本发明的目的之一是通过以下技术措施来实现的 1、从人脑组织提取信息核糖核酸(mRNA)，并利用反转录酶将mRNA合成互补脱氧 核糖核酸(cDNA)，然后，应用PCR技术，克隆GDNF基因，并将穿透肽PEP-1的编码脱氧核苷 酸融合到人源神经细胞营养因子GDNF基因的氨基酸末端(N-末端)；
2、将上述GDNF融合基因插入原核蛋白载体，构建成GDNF融合基因表达质粒；
3、将上述GDNF融合基因表达质粒转化感受态表达菌，形成含有GDNF融合基因表 达质粒的转化子； 4、在适当条件下培养转化子表达菌，并用诱导剂诱导表达菌内的表达质粒GDNF 融合基因的转录、并合成该基因编码的蛋白质产物； 5、通过蛋白质纯化技术、Western Blot分析和细胞研究确定GDNF融合蛋白的生 物功能活性。 本发明所述人GDNF融合基因中的穿透肽是穿透肽TAT、 PEP-1、人时钟基因N_末 序列中的某些氨基酸多肽和由多个赖氨酸(KKKKKKKKK)构成的氨基酸多肽中的一种。
本发明所述的表达载体是原核细胞表达载体，也可以是真核表达载体和病毒表达 载体。 本发明的目的之二是提供所述的人GDNF融合基因表达蛋白质作为制备治疗如本 说明书中所描述的某些神经系统疾病治疗药物中的应用，其有效活性成分为人GDNF蛋白 质。 本发明提供的重组人GDNF融合基因表达结构具有以下特征 1).人源GDNF为成熟型人源GDNF，即其N_末端比野生型人源GDNF缺少从第一到
第五十八位的58个氨基酸，其C末端序列维持不变，； 2).成熟型人GDNF的N-末端融合有由23个氨基酸多肽组成的PEP-1穿透肽 (KET丽ET丽TEWSQPKKKRKV); 3).重组人GDNF融合基因由157个氨基酸组成，包含23个氨基酸组成的穿膜多肽和134个氨基酸构成的成熟型GDNF。 4).重组人GDNF融合基因以N_末端的Ncol和C_末端的Hindi 11连接于原核细 胞表达载体pET-45b (+)，位于T7启动子的下游，建成重组人GDNF融合基因的表达质粒，并 且转化的感受态表达菌是适于原核细胞表达载体pET-45b (+)的表达菌。
因此，所述的表达质粒pET-45b (+) _PEP_1/GDNF具有表达人GDNF融合蛋白的作 用，纯化的GDNF融合蛋白具有穿透肽和GDNF 二者功能。
附图1 :人源神经细胞营养因子GDNF基因cDNA片段(RT-PCR)产物第一泳道为
脱氧核苷酸(DNA，下同)分子量标准；第二和第三泳道为该基因的反向转录酶-聚合酶链
反应(RT-PCR)产物。箭头所指为该基因cDNA片段在琼脂糖电泳上的位置。 附图2 :PEP-1与人源GDNF基因的融合采用PCR方法，以GDNF基因为模板，应用
编码PEP-1多肽和GDNF的5'-未端氨基酸的核苷酸引物进行PCR反应，完成PEP-1与人源
神经营养因子GDNF的融合。第一道为DNA分子量标准、第二和第三道为PCR产物(箭头所指)。 附图3 :pET-45b (+) -PEP-1/GDNF表达质粒构建应用DNA连接酶将Notl BamHl的PEP-1/GDNF融合基因片段插入用内切酶Notl和BamHl消化的原核细胞表达载体 pET-45b (+)，经转化感受态细菌、培养扩增和酶切筛选后确证为pET-45b (+)-PEP-1/GDNF 表达质粒。 附图4 :pET-45b(+)-PEP-1/GDNF的表达此图为诱导的表达产物在SDS-PAGE胶 经卡马氏亮兰染色后的结果，从左向右起，第一泳道为标准蛋白质分子量标记物；第二泳道 为未诱导的细菌产物；第三、第四泳道分别为不同诱导时间的产物。箭头所示为表达产物。
附图5 :pET-45b(+)-PEP-l/GDNF表达产物的Western Blot分析第一泳道为标准 蛋白质分子量标记物；第二泳道为末诱导细菌产物；第三、第四和第五泳道分别为不同诱 导时间的产物。显示表达产物为符合预期的GDNF基因产物。 附图6 :PEP-1/GDNF表达产物进入Hela真核细胞的Western Blot分析第一道 为标准蛋白质分子量标记物；第二泳道为对照组；第三和第四道，第六和第七道分别为2小 时和4小时为PEP-1/GDNF表达产物共孵化Hela细胞结果、第五泳道为PEP-1/GDNF表达产 物。 附图7 :PEP-1/GDNF表达融合蛋白质的分离纯化采用非变性聚炳酰胺凝胶分离 蛋白质。第一道为标准蛋白质分子量标记物；第二泳道为对照组为上样液；第三、第四和第 五道为萄聚糖G50分子筛的收集液；第六、第七和第八道为阳离子交换树脂拄分离纯化的 蛋白液。 附图8 :纯化PEP-1/GDNF融合蛋白的Western Blotting检测分析第一道为标准 蛋白质分子量标记物；第二泳道为对照组为上样液；第三至第五道为萄聚糖G50分子筛收 集液；第六至第八道为阳离子交换拄分离纯化收集液。 附图9 :纯化的PEP-1/GDNF蛋白对神经细胞生长的影响第一道为不含PEP-1/ GDNF融合蛋白的细胞培养液对SH-SY5Y神经细胞生长的状况；第二和第三道为含等量 PEP-1/GDNF融合蛋白的细胞培养液在不同培养时问对SH-SY5Y神经细胞生长的影响观察。
具体实施例方式实施例一 人GDNF基因克隆、基因融合及其表达质粒构建
1).人GDNF基因克隆及其融合基因融合 以备制的人脑组织信息核糖核苷酸(mRNA)为模板，用Poly (T)引物在反向转录酶 作用下，合成人脑组织的互补脱氧核糖核苷酸(cDNA);然后以人脑组织cDNA作为模板，用 含有编码穿透肽PEP-1核苷酸和人GDNF基因N-末端序列核苷酸的P-l-1和P-l-2正向引 物以及人源GDNF基因C-末端核苷酸序列的反向引物进行二次PCR扩增，克隆人源GDNF基 因，并完成其N未端的改建。
a :PEP-1引物设计如下
P-l-1 : 5 ， -tcgagctcaggaggaaacgccatggagaaagaaacctggtgggaaacctggtggaccg-3 ，
P-l-2 : 5' -cctggtgg3ccg33tggtctc3gccg333333333cgte朋gtgtc3cc3g3te33C333tgg-3'
b.人源GDNF基因反向引物设计如下
5， _tcaagcttcagatacatccacaccttt_3， 第二次PCR扩增产物经tailing反应，加上腺嘌呤(T)后，连接至T-easy载体，转
化细菌后，扩增、抽提、纯化，经DNA测序确定。 2).含人GDNF融合基因原核细胞表达质粒的构建 用适当的内切酶，即Notl和BamHl分别消化上述含克隆的人PEP_1_GDNF融合基 因片段的T-easy载体和原核细胞表达载体pET_45b (+) DNA，用琼脂糖电泳分离，并进行纯 化；纯化后的人PEP-1/GDNF融合基因片段和原核细胞表达载体pET_45b (+)DNA在连接酶 作用下进行拼接；转化细菌后，扩增、抽提、纯化，经内切酶消化DNA确定成功构建的含人 pET-45b (+) -PEP-1/GDNF融合基因原核表达质粒。 实施例二 表达质粒pET-45b (+) _PEP_1/GDNF在原核菌内的表达 1).感受态表达菌转化取1 2微克pET-45b (+) -PEP-1/GDNF原核表达质粒DNA
加入在冰上解冻的感受态表达菌BL21 (DE3)PlysS，进行混合，置于冰上孵化30分钟后；然
后，在42t:水浴42秒钟，置于冰上1分钟；再加上900微升LB细菌培养液，于37。C摇床震
荡培养1小时；取适量培养液涂布于含适当抗生素的培养板上，于37t:培养箱内培养过夜，
直至有菌株生长。 2).人GDNF融合基因在原核细胞BL21 (DE3) PlysS内的表达从培养板板上挑选 单个菌株，于含有适当抗生素的5毫升LB培养液中生长过夜；于第二日上午取500微升 细菌培养液至50毫升的LB培养液中、于37t:摇床震荡培养约4小时；当0. D/550值达到 0. 5时，加入适量诱导剂IPTG，诱导人PEP-1/GDNF融合基因的表达；3_4小时后，离心菌体， 菌体经超声破碎后收集上清液，应用12% SDS-PAGE(聚丙酰胺胶)分离蛋白质；分离后， 一块胶进行染色，观察目的蛋白表达情况、另一块胶将蛋白经电转移至醋酸纤维膜上，进行 Western blot免疫反应，确定是预期的产物。
实施例三人PEP-1/GDNF表达产物穿透细胞膜功能研究 1). PEP-1/GDNF融合基因表达产物的制备表达菌经诱导表达后，离心表达菌，弃上清液，在菌体中加入不含血清真核细胞培养液，充分悬浮；经超声破碎包涵体、复性后，取可溶性表达产物上清液，经0.2i;的滤膜过滤，并滤液中加入10%的血清和适量抗生素，备用； 2). PEP-1/GDNF融合蛋白穿膜功能研究 a.穿膜试验真核细胞Hela培养过夜，第二天用PBS缓冲液洗涤Hela细胞三次后，加入上述PEP-1/GDNF融合蛋白滤液，分别共培养2小时和4小时；然后，去除上述滤液，用足量PBS缓冲液洗Hela细胞三遍； b.PEP-l/GDNF融合蛋白穿膜效果检验离心收集上述Hela细胞，经超声破碎、离心，收集细胞上清溶，进行电泳分离、转移；然后，进行Western blot分析，结果显示PEP-1/GDNF融合基因表达产物具有穿膜功能。
实施例四PEP-1/GDNF表达融合蛋白的分离、纯化及其检测 1). PEP-1/GDNF表达融合蛋白的分离、纯化表达PEP-1/GDNF融合基因的工程菌37t:经诱导表达4小时后，分离包涵体；包涵体经充分洗涤和8M尿素溶解、复性，离心后，取其上清液备用。应用柱上复性方法，先后使用萄聚糖G50分子筛和阳离子交换树脂拄分离、纯化表达的蛋白； 2).纯化的PEP-1/GDNF融合蛋白的检测随后应用15%非变性聚丙酰胺胶电泳PEP-1-GDNF表达蛋白，并电转移至膜上，按常规实验条件，用鼠GDNF抗体进行Westernblotting检测，结果显示纯化的为人GDNF融合蛋白。 实施例五PEP-1/GDNF融合蛋白质对SH-SY5Y神经细胞生长的影响每组取约50万个传代细胞培养，待贴壁生长12小时后，在新鲜培养液中加入等量PEP-1/GDNF蛋白，分别培养12和24小时，收集细胞计数，并与在新鲜培养液中未加PEP-1/GDNF蛋白的对照组细胞计数比较，分析PEP-1/GDNF蛋白对神经细胞生长的影响，结果表明PEP-1/GDNF蛋白有促进SH-SY5Y神经细胞生长的作用。序列表Individual ApplicantStreet :广州国际企业孵化器A区610房City :广州市State :广东省Country :中国PostalCode :510633PhoneN咖ber :020-32290208FaxN咖ber :020-32290208EmailAddress :shangwu_w@yahoo. com〈110>LastName :王〈110>FirstName :尚武〈110〉Middlelnitial :〈110〉Suffix :Application Project
7
------------------- 〈120〉Title :—种融合穿透肽的神经细胞营养因子GDNF 〈130>AppFileReference : 〈140>CurrentAppNumber :1 〈141〉CurrentFilingDate :2008-11-13 Sequence -------- 〈210>1 〈211>504 〈212>DNA 〈213〉GDNF人工序列 〈400〉 1
txgagctcag gaggaaacgc catggagaaa gaaacctggt gggaaacctg gtggaccgaa 60 tggtctcagc cgaaaaaaaa acgtaaagtg tcacc,ta aacaaatggc agtgcttcct 120 agaagagagc ggaatcggca ggctgcagct gccaacccag agaa'ttccag aggaaaa欲t 180
cggagaagcc agaggggcaa aaaccggggt tgtgtcttaa ctgcaataca tttaaatgtc 240
actgacttgg gtctgggcta tgaaaccaag gaggaactga tttttaggta ctgcagcggc 300
tcttgcgatg cagctgagac aacgtacgac aaaatattga aaaacttatc cagaaataga 360
aggctggtga gcgacaaagt agggcaggea tgttgcagac ccatcgcctt tgatgatga.c 420
ctgtcgtttt tagatgataa cctggtttac catattctaa gaaagcattc cgctaaaagg 480
tgtggatgta tctgaaagct tgca 504
〈210>2 〈211>157 〈212>PRT 〈213>GDNF人工序列 〈400>2MetGluLysGluThrTrpTrpGluThrTrpT卬ThrGluTrpSerGlnProLysLysLys 5 10 15 20
25
30
35
40
45 50 55 60
AsnArgGlyCysValLeuThrAlalleHi sLeuAsnValThrAspLeuGlyLeuGlyTyr
65 70 75 80
GluThrLysGluGluLeuIlePheArgTyrCysSerGlySerCysAspAlaAlaGluThr
85 90 95 100
105
110
115
125 130 135
LeuValTyrHisIleLeuArgLysHisSerAlaLysArgCysGlyCysIle 145 150 155
120 140
权利要求
一种融合穿透肽的神经细胞营养因子GDNF，其主要特征为a). GDNFN为成熟型GDNF，其N-末端缺失从第一到第五十八位的58个氨基酸，其C末端序列不变；b). 成熟型GDNF的N-末端融合穿透多肽；c). 所述GDNF亲本来源于人；
2. 根椐权利要求1的一种GDNF融合基因，含有下列氨基酸序列a) .人GDNF的成熟亲本多肽的氨基酸序列；b) .融合GDNF由157个氨基酸组成，包括23个氨基酸组成的穿透多肽和134个氨基酸 构成的成熟型GDNF ;
3. 根椐权利要求1，所述GDNF的N-末端融合穿透肽，穿透肽由21个氨基酸，即由 KET丽ET丽TEWSQPKKKRKV氨基酸组成的PEP-1穿透肽。
4. 根椐权利要求1，所述穿透肽不限于上述穿透肽，也可以是人时钟基因 (clockgene)、穿透肽(VKRVSRNKSEKKRRG)、艾滋病毒HIV-1的TAT穿透肽或多个赖氨酸 (KKKKKKKKK)构成的穿透肽中的一种。
5. 根椐权利要求1，人GDNF基因N-未端的构建方法，即以人GDNF基因为模板，应用 合成的、编码穿透肽PEP-1核苷酸和人GDNF基因N-末端序列核苷酸的正向引物P-l-1和 P-l-2以及人GDNF基因C-末端核苷酸序列的反向引物，进行二步法的PCR扩增，完成其N 未端的改建，即GDNF与PEP-1穿透肽的融合；a. PEP-1引物设计如下 P-l-1 :5' -tcgagctcaggaggaaacgccatggagaaagaaacctggtgggaaacctggtggaccg-3' P-l-2 :5' -cctggtgg3ccg33tggtctc3gccg333333333cgte朋gtgtc3cc3g3te33C333tgg-3'b. 人GDNF基因反向引物物设计如下 5' _tcaagcttcagatacatccacaccttt_3，PCR扩增产物经tai 1 ing反应，加上腺嘌呤后，连接至T-easy载体，转化细菌后，扩增、 抽提、纯化，经DNA测序确定。
6. 根椐权利要求1，含上述表达结构的原核表达质粒pET45b-PEP-l-GDNF转化感受态 表达菌BL21 (DE3)plysS形成的工程菌，但不限于本发明所述的表达载体pET45b和感受态 表达菌种，也包括所有pET表达系列载体和其他原核表达载体系列以及BL21 (DE3)系列的 感受态表达菌和其他原核细胞感受态表达菌。
7. 根椐权利1、权利2和权利3，穿透肽GDNF融合基因的表达序列结构在原核细胞和/ 或真核细胞的蛋白表达产物。
8. 根椐权利1、权利2和权利3，穿透肽GDNF融合基因表达结构在腺病毒 (Adenoviruse)、腺相关病毒(AAVs)或其它病毒载体系统的应用。
9. 椐权利1、所述穿透肽GDNF融合基因表达蛋白产物在临床上治疗相关疾病，如缺血 性脑损伤，肌萎縮侧索硬化和帕金森氏病等相关神经系统疾病中的应用。
全文摘要
本发明公开了构建一种融合穿透肽的神经细胞营养因子GDNF表达结构方法、以及表达蛋白产物的纯化及其意义，其主要特征为1).GDNF亲本为人源成熟型；2).GDNF的N-末端融合有21氨基酸组成的PEP-1穿透肽；和3)构建的穿透肽GDNF融合基因表达质粒的表达产物具有穿膜功能及GDNF的生物功能，可在临床上治疗相关疾病中得以应用。
文档编号C12N15/62GK101775072SQ20081017676
公开日2010年7月14日 申请日期2008年11月17日 优先权日2008年11月17日
发明者朱雅南, 王尚武 申请人:王尚武;朱雅南