一种检测猪6-7肋间膘厚性状的方法及其专用试剂盒的制作方法

专利名称：：一种检测猪6-7肋间膘厚性状的方法及其专用试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种检测猪6-7肋间膘厚性状的方法及其专用试剂盒。
背景技术：
：随着人们生活水平的不断提高，肉类的消费量日益增大，对品质的需求也在不断提高。瘦肉率是猪生产水平的重要标志。瘦肉率是一个复合性状，在育种工作中通常以肋间膘厚、眼肌面积等指标进行选育。猪6-7肋间膘厚与胴体痩肉率的相关系数为-0.5-0.9，因此，6-7肋间膘厚是反映猪胴体瘦肉率的一个重要指标，也是评定肉质等级最为直观和准确的指标之一。猪6-7肋间膘厚与瘦肉率具有很强的负相关，也就是肋间膘越薄，猪胴体痩肉率越高。在猪的育种工作中使用分子标记预测猪的肋间膘厚，进而选育猪胴体瘦肉率指标将极大地提高猪的生产质量和生产水平。解耦联蛋白(uncouplingprotein,UCPs)是一类位于线粒体内膜的质子转运载体蛋白，在解离氧化磷酸化藕联、抗氧化和调控能量代谢中发挥重要功能。目前，在哺乳动物中发现的解耦联蛋白家族成员包括UCP1、UCP2、UCP3、UCP4和UCP5。UCP2和UCP3已经被证实与猪的增重、脂肪沉积、饲料转化效率、仔猪出生重等经济性状密切相关。UCP3位于9号染色体上，其0RF长度为927bp，编码包含308个氨基酸的蛋白质，具有6个跨膜功能域和一个嘌呤核苷酸结合区。UCP3是解耦联蛋白家族中的重要成员，在骨骼肌、白色脂肪组织(WAT)、棕色脂肪组织(BAT)及心肌中均有表达。在骨骼肌中UCP3具备高效、专一性表达的特点，是骨骼肌线粒体内膜的重要转运蛋白。因此，UCP3基因的遗传变异可导致机体能量消耗程度的差异，从而导致个体间的体脂代谢、体脂含量乃至肉质和胴体性状的改变。寻找UCP3基因的多态性，研究其对胴体性状的遗传效应，可为猪的遗传品质改良提供重要的遗传学依据。基因型分析基于生物个体间基因组咖A碱基的自然变异。目前已有很多成熟的技术进行基因型分析，如单链构象多态性(PCR-SSCP)、DNA测序、限制性酶切片段长度多态性(PCR-RFLP)、等位基因特异寡聚核苷酸杂交、DNA芯片及TaqMan等。PCR-SSCP方法最为常用，但存在的问题有检测步骤较多；耗时较长(12-20小时)；易出现杂带，增加错判几率，结果的可信度较低。DNA测序、等位基因特异寡聚核苷酸杂交、DNA芯片和TaqMan方法虽然准确度都比较高，但检测费用高，运用到实际育种比较困难。PCR-RFLP采用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的DNA片段，然后将待检测的DNA片段用限制性内切酶酶切，限制性内切酶识别并切割特异的序列，然后将酶切后的产物进行电泳，再由限制酶图谱(restrictionmap)分析此段序列的特异酶切位点，即由片段长度的多样性来比对不同来源基因序列的差异性。
发明内容本发明的目的是提供一种检测猪6-7肋间膘厚性状的方法及其专用试剂盒。本发明提供的检测猪6-7肋间膘厚性状的方法，包括如下l)-9)中任一技术方案1)检测待测猪的基因组中的GenBankAccessionNumber丽—214049自5'末端第1779位核苷酸为G还是为A，确定猪的基因型是GG、GA还是AA，然后通过基因型确定猪6-7肋间膘厚；所述GG基因型为GenBankAccessionNumber醒—214049自5'末端第1779位核苷酸为G的纯合体；所述AA基因型为GenBankAccessionNumber丽一214049自5'末端第1779位核苷酸为A的纯合体；所述GA基因型为它们的杂合体；2)检测待测猪的基因组中的GenBankAccessionNumberNM—214049自5'末端第1781位核苷酸为G还是为A，确定猪的基因型是GG、GA还是AA，然后通过基因型确定猪6-7肋间膘厚；所述GG基因型为GenBankAccessionNumberNM—214049自5，末端第1781位核苷酸为G的纯合体；所述AA基因型为GenBankAccessionNumber應_214049自5'末端第1781位核苷酸为A的纯合体；所述GA基因型为它们的杂合体；3)检测待测猪的基因组中的Gerl6ahkAccessionNumberNM—214049自5'末端第1782位核苷酸为A还是为T,确定猪的基因型是AA、AT还是TT,然后通过基因型确定猪6-7肋间膘厚；所述AA基因型为GenBankAccessionNumberNM—214049自5'末端第1782位核苷酸为A的纯合体；所述TT基因型为GenBankAccessionNumberNM—214049自5'末端第1782位核苷酸为T的纯合体；所述AT基因型为它们的杂合体；4)检测待测猪的基因组中的GenBankAccessionNumberNM—214049自5，末端第1783位核苷酸为T还是为G，确定猪的基因型是TT、TG还是GG，然后通过基因型确定猪6-7肋间膘厚；所述TT基因型为GenBankAccessionNumberNM—214049自5'末端第1783位核苷酸为T的纯合体；所述GG基因型为GenBankAccessionNumberNM一214049自5'末端第1783位核苷酸为G的纯合体；所述TG基因型为它们的杂合体；5)检测待测猪的基因组中的GenBankAccessionNumberNM—214049自5，末端第1784位核苷酸为G还是为C，确定猪的基因型是GG、GC还是CC，然后通过基因型确定猪6-7肋间膘厚；所述GG基因型为GenBankAccessionNumberNM_214049自5'末端第1784位核苷酸为G的纯合体；所述CC基因型为GenBankAccessionNumberNM—214049自5'末端第1784位核苷酸为C的纯合体；所述GC基因型为它们的杂合体；6)检测待测猪的基因组中的GenBankAccessionNumberNM—214049自5'末端第1785位核苷酸为C还是为T，确定猪的基因型是CC、CT还是TT，然后通过基因型确定猪6-7肋间膘厚；所述CC基因型为GenBankAccessionNumberNM—214049自5'末端第1785位核苷酸为C的纯合体；所述TT基因型为GenBankAccessionNumber應一214049自5'末端第1785位核苷酸为T的纯合体；所述CT基因型为它们的杂合体；7)检测待测猪的基因组中的GenBankAccessionNumberNM—214049自5'末端第1786位核苷酸为T还是为C，确定猪的基因型是TT、TC还是CC，然后通过基因型确定猪6-7肋间膘厚；所述TT基因型为GenBankAccessionNumberNM_214(H9自5'末端第1786位核苷酸为T的纯合体；所述CC基因型为GenBankAccessionNumberNM—214049自5'末端第1786位核苷酸为C的纯合体；所述TC基因型为它们的杂合体；8)检测待测猪的基因组中的GenBankAccessionNumberNM—214049自5'末端第1787位核苷酸为C还是为G，确定猪的基因型是CC、CG还是GG，然后通过基因型确定猪6-7肋间膘厚；所述CC基因型为GenBankAccessionNumbefNM—214(H9自5'末端第1787位核苷酸为C的纯合体；所述GG基因型为GenBankAccessionNumberNM—214049自5'末端第1787位核苷酸为G的纯合体；所述CG基因型为它们的杂合体；9)检测待测猪的基因组中的GenBankAccessionNumberNM—214049自5，末端第1788位核苷酸为G还是为C，确定猪的基因型是GG、GC还是CC，然后通过基因型确定猪6-7肋间膘厚；所述GG基因型为GenBankAccessionNumber画—214049自5'末端第1788位核苷酸为G的纯合体；所述CC基因型为GenBankAccessionNumberNM—214049自5'末端第1788位核苷酸为C的纯合体；所述GC基因型为它们的杂合体。以上9个位点的突变位于UCP3基因的3'侧翼区(调控区)，为3'侧翼区序列多态。该3，侧翼区序列呈两种类型，一种类型为GenBankAccessionNumber丽一214049自5'末端第1779位核苷酸为G，自5'末端第1781位至第1788位核苷酸为GATGCTCG，将该型命名为C1;另一种类型为GenBankAccessionNumberNM—214049自5'末端第1779位核苷酸为A，自5'末端第1781位至第1788位核苷酸为ATGCTCGC，将该型命名为C2。这说明，GenBankAccessionNumber醒—214049自5'末端第1779位核苷酸、自5'末端第1781位至第1788位核苷酸都是紧密连锁的，所以虽然存在9个位点的突变，但该序列只存在两个多态类型。.针对该3'侧翼区序列多态，将C1纯合体基因型命名为C1C1，将C2纯合体基因型命名为C2C2，它们的杂合体基因型为C1C2。3，i周控区序列多态:野生型GenBankAccessionNumberNM—214049自5'末端第1779位核苷酸为G，自5'末端第1781位至第1788位核苷酸为GATGCTCG;不能被限制性内切酶AvaI识别；突变型GenBankAccessionNumber醒—214049自5'末端第1779位核苷酸为A，自5'末端第1781位至第1788位核苷酸为ATGCTCGC;能被限制性内切酶AvaI识别。所述确定猪的基因型的方法具体可为以待测猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增，然后将酶切后的PCR产物进行电泳。确定3，侧翼区序列多态时，PCR扩增产物需包括GenBankAccessionNumber濯—214049自5'末端第1779位核苷酸和自5'末端第1781位至第1788位核苷酸，长度为200bp-1000bp。PCR的引物对具体可为序列表中的序列1所示的核苷酸序列和序列表中的序列2所示的核苷酸序列，酶切所用的酶具体可为限制性内切酶^ral。C1C1型样本的PCR扩增产物不能被^ral酶切，电泳后显示696bp的一条条带；C2C2型样本的PCR扩增产物被^ral酶切后产生433bp和263bp两种片段，电泳后显示433bp和263bp的两条条带；C1C2型样本为杂合体，PCR扩增产物被酶切后产生696bp、433bp和263bp三种片段，电泳后显示696bp、433bp和263bp的三条条带。C1C2基因型和C2C2基因型的6-7肋间膘厚小于C1C1基因型。所述方法还包括如下a)步骤和如下b)步骤a)检测待测猪的基因组中的GenBankAccessionNumberAY739704自5，末端第1406位核苷酸为A还是为G(G1406A),确定猪的基因型是AA、AG还是GG，然后通过基因型确定猪6-7肋间膘厚；所述AA基因型为GenBankAccessionNumberAY739704自5'末端第1406位核苷酸为A的纯合体；所述GG基因型为GenBankAccessionNumberAY739704自5'末端第1406位核苷酸为G的纯合体；所述AG基因型为它们的杂合体；b)检测待测猪的基因组中的GenBankAccessionNumberAY739704自5，末端第3602位核苷酸为T还是为C(T3602C)，确定猪的基因型是TT、TC还是CC，然后通过基因型确定猪6-7肋间膘厚；所述TT基因型为GenBankAccessionNumberAY739704自5，末端第3602位核苷酸为T的纯合体；所述CC基因型为GenBankAccessionNumberAY739704自5'末端第3602位核苷酸为C的纯合体；所述TC基因型为它们的杂合体。针对该G1406A多态，将A纯合体基因型命名为A1A1，将G纯合体基因型命名为A2A2，它们的杂合体基因型为A1A2。针对该T3602C多态，将T纯合体基因型命名为B1B1，将C纯合体基因型命名为B2B2，它们的杂合体基因型为B1B2。G1406A多态:野生型GenBankAccessionNumberAY739704自5'末端第1406位核苷酸为G;能被限制性内切酶SmalI识别；突变型GenBankAccessionNumberAY739704自5'末端第1406位核苷酸为A;不能被限制性内切酶SraalI识别。T3602C多态:野生型GenBankAccessionNumberAY739704自5'末端第3602位核苷酸为T;用错配引物扩增后不能被限制性内切酶TthlllI识别；突变型GenBankAccessionNumberAY739704自5'末端第3602位核苷酸为C;用错配引物扩增后能被限制性内切酶Tthl11I识别。所述确定猪的基因型的方法具体可为以待测猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增，然后将酶切后的PCR产物进行电泳。确定G1406A多态时，PCR扩增产物需包括GenBankAccessionNumberAY739704自5，末端第1406位核苷酸，长度为200bp-lOOObp。PCR的引物对具体可为序列表中的序列3所示的核苷酸序列和序列表中的序列4所示的核苷酸序列，酶切所用的酶具体可为限制性内切酶5i^丑。A1A1型样本的PCR扩增产物不能被6iffaZt酶切，电泳后显示453bp的一条条带；A2A2型样本的PCR扩增产物被6)肪7I酶切后产生399bp和54bp两种片段，54bp片段太小，在该电泳中不能显示，所以电泳后显示399bp的一条条带；A1A2型样本为杂合体，PCR扩增产物被5kaJI酶切后产生453bp、399bp和54bp三种片段，54bp片段太小，在该电泳中不能显示，所以电泳后显示453bp和399bp的两条条带。确定T3602C多态时，PCR扩增产物需包括GenBankAccessionNumberAY739704自5'末端第3602位核苷酸，长度小于200bp。因为是引入错配位点，酶切位点在引物上，所以不管如何变换引物，酶切前后片段大小总是相差23bp，因此，扩增片段越长，酶切前后片段在琼脂糖凝胶上区分的越不明显，因此片段不易过长。PCR的引物对具体可为序列表中的序列5所示的核苷酸序列和序列表中的序列6所示的核苷酸序列，酶切所用的酶具体可为限制性内切酶R力llll。B1B1型样本的PCR扩增产物不能被7YM11I酶切，电泳后显示193bp的一条条带；B2B2型样本的PCR扩增产物被7Y力lllI酶切后产生170bp和23bp两种片段，23bp片段太小，在该电泳中不能显示，所以电泳后显示170bp的一条条带；B1B2型样本为杂合体，PCR扩增产物被7YMllI酶切后产生193bp、170bp和23bp三种片段，23bp片段太小，在该电泳中不能显示，所以电泳后显示193bp和170bp的两条条带。联合基因型A2A2B1B2C1C2的6-7肋间膘厚最小。本发明还提供了一种检测猪6-7肋间膘厚性状的试剂盒，包括满足如下条件的引物对I:以猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增的产物含有GenBankAccessionNumberNM—214049自5'末端第1779位核苷酸和第1781位至第1788位核苷酸；扩增产物长度可为200bp-1000bp。所述试剂盒还包括满足如下条件l)的引物对II和满足如下条件2)的引物对III:O以猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增的产物含有GenBankAccessionNumberNM一AY739704自5，末端第1406位核苷酸；扩增产物长度可为200bp-1000bp;2)以猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增的产物含有GenBankAccessionNumberNM—AY739704自5，末端第3602位核苷酸；扩增产物的长度小于200bp。所述引物对I具体可为序列表中的序列1所示的核苷酸序列和序列表中的序列2所示的核苷酸序列；所述引物对II具体可为序列表中的序列3所示的核苷酸序列和序列表中的序列4所示的核苷酸序列；所述引物对III具体可为序列表中的序列5所示的核苷酸序列和序列表中的序列6所示的核苷酸序列。所述试剂盒还可包括限制性内切酶力ral。所述试剂盒还可包括限制性内切酶^ral;所述试剂盒还可包括限制性内切酶5iz371和限制性内切酶7YM111。与传统方法相比，应用本发明的方法对出生仔猪进行检测，可以实现早选，縮短选育时间，极大地减少选育费用。同时，本发明的方法是直接针对具有基因效应的功能基因进行选择，提高了选育的准确性，减少了人力物力的浪费。应用本发明的方法筛选优良性状的猪，基因型最高选择效应可达到14.33%，按照猪6-7肋间膘厚与胴体瘦肉率的相关系数-0.5-0.9计算，可提高胴体瘦肉率在7.16%％12.90。见表2，通过计算可知基因型C1C2和C2C2的6-7肋间膘厚明显低于基因型C1C1的为9.58%和12.46%，即基因型C1C2和C2C2的瘦肉率高于基因型C1C1的为9.58%和12.46%。以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。图1为C1C1、C2C2、C1C2三种基因型样本的电泳图。图2为A1A1、A2A2、A1A2三种基因型样本的电泳图。图3为B1B1、B1B2两种基因型样本的电泳图。具体实施例方式下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例l、检测猪6-7肋间膘厚性状的方法的建立一、UCP3基因多态的发现将293头金华X皮特兰F2代猪作为实验对象。猪21周龄屠宰时采集血样，放于冰盒，于-2(TC保存。1、3'调控区序列多态的发现(l)PC財广增根据猪UCP3基因mRNA序列信息(GenBankAccessionN咖ber腿—214049)，用Oligo(6.02)软件设计PCR引物。引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成，序列如下引物1(上游引物):5，-CCTTCAGGACACGTTCGTGT-3，；(1353-1372)引物2(下游引物)5，-GCCCCTGGTTCCTTTGGTCTGA-3，。(2027-2048)PCR反应体系:基因组DNA200ng，引物各10nmo1，dNTPs200umol/L，10Xbuffer(MgCl2)1.5ramo/L，TaqDNA聚合酶O.5u，加灭菌双蒸水至总体积20y1。PCR扩增条件94。C预变性4min;94。C变性50s，63。C退火50s，72。C延伸50s，35个循环；最后72"C延伸10min。(2)酶切鉴定将步骤(1)得到的PCR产物37X:酶切3小时，2.5%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。酶切体系buffer0.7"1，限制性内切酶^ral3u，PCR产物3ul，加双蒸水至总体积lOy1。293个样本中，带型呈现3种情况。第一种，电泳显示一条条带(约700bp);第二种，电泳显示两条条带(约450bp和约250bp);第三种，电泳显示三条条带(约700bp、约450bp和约250bp)。(3)测序鉴定将步骤(1)得到的PCR产物进行测序，测序结果表明，步骤(2)中的三种带型是由UCP3基因的3'侧翼区(GenBankAccessionNumberNM214049自5'末端第1779位和1781-1788位)发生突变引起的。该3'侧翼区序列呈两种类型，一种类型为GenBankAccessionNumber丽—214049自5'末端第1779位核苷酸为G，自5'末端第1781位至第1788位核苷酸为GATGCTCG，将该型命名为C1;另一种类型为GenBankAccessionNumber醒—214049自5'末端第1779位核苷酸为A，自5'末端第1781位至第1788位核苷酸为ATGCTCGC，将该型命名为C2。这说明，GenBankAccessionNumber丽—214049自5'末端第1779位核苷酸、自5'末端第1781位至第1788位核苷酸都是紧密连锁的，所以虽然存在9个位点的突变，但该序列只存在两个多态类型。针对该突变位点，将UCP3基因分型如下将C1纯合型的样本命名为C1C1，将C2纯合型的样本命名为C2C2，将杂合型的样本命名为C1C2。(4)结果分析C1C1型样本的PCR扩增产物不能被酶切，电泳后显示696bp的一条条带；C2C2型样本的PCR扩增产物被^ral酶切后产生433bp和263bp两种片段，所以电泳后显示433bp和263bp的两条条带；C1C2型样本为杂合体，PCR扩增产物被酶切后产生696bp、433bp和263bp三种片段，所以电泳后显示696bp、433bp和263bp的三条条带。C1C1、C2C2、C1C2三种基因型样本的电泳图见图1。图1中，M:100bpLaddermarker。293个样本中，3，调控区序列多态的等位基因频率和基因型频率见表1。2、G1406A多态的发现(1)PCR扩增根据猪UCP3基因mRNA序列信息(GenBankAccessionNumberAY739704)，用01igo(6.02)软件设计PCR引物。引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成，序列如下引物3(上游引物)5，-CCTCTACGCTCCGTCAAGC-3，；(1007-1026)引物4(下游引物)5，-CCCTGGCGATGGTTCTGT-3。(1443-1460)PCR反应体系:基因组DNA200ng，引物各10nmo1，dNTPs200umol/L.，10Xbuffer(MgCl2)1.5mmo/L，TaqDNA聚合酶O.5u，加灭菌双蒸水至总体积20u1。PCR扩增条件:94。C预变性4min;94"C变性50s，55"退火50s，72。C延伸50s，35个循环；最后72。C延伸10min。(2)酶切鉴定将步骤(1)得到的PCR产物30。C酶切3小时，2.5%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。酶切体系buffer0.7u1，限制性内切酶5k3JI3u，PCR产物3ul，加双蒸水至总体积10u1。293个样本中，带型呈现3种情况。第一种，电泳显示一条条带(约450bp);第二种，电泳显示一条条带(约400bp);第三种，两条条带(约450bp和约400bp)。(3)测序鉴定将步骤(1)得到的PCR产物进行测序，测序结果表明，步骤(2)中的三种带型是由UCP3基因的Exon3中的一个点突变引起的，该点突变位于GenBankAccessionNumberAY739704自5'末端第1406位核苷酸，该位点上的核苷酸由G突变为A,造成第150位甘氨酸-精氨酸(Gly-Arg)的错义突变，将该点突变命名为G1406A。针对该突变位点，将UCP3基因分型如下将AA纯合型的样本命名为A1A1，将GG纯合型的样本命名为A2A2，将杂合型的样本命名为A1A2。(4)结果分析A1A1型样本的PCR扩增产物不能被5k3/t酶切，电泳后显示453bp的一条条带；A2A2型样本的PCR扩增产物被6ka71酶切后产生399bp和54bp两种片段，54bp片段太小，在该电泳中不能显示，所以电泳后显示399bp的一条条带；A1A2型样本为杂合体，PCR扩增产物被5ka71酶切后产生453bp、399bp和54bp三种片段，54bp片段太小，在该电泳中不能显示，所以电泳后显示453bp和399bp的两条条带。A1A1、A2A2、A1A2三种基因型样本的电泳图见图2。图2中，M:100bpLaddermarker。293个样本中，G1406A多态的等位基因频率和基因型频率见表1。3、T3602C多态的发现(1)PC財广增根据猪UCP3基因mRNA序列信息(GenBankAccessionNumberAY739704)，用01igo(6.02)软件设计PCR引物。引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成，序列如下引物5(上游引物)5'-CCTCTTCCCCTCCCCCGATGCAGAC-3，；(3435-3459)引物6(下游引物)5'-GGCTGTGGGGCCCTCCTGGGACACC-3'。(3603-3627)因为是错配引物，所以第3607个碱基由原来的A变为引物中的T。PCR反应体系:基因组DNA200ng，引物各10nmo1，dNTPs200umol/L，lOXbuffer(MgCl2)1.5mmo/L，TaqDNA聚合酶O.5u，加灭菌双蒸水至总体积20y1。PCR扩增条件94。C预变性4min;94。C变性50s，54。C退火50s，72。C延伸50s，35个循环；最后72。C延伸10min。(2)酶切鉴定将步骤(1)得到的PCR产物65"C酶切3小时，2.5%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。酶切体系buffer0.7u1，限制性内切酶7YM1113u，PCR产物3yl，加双蒸水至总体积10y1。293个样本中，带型呈现3种情况。第一种，电泳显示一条条带(比200bpmarker略大)；第二种，电泳显示一条条带(比200bpmarker略小)；第三种，电泳显示两条条带，一条比200bpmarker略大，另一条比200bpmarker略小。(3)测序鉴定将步骤(1)得到的PCR产物进行测序，测序结果表明，步骤(2)中的三种带型是由UCP3基因的Exon5中的一个点突变引起的，该点突变位于GenBankAccessionN咖berNM一AY739704自5'末端第3602位核苷酸，该位点上，核苷酸由T突变为C,造成第259位氨基酸甲硫氨酸(Met-Thr)的错义突变，将该点突变命名为T3602C。针对该突变位点，将UCP3基因分型如下将TT纯合型的样本命名为B1B1，将CC纯合型的样本命名为B2B2，将杂合型的样本命名为B1B2。(4)结果分析B1B1型样本的PCR扩增产物不能被7Y力1111酶切，电泳后显示193bp的一条条带；B2B2型样本的PCR扩增产物被酶切后产生170bp和23bp两种片段，23bp片段太小，在该电泳中不能显示，所以电泳后显示170bp的一条条带；B1B2型样本为杂合体，PCR扩增产物被7YM11I酶切后产生193bp、170bp和23bp三种片段，23bp片段太小，在该电泳中不能显示，所以电泳后显示193bp和170bp的两条条带。B1B1、B2B2、B1B2三种基因型样本的电泳图见图3。图3中，M:100bpLaddermarker。293个样本中，T3602C多态的等位基因频率和基因型频率见表1。表1293头个样本UCP3基因的等位基因频率和基因型频率<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>二、UCP3基因多态和猪6-7肋间膘厚性状的相关性步骤一中的293头金华X皮特兰F2代猪，屠宰时以游标卡尺测量6-7肋间膘厚。将猪的基因型和猪的6-7肋间膘厚性状进行相关性分析。1、3'调控区序列多态和猪6-7肋间膘厚性状的相关性建立单标记回归统计模型，采用SAS统计软件(SASInstituteInc，Version8.O)glm程序进行单标记方差分析，并进行显著性检验，所采用模型为Yij为性状表型值，U为平均值，Gi为基因型效应；Sj为性别效应，bij为屠宰体重的回归系数；Xij为屠宰体重；为残差效应。结果见表2。表2基因型与6-7肋间膘厚性状的相关分析<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>6-7肋间膘厚(mm)3.43±0.09(56)a3.13±0.05(150)b3.05±0.09(54)b注含不同字母的两个基因型间差异极显著(P〈0.01)。结果表明三种基因型(C1C1、C2C2、C1C2)与6-7肋间膘厚性状存在极显著的相关(P=0.0062)，基因型C1C1极显著高于基因型C1C2(P=0.0050)和基因型C2C2(P=0.0037)，而基因型C1C2和基因型C2C2间的差异并不显著(P〉0.05)，因此3'调控区的碱基突变，会造成6-7肋间背膘厚的显著下降。实践中，应选择突变后的，具有薄的6-7肋间膘厚的个体，即基因型C1C2和基因型C2C2的个体，从育种角度而言，最好选择基因型C2C2的个体，因为C2C2基因型是纯合型，有利于纯种后代的繁育。2、G1406A多态和猪6-7肋间膘厚性状的相关性方法同步骤l。结果表明，G1406A多态和猪6-7肋间膘厚性状不相关。3、T3602C多态和猪6-7肋间膘厚性状的相关性方法同步骤l。结果表明，T3602C多态多态和猪6-7肋间膘厚性状不相关。4、UCP3基因的3个位点的多态的联合基因型和猪6-7肋间膘厚性状的相关性方法同步骤l。结果见表3。表3猪UCP3基因三个多态位点联合基因型与6-7肋间膘厚的相关分析联合基因型6-7肋间膘厚(mm)A1A1B1B1C1C13.50±0.16bdA1A1B1B2C1C13.53±0.29bcdA2A2B1B1C1C13.50±0.28bcdA1A1B1B1C1C23.21±0.14A1A1B1B2C1C23.63±0.21bdA1A2B1B1C1C23.Ol士O.16aceA1A2B1B2C1C23.08±0.22abA2A2B1B1C1C23.14±0.13acdA2A2B1B2C1C22.68±0.25ac_A1A1B1B1C2C2_3.63±0.20be_注表中多态位点联合基因型的排列顺序为G1406A(A1/A2)，T3602C(B1/B2)，3，-UTR(Cl/C2)。含不同字母的两个联合基因型间差异显著(0.01<P<0.05)结果表明6-7肋间膘厚与联合基因型显著相关(P=0.0300)。G1406A-T3602C-3，侧翼区的联合基因型A2A2B1B2C1C2的6-7肋间膘厚最小，与联合基因型A1A1B1B1C1C1、A1A1B1B2C1C1、A2A2B1B1C1C1、A1A1B1B2C1C2和A1A1B1B1C2C2差异显著(0.01<P<0.05);联合基因型A1A2B1B1C1C2与A1A1B1B1C1C1和A1A1B1B2C1C2差异显著(0.01<P<0.05);联合基因型A2A2B1B1C1C2与A1A1B1B1C2C2差异显著(0.01<P<0.05)。实施例2、检测猪6-7肋间膘厚性状的试剂盒的制备一、检测猪6-7肋间膘厚性状的试剂盒的制备试剂盒由以下组分组成序列表的序列1所示的核苷酸序列；序列表的序列2所示的核苷酸序列；限制性内切酶力ral。二、检测猪6-7肋间膘厚性状的试剂盒的制备试剂盒由以下组分组成序列表的序列1所示的核苷酸序列；序列表的序列2所示的核苷酸序列；序列表的序列3所示的核苷酸序列；序列表的序列4所示的核苷酸序列；序列表的序列5所示的核苷酸序列；序列表的序列6所示的核苷酸序列；限制性内切酶^ral;限制性内切酶6k3l[;限制性内切酶WMllI。实施例3、检测猪6-7肋间膘厚性状的试剂盒的应用使用实施例2的步骤一制备的试剂盒，检测200头长白猪。检测结果见表4。表4长白猪的3'调控区序列多态基因分型检测<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>实施例4、检测猪6-7肋间膘厚性状的试剂盒的应用使用实施例2的步骤二制备的试剂盒，检测138头长白猪。检测结果见表5。表5长白猪的联合基因分型检测<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>序列表<110〉中国农业大学〈120〉一种检测猪6-7肋间膘厚性状的方法及其专用试剂盒〈130〉CGGNARY81955<160〉6<210>1〈211〉20〈212〉DNA<213〉人工序列<220〉〈223〉<400〉1ccttcaggacacgttcgtgt20<210>2<211〉22<212>DNA<213〉人工序列〈220〉<223〉〈400〉2gcccctggttcctttggtctga22<210>3〈211〉19〈212〉DNA<213>人工序列〈220〉〈223><400>3cctctacgctccgtcaagc19〈210〉4<211>18<212>腿<213〉人工序列<220><223〉<400>4ccctggcgatggttctgt18<210>5〈211〉25<212>DNA〈213〉人工序列<220><223〉〈400〉5cctcttcccctcccccgatgcagac25<210>6<211>25<212〉DNA〈213〉人工序列<220><223><400〉6ggctgtggggccctcctgggacacc2权利要求1、检测猪6-7肋间膘厚性状的方法，包括如下1)-9)中任一技术方案1)检测待测猪的基因组中的GenBankAccessionNumberNM_214049自5’末端第1779位核苷酸为G还是为A，确定猪的基因型是GG、GA还是AA，然后通过基因型确定猪6-7肋间膘厚；所述GG基因型为GenBankAccessionNumberNM_214049自5’末端第1779位核苷酸为G的纯合体；所述AA基因型为GenBankAccessionNumberNM_214049自5’末端第1779位核苷酸为A的纯合体；所述GA基因型为它们的杂合体；2)检测待测猪的基因组中的GenBankAccessionNumberNM_214049自5’末端第1781位核苷酸为G还是为A，确定猪的基因型是GG、GA还是AA，然后通过基因型确定猪6-7肋间膘厚；所述GG基因型为GenBankAccessionNumberNM_214049自5’末端第1781位核苷酸为G的纯合体；所述AA基因型为GenBankAccessionNumberNM_214049自5’末端第1781位核苷酸为A的纯合体；所述GA基因型为它们的杂合体；3)检测待测猪的基因组中的GenBankAccessionNumberNM_214049自5’末端第1782位核苷酸为A还是为T，确定猪的基因型是AA、AT还是TT，然后通过基因型确定猪6-7肋间膘厚；所述AA基因型为GenBankAccessionNumberNM_214049自5’末端第1782位核苷酸为A的纯合体；所述TT基因型为GenBankAccessionNumberNM_214049自5’末端第1782位核苷酸为T的纯合体；所述AT基因型为它们的杂合体；4)检测待测猪的基因组中的GenBankAccessionNumberNM_214049自5’末端第1783位核苷酸为T还是为G，确定猪的基因型是TT、TG还是GG，然后通过基因型确定猪6-7肋间膘厚；所述TT基因型为GenBankAccessionNumberNM_214049自5’末端第1783位核苷酸为T的纯合体；所述GG基因型为GenBankAccessionNumberNM_214049自5’末端第1783位核苷酸为G的纯合体；所述TG基因型为它们的杂合体；5)检测待测猪的基因组中的GenBankAccessionNumberNM214049自5’末端第1784位核苷酸为G还是为C，确定猪的基因型是GG、GC还是CC，然后通过基因型确定猪6-7肋间膘厚；所述GG基因型为GenBankAccessionNumberNM_214049自5’末端第1784位核苷酸为G的纯合体；所述CC基因型为GenBankAccessionNumberNM_214049自5’末端第1784位核苷酸为C的纯合体；所述GC基因型为它们的杂合体；6)检测待测猪的基因组中的GenBankAccessionNumberNM_214049自5’末端第1785位核苷酸为C还是为T，确定猪的基因型是CC、CT还是TT，然后通过基因型确定猪6-7肋间膘厚；所述CC基因型为GenBankAccessionNumberNM_214049自5’末端第1785位核苷酸为C的纯合体；所述TT基因型为GenBankAccessionNumberNM_214049自5’末端第1785位核苷酸为T的纯合体；所述CT基因型为它们的杂合体；7)检测待测猪的基因组中的GenBankAccessionNumberNM_214049自5’末端第1786位核苷酸为T还是为C，确定猪的基因型是TT、TC还是CC，然后通过基因型确定猪6-7肋间膘厚；所述TT基因型为GenBankAccessionNumberNM_214049自5’末端第1786位核苷酸为T的纯合体；所述CC基因型为GenBankAccessionNumberNM_214049自5’末端第1786位核苷酸为C的纯合体；所述TC基因型为它们的杂合体；8)检测待测猪的基因组中的GenBankAccessionNumberNM_214049自5’末端第1787位核苷酸为C还是为G，确定猪的基因型是CC、CG还是GG，然后通过基因型确定猪6-7肋间膘厚；所述CC基因型为GenBankAccessionNumberNM_214049自5’末端第1787位核苷酸为C的纯合体；所述GG基因型为GenBankAccessionNumberNM_214049自5’末端第1787位核苷酸为G的纯合体；所述CG基因型为它们的杂合体；9)检测待测猪的基因组中的GenBankAccessionNumberNM_214049自5’末端第1788位核苷酸为G还是为C，确定猪的基因型是GG、GC还是CC，然后通过基因型确定猪6-7肋间膘厚；所述GG基因型为GenBankAccessionNumberNM_214049自5’末端第1788位核苷酸为G的纯合体；所述CC基因型为GenBankAccessionNumberNM_214049自5’末端第1788位核苷酸为C的纯合体；所述GC基因型为它们的杂合体。2、如权利要求l所述的方法，其特征在于所述确定待测猪的基因型的方法为以待测猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增，然后将酶切后的PCR产物进行电泳。3、如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述PCR扩增的引物对为序列表中的序列1所示的核苷酸序列和序列表中的序列2所示的核苷酸序列；所述酶切所用的酶为限制性内切酶Jral。4、如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于所述方法还包括如下a)步骤和如下b)步骤a)检测待测猪的基因组中的GenBankAccessionNumberAY739704自5'末端第1406位核苷酸为G还是为A(G1406A)，确定猪的基因型是AA、AG还是GG，然后通过基因型确定猪6-7肋间膘厚；所述AA基因型为GenBankAccessionN咖berAY739704自5'末端第1406位核苷酸为A的纯合体；所述GG基因型为GenBankAccessionNumberNM—AY739704自5'末端第1406位核苷酸为G的纯合体；所述AG基因型为它们的杂合体；b)检测待测猪的基因组中的GenBankAccessionNumberAY739704自5'末端第3602位核苷酸为T还是为C(T3602C)，确定猪的基因型是TT、TC还是CC，然后通过基因型确定猪6-7肋间膘厚；所述TT基因型为GenBankAccessionNumberAY739704自5'末端第3602位核苷酸为T的纯合体；所述CC基因型为GenBankAccessionNumberAY739704自5'末端第3602位核苷酸为C的纯合体；所述TC基因型为它们的杂合体。5、如权利要求4所述的方法，其特征在于所述确定猪的基因型的方法为以待测猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增，然后将酶切后的PCR产物进行电泳。6、如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述步骤a)中，PCR扩增的引物对为序列表中的序列3所示的核苷酸序列和序列表中的序列4所示的核苷酸序列，酶切所用的酶为限制性内切酶5)^71;所述步骤b)中，PCR扩增的引物对为序列表中的序列5所示的核苷酸序列和序列表中的序列6所示的核苷酸序列，酶切所用的酶为限制性内切酶7Y力11U。7、检测猪6-7肋间膘厚性状的试剂盒，包括满足如下条件的引物对I:以猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增的产物含有GenBankAccessionNumberNM—214049自5'末端第1779位核苷酸和第1781位至第1788位核苷酸。8、如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括满足如下条件1)的引物对II和满足如下条件2)的引物对III:1)以猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增的产物含有GenBankAccessionNumberAY739704自5'末端第1406位核苷酸；2)以猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增的产物含有GenBankAccessionNumberAY739704自5'末端第3602位核苷酸。9、如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于所述引物对I为序列表中的序列l所示的核苷酸序列和序列表中的序列2所示的核苷酸序列；所述引物对II为序列表中的序列3所示的核苷酸序列和序列表中的序列4所示的核苷酸序列；所述引物对III为序列表中的序列5所示的核苷酸序列和序列表中的序列6所示的核苷酸序列。10、如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括限制性内切酶^ral;所述试剂盒还包括限制性内切酶^ral、限制性内切酶5inWI和限制性内切酶迪lll。全文摘要本发明公开了一种检测猪6-7肋间膘厚性状的方法及其专用试剂盒。本发明公开的方式是检测待测猪的基因组中的GenBankAccessionNumberNM_214049自5’末端第1779位核苷酸、第1781位核苷酸、第1782位核苷酸、第1783位核苷酸、第1784位核苷酸、第1785位核苷酸、第1786位核苷酸、第1787位核苷酸或第1788位核苷酸，确定猪的基因型，然后通过基因型确定猪6-7肋间膘厚。与传统方法相比，应用本发明的方法对出生仔猪进行检测，可以实现早选，缩短选育时间，极大地减少选育费用。同时，本发明的方法提高了选育的准确性，减少了人力物力的浪费。文档编号C12Q1/68GK101407844SQ20081022763公开日2009年4月15日申请日期2008年11月27日优先权日2008年11月27日发明者李红霞,赵兴波申请人:中国农业大学