一种融合蛋白及其编码基因与应用的制作方法

专利名称：：一种融合蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种融合蛋白及其编码基因与应用。技术背景尿酸氧化酶(UricaseorUrateOxidase,UOXEC1.7.3.3)是嘌呤代谢途径的一个关键酶，能催化尿酸形成尿囊素。尿酸和尿囊素是不同生物嘌呤代谢的最终产物，两者的溶解性差别很大，尿酸在体内的溶解度很低，约为llmg/dl水，而尿囊素为它的13.5倍，约为147mg/dl水。尿酸在体内的累积可引起痛风和尿酸盐肾病(Duk-HeeKang,TakahikoNakagawa,LiliFengetal.ARoleforUricAcidintheProgressionofRenalDisease[J〗.《/^w.S"oc.A^p/zra/.,2002,13:2888-2897)。有研究表明，尿酸在体内的积累与心、肾等组织器官的功能障碍有关，用尿酸氧化酶抑制剂温和诱导的高尿酸小鼠模型，出现了肾动脉病、肾损伤及高血压等症状，去除抑制剂后症状的缓解和消失证明了尿酸是这些疾病的原因所在。研究表明，动脉疾病可能与尿酸促进平滑肌细胞的增殖有关。尿酸氧化酶基因(uox)是一个古老的基因，存在子原核生物和真核生物中(XiangweiWu，ChengChiLee,DonnaM.Muzfty,EtAl.Urateoxidase:Primarystructureandevolutionaryimplications[J]./Voc.Ato/Jeaaf,Sc/.，1989,86:9412-9416)。来源于不同生物的U0X基因同顏性不高，例如，枯草芽孢杆菌(5^///^犯^7/力和大豆的1](之间的序列同源性为25%，黄曲霉^avM力和大豆的UOX之间的序列同源性为29%，B.subtilis和A/7rn^s的UOX之间的序列同源性为36%，但是构成活性位点的氨基酸残基序列在所有的物种中都是保守的。UOX活性的丧失在许多亲缘关系较远的种属中发现，如鸟类、陆栖爬行动物、圆口类、除双翅目以外的昆虫和环虫类中。在人类和鸟类中缺少有活性的U0X，因而以尿酸作为嘌呤代谢的最终产物排出体外，导致了高尿酸症和与之相关的痛风性关节炎(MasakoOda，YokoSatta,OsamuTakenaka,etal丄ossofUrateOxidaseActivityinHoinoidsanditsEvolutionaryImplications[J].Mo/.￡vo/.，2002,19(5):640-653)，人血清中尿酸的浓度比其它哺乳动物高五十倍。敲除uox基因的大鼠引发了严重的的祖先到现代人的UOX基因都存在一个单一无义突变，使得蛋白的翻译过程提前终止，导致了uox活性的丧失。在灵长类动物中，原猴亚目和老世界猴表现出了相对于大鼠和兔子中等水平的UOX活性；与之相比，人属和一些新世界猴则没有表现出任何可以检测到的UOX活性。人的UOX基因与老世界猴的UOX基因的同源性为96%，说明在进化中存在一个突发事件，导致人的UOX基因沉默；新世界猴与人的亲缘关系比它与老世界猴的要近，因此新世界猴的UOX的失活不太可能与人的uox的突变一样。人体内的高尿酸可能由几个原因造成，随着年龄的增大，人体功能衰退，导致排尿酸尿能力减弱，尿酸在肾小管及集尿管内沉积，引起了痛风。此外，对于肿瘤患者而言，治疗过程中导致的肿瘤细胞的大量死亡，使得体内的尿酸浓度急剧升高，即所谓的肿瘤溶解综合征(TumorLysisSydrome，TLS)。TLS最常出现于儿童急性白血病及淋巴瘤，成人肿瘤患者偶尔也会出现，治疗过程中伴随着骨髓和淋巴的快速增生，通常会导致肾衰竭和其它器官的损伤。临床上用于治疗高尿酸症的药物主要包括别嘌呤醇、卤化尿液、水合或透析等。通过抑制黄嘌呤氧化酶的活性，别嘌呤醇减少了尿酸的生成，但增加了尿酸前体(黄嘌呤和次黄嘌呤)对肾脏的负担，而黄嘌呤在尿中的溶解度比尿酸更低，因此别嘌呤醇治疗高尿酸症常常导致黄嘌呤肾病和结石，而且体内原有的尿酸不受别嘌呤醇的影响，只能靠病人自身排出。卤化和水合只能部分增加尿酸的排泄量，都不是理想的方法，可能需要不时透析。UOX通过酶的直接催化将尿酸氧化成尿囊素，而后者在尿液中的溶解量相对于前者成倍增加，应用UOX在临床上治疗TLS的高危病人被证明是肪止发生TLS的有效方法(Annemans,K.Moeremans，M.Lamotte,etal.Pan-Europeanmulticentreeconomicevaluationofrecombinanturateoxidase(rasburicase)inpreventionandtreatmentofhyperuricaemiaandtumourlysissyndromein.ha6matologicalcancerpatients[J〗.CareOmcer,2003，11:249—257;StantonC.Goldmaft,JohnS.Holcenberg,JerryZ.Finklestein,etal.Arandomizedcomparisonbetweenrasburicaseandallopurinolinchildrenwithlymphomaorleukemiaathighriskfortumorlysis[J].5/ood,2001,97(10):2998-3003)。在随机抽取的TLS高危病人中，分别用别嘌呤醇、重组U0X、卤化和水合进行治疗，结果表明，重组UOX可以在四个小时之内使血浆中的尿酸水平显著下降2.6倍，并且保持在8mg/L以下；而用别嘌呤醇治疗的病人在96小时之后尿酸水平会达到重组uox治疗的水平，但产生的尿酸前体-黄嘌呤和次黄嘌呤加重了肾脏的负担，有时需要透析除去。实验表明，重组uox可以有效地防止高白血球的儿童急性白血病患者在治疗过程中出现TLS症状。大量的数据表明，在防止和治疗在肿瘤患者化疗过程中出现的TLS症状方面，重组U0X比别嘌呤醇更为有效和安全。注射尿酸氧化酶至少可以短暂减轻高尿酸血症及高尿酸尿。因为尿酸氧化酶是人体外源性蛋白，重复注射重组UOX会产生抗UOX的抗体，抑制了UOX的活性。可以通过应用可溶性聚合物屏蔽酶分子的表面，降低抗原性和免疫原性，并延长酶分子的半衰期(Davis,Y.K.Park,A.Abochowski,F.F.Davis,Hypouricaemiceffectofpolyethyleneglycolmodifiedurateoxidase,Lancet2(1981)281—283.中国专利CN1896231A)。目前PEG修饰的U0X在国外已进入III期临床试验。人血清白蛋白(HSA)是一种可溶性单体蛋白质，构成血液中蛋白总量的一半。白蛋白作为一种基本载体，携带并传递脂肪酸、类固醇和激素分子等，其稳定的惰性性质是维持血压的一个重要因素。血清白蛋白是一种球状、非糖基化的、分子量为65kD的血清蛋白质。人血清白蛋白基因位于第4号染色体上，有16961个碱基对，分为15个间隔区，经RNA加工拼接后形成的niRNA可编码一个具有585个氨基酸残基的蛋白质，这一蛋白再经过高尔基体的转化加工，去除引导多肽而分泌到细胞外。血清白蛋白有35个半胱氨酸残基，在血液中是一个有17个二硫键的单体。利用微生物表达重组白蛋白的方法已在专利文献中公开(EP330451;EP361991;CN1119352C)。白蛋白是血液中的主要成分，在人体内的含量为40克/升血液，半衰期寿命为14-20天。利用基因工程技术，将人血清白蛋白与人生长激素、干扰素或白介素-2等生物活性因子构建融合蛋白并在酵母中进行表达，已在中国专利(CN1515591A;CN1269840C)中公开，通过与白蛋白融合可以提高生物活性因子在血液中的半衰期。
发明内容本发明的目的是提供一种融合蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的融合蛋白包括尿酸氧化酶和白蛋白，所述尿酸氧化酶可以直接连接在所述白蛋白的N末端或C末端形成融合蛋白，也可以通过一个连接肽来连接所述白蛋白和所述尿酸氧化酶以形成融合蛋白。所述连接肽的长度为2-100个氨基酸，优选为5-50个氨基酸，更优选为5-20个氨基酸。连接肽的长度可短至所述白蛋白大分子对所述尿酸氧化酶形成的位阻保持最小，如(G4S)h。连接肽有利于尿酸氧化酶与其底物尿酸的结合，但连接肽的加入可能使融合蛋白在作为药物使用时产生额外的免疫原性，最优选的是没有连接肽。上述融合蛋白既可以是分泌型表达蛋白，也可以是细胞内表达蛋白，具体可为分泌型表达蛋白。所述尿酸氧化酶为非人源的尿酸氧化酶，如来源于微生物(如黄曲霉(Aspergillusflavus)、假丝酵母(Candidautilis)、枯草杆菌(Bacillussp.)等)、植物(如大豆(Glycinemax)根瘤等)、无脊柱动物(如果蝇(Drosophilamelanogaster))或有脊柱动物(如猪、牛、羊、狒狒)等的尿酸氧化酶，或其突变体。所述白蛋白为与人血清白蛋白具有90%以上同源性的蛋白，具体可为人血清白蛋白。所述融合蛋白具体可为下述l)、2)、3)或4)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质；3)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；4)将序列表中序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由3)衍生的蛋白质。上述2)或4)的融合蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述2)的融合蛋白的编码基因可通过将序列表中序列1的自5'端第13-2703位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到。上述4)的融合蛋白的编码基因可通过将序列表中序列3的自5'端第10-2772位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到。上述融合蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。上述融合蛋白的编码基因具体可为如下l)一6)中任一所述的基因1)其编码序列是序列表中序列1自5'末端第13-2703位脱氧核糖核苷酸；2)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码所述融合蛋白的DNA分子；3)与l)的基因具有90%以上的同源性，且编码所述融合蛋白的DNA分子；4)其编码序列是序列表中序列3自5'末端第10-2772位脱氧核糖核苷酸；5)在严格条件下可与序列表中序列3限定的DNA序列杂交且编码所述融合蛋白的DNA分子；6)与4)的基因具有90%以上的同源性，且编码所述融合蛋白的DNA分子。上述严格条件可为在6xSSC，0.5。/。SDS的溶液中，在65。C下杂交,然后用2xSSC,0.1%SDS和lxSSC,0.1%SDS各洗膜一次。扩增上述融合蛋白编码基因全长或任一片段的引物对，含有上述融合蛋白编码基因的重组载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。可用现有的表达载体构建含有所述融合蛋白编码基因的重组表达载体，具体可为pPIC质粒。所述宿主包括但不局限于哺乳动物(如人、猴、鼠、兔等)、鱼、昆虫、植物、酵母、真菌和细菌等，优选为酵母属，包括但不局限于酿酒酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、念珠菌属(Candida)、孢园酵母属(Tarulaspora)和裂殖酵母属等；更优选地为毕赤酵母属巴斯德菌种(Pichiapastoris)。本发明将非人源的尿酸氧化酶和人血清白蛋白融合制备成融合蛋白，实验结果表明，该融合蛋白和非人源的尿酸氧化酶具有相似的体内和体外生物活性，且免疫原性极大地降低，可以解决异源尿酸氧化酶在用于人体治疗过程中所产生的免疫原性问题，可用于制备治疗高尿酸血症和痛风症的药物。本发明的融合蛋白具有以下优点1)对人体而言免疫原性极低；2)可以延长尿酸氧化酶在人体内的半衰期；3)可以重复给药，提高疾病的治疗效果；4)保持尿酸氧化酶原有的分解尿酸的活性；5)减少潜在的尿酸氧化酶使用时伴随的副作用或毒性，主要是减少抗体的产生和减少过敏反应。图1为含有融合蛋白编码基因的重组载体的构建过程图2为融合蛋白HSA-UO在酵母中的表达和纯化结果图3为融合蛋白HSA-U0和rU0在大鼠体内的免疫原性测定结果具体实施方式实施例l、白蛋白和尿酸氧化酶融合蛋白的制备1、人血清白蛋白编码基因的获得以人胎肝cDNA文库(购自Clontech公司，产品编号637230)为模板，设计引物扩增不含信号肽编码序列的人血清白蛋白基因(HSA)，具体引物如下-HSA5:5'-TCGCTCGAGAAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGG-3'(Xho1)，HSA3:5'-TTGGATCCACCTCCACCGGAACCTCCACCTCCTAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTG-3'(BamHI)。PCR扩增体系:人胎肝cDNAl，L，HSA5引物和HSA3引物各0.5叱，dNTP2叱，KODDNAPolymerase0.l叱，10XKODbuffer2叱，MgS042叱，ddH2035叱，总体积50叱。PCR反应条件为94°C30s，53°C30s，72°C2min，共30个循环。对PC財广增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明，获得约1700bp的条带；纯化并回收该条带进行测序，测序结果表明，所获得的条带的核苷酸序列即为人血清白蛋白的编码基因，将其命名为^W。以人胎肝cDNA文库(购自Clontech公司，产品编号637230)为模板，设计引物扩增含信号肽的人血清白蛋白基因(SHSA)，具体引物如下SHSA5:5'-GACGGATCCACCATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCC-3'(BamHI)，SHSA3:5'-TTGAATTCACCTCCACCGGAACCTCCACCTCCTAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTG-3'(EcoRI)。PC財广增体系:人胎肝cDNA1.0叱，SHSA5引物和SHSA3引物各0.5叱，dNTP2nL，KODDNAPolymerase0.1ML，10XKODbuffer2nL，MgS042叱，ddH2035叱，总体积50叱。PCR反应条件为94°C30s，53°C30s，72。C2min，共30个循环。对PC財广增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明，获得约1800bp的条带；纯化并回收该条带进行测序，测序结果表明，所获得的条带的核苷酸序列即为含有信号肽的人血清白蛋白的编码基因，将其命名为5F6^。2、尿酸氧化酶编码基因的获得以含有黄曲霉尿酸氧化酶基因的质粒pET-UO(吴伟立，方宏清等.尿酸氧化酶的表达纯化及活性形式鉴定。军事医学科学院院刊，2005，29(2):124-126.)为模板，设计引物扩增UOX基因，具体引物如下AFU5:5'-CGTAGATCTATGTCAGCAGTAAAAGCAGCAC-3'(BglII)AFU3:5'-TGGAATTCTTACAATTTAGACTTCTGAGAGGAAC-3，(EcoRI)。PCR扩增体系pET-UO质粒l.0叱，AFU5引物和AFU3引物各0.5叱，dNTP2叱，K0DDNAPolymerase0.l叱，10XK0Dbuffer2叱，MgS042nL，ddH2035叱，总体积50叱。PCR反应条件为94°C30s,53°C30s，72°Clmin，共30个循环。对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明，获得约900bp的条带；纯化并回收该条带进行测序，测序结果表明，所获得的条带的核苷酸序列即为黄曲霉尿酸氧化酶的编码基因，将其命名为力/^m;为了提高在酵母中的表达水平，根据酵母偏爱密码子设计优化了尿酸氧化酶基因〃M，并委托上海生工公司进行人工合成，将合成的尿酸氧化酶基因W24插入到pMD18载体上，将得到的重组载体命名为pMD18-U0A。3、重组载体pPIC9-HSAL2U0的构建(^K^M/^m之间有两个GGGGS)将上述步骤l获得的^W经XhoI和BamHI双酶切后插入到经同样酶切的pIB2载体(IrinaBSears,JamseO'Connor,OliviaWRossanese,BenjaminSGlick.AversatilesetofvectorsforconstitutiveandregulatedgeneexpressioninPichiapastoris.Yeast,14(8)783-790，1998)中，将测序鉴定正确的重组载体命名为pIB2-HSA。pIB2载体的多克隆位点依次有Xho1、BamHI和EcoRI酶切位点。将上述步骤2获得的JH/flT基因经BglII和EcoRI双酶切后插入到经BamHI和EcoRI双酶切的上述构建的pIB2-HSA载体中，将测序鉴定正确的重组载体命名为pIB2-HSAL2U0。pIB2-HSAL2U0经XhoI和EcoRI双酶切后，得到不带信号肽但带有连接肽的人血清白蛋白和尿酸氧化酶的融合基因，将其命名为MHft^K^iY/6的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列1所示，其编码的融合蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。将上述获得的融合基因^K4Z2〃瀬入到经XhoI和EcoRI双酶切的pPIC9载体(购自Invitrogen公司，目录号K1710-01)中，将获得的重组载体命名为pPIC9-HSAL2U0。重组载体pPIC9-HSAL2U0的具体构建过程如图l所示。4、重组载体pPIC9-SHSAL2U0A的构建将上述步骤l获得的6F54经BaraHI和EcoRI双酶切后分别插入到经同样酶切的pIB2载体(IrinaBSears,JamseO'Connor,OliviaWRossanese,BenjaminSGlick.AversatilesetofvectorsforconstitutiveandregulatedgeneexpressioninPichiapastoris.Yeast,14(8)783-790,1998)中，将经测序鉴定正确的重组载体命名为pIB2-SHSA。将上述步骤2获得的重组载体pMD18-U0A用Bgl—n和EcoRI双酶切后，回收约900bp的W^基因片段，插入到经BamHI和EcoRI双酶切的上述步骤3获得的pIB2-HSA载体中，将经测序鉴定正确的重组载体命名为pIB2-HSAL2U0A。pIB2-HSAL2U0A经Ndel(位于AK4基因中)和EcoR工双酶切后回收约1700bp的目的片段，插入到经NdeI(位于#5>1基因中)禾口EcoRI双酶切的pIB2-SHSA载体中，将经测序鉴定正确的重组载体命名为pIB2-SHSAL2U0A。pIB2-SHSAL2U0A经BamHI和EcoRI双酶切，回收约2800bp的小片段，得到带有信号肽并带有连接肽的人血清白蛋白和尿酸氧化酶的融合基因，将其命名为■MK4Z^/fl4，SW5^Z^/创的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列3所示，其编码的融合蛋白的氨基酸序列如序列表中序列4所示。将该基因插入到经经BamHI和EcoRI双酶切的pPIC9载体(购自Invitrogen公司，目录号K1710-01)中，将经测序鉴定正确的重组载体命名为pPIC9-SHSAL2U0A。重组载体pPIC9-SHSAL2U0A的具体构建过程如图1所示。5、将重组质粒pPIC9-HSAL2U0和pPIC9-SHSAL2U0A分别转入毕赤酵母中表达相应的融合蛋白将上述步骤3和步骤4获得的重组质粒pPIC9-HSAL2U0和pPIC9-SHSAL2U0A用SalI进行线性化后分别电转化至毕赤酵母菌GS115中，将获得的重组菌分别涂布在MD培养基(1.34%质量百分含量酵母基本氮源、4X10—5%质量百分含量生物素、1%质量百分含量葡萄糖和2%质量百分含量琼脂粉)平板上，3(TC培养2天以上。对长出的单克隆先进行PCR鉴定，然后再将所有的PCR阳性克隆按照Invitrogen公司操作手册中的要求进行表达筛选，获得高表达的菌株。具体筛选方法如下取3ml40ixmol/L的尿酸溶液，分别加入100u1上述含有重组质粒pPIC9-HSAL2U0或pPIC9-SHSAL2U0A的重组菌的培养上清液，室温或37。C放置5min后，用0.3ml质量百分含量为20。/o的KOH终止反应，测定293nm处吸光值的变化。吸光值变化越大，表明重组菌表达的融合蛋白中的尿酸氧化酶活性越高，相应融合蛋白的表达水平也越高。6、融合蛋白HSAUOA的表达和纯化将上述步骤5筛选得到的高表达HSAUOA融合蛋白的重组菌接种到装有200mLBMG培养基的三角瓶中进行增殖，将得到的发酵液作为种子液；将上述种子液再转接至装有3L基础培养基(40g/L甘油，18g/LK2S04，15g/LMgS04.7H20，4.13g/LKOH，0.9g/LCaS04.2H20，13.3mL/LH线)的5L发酵罐中，30°CpH5.0的条件下进行发酵。发酵20小时后第I相结束，按0.8ml/min的流速流加质量百分含量为5%的甘油100ml。2小时后发酵第II相结束，调培养温度至2(TC，调pH至6.5，再在培养基中加入3g大豆蛋白胨，按0.2ml/min的流速流加甲醇进行诱导培养，90小时后结束发酵，离心收集上清。在上述上清液中加入硫酸铵至上清液中硫酸铵的摩尔浓度为l.2M，用25raM磷酸缓冲液(PH7.0)+1.2M硫酸铵组成的混合液预平衡Phenyl柱，上样，然后用含有l.2M至0M硫酸铵的25mM磷酸缓冲液(PH7.0)梯度洗脱，收集活性峰，浓縮至10-15ml。再用25mM磷酸缓冲液(PH7.0)+0.15M氯化钠组成的混合液预平衡Superdex200柱，将上述浓縮液上样，收集活性峰。将收集到的蛋白进行SDS-PAGE，结果如图2所示。图2中，Marker为蛋白分子量标准，1为上述发酵液上清的SDS-PAGE结果，2、3为疏水层析收集到的活性峰的SDS-PAGE结果，4为凝胶过滤收集到的活性峰的SDS-PAGE结果。实施例2、融合蛋白在大鼠体内的免疫原性的测定将雄性SD大鼠分为两组，分别为HSAUOA融合蛋白组和rUO蛋白组(rUO蛋白的制备过程参见吴伟立，方宏清等.尿酸氧化酶的表达纯化及活性形式鉴定。军事医学科学院院刊，2005，29(2):124-126.)，每组五只大鼠，分别静脉注射上述实施例1制备的HSAUOA融合蛋白和按照上述文献方法制备的rUO蛋白。HSAUOA融合蛋白组的给药剂量为0.9mg/kg体重，rU0组的给药剂量为0.3mg/kg体重。每周给药一次，连续给药四周。分别于第一次给药前和第一次给药后14、21、28和35天采血，分离血清，放于4t:冰箱待测，并连续观察2个月。以rUO包被酶联板，采用ELISA法测定抗体滴度，实验设三次重复，大鼠静脉连续注射HSAUOA融合蛋白及rUO蛋白后，抗体滴度随时间变化的结果如图3和表1所示。从表l中可以看出，静脉注射HSAUOA融合蛋白后，大鼠体内产生的抗体水平明显低于静脉注射rUO后大鼠体内产生的抗体水平(P〈0.05)，并且连续静脉注射rU0后，大鼠体内抗体水平呈不断升高趋势，而连续静脉注射HSAUOA融合蛋白后，大鼠体内的抗体水平未见明显升高。从图3中可以看出，注射上述实施例1制备的HSAUOA融合蛋白后第14d、21d、28d和35d，大鼠体内产生的抗体滴度分别为20、120、100和40;注射rUO蛋白后第14d、21d、28d和35d，大鼠体内产生的抗体滴度分别为416、1000、9600和32000。_表1大鼠连续静脉注射HSAUOA及rUO后的抗体滴度_<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><160>4〈210>1〈211〉2706<212〉DNA<213>人工序列<220><223><400〉1ctcgagaaaagagatgcacaca卿gtgaggttgctcatcggtttELa^gatttggg卿360gaa^atttca^a^gccttggtgttgattgcctttgctcagtatcttcagcagtgtccattt120gaagatcatgtaaaattagtgaatg犯gtaactgaatttgca^aacatgtgttgctgat180gagtX3gctg3a^attgtg3caaatcacttcataccctttttggagacaaattatgcaca240gttgcaactcttcgtgaaacctatggtga3atggctgactgctgtgc^aacaagaacct300aatgcttcttgcaa^ca^aagatgacaaccc^acctcccccgattggtg360卿CC8gELggttgatgtgatgtgcactgcttttcatgaca3tttttg3a^420aaatacttatatgaa3ttgccagaagacatccttacttttatgccccggaactccttttc480tttgctaaaaggtataaagctgcttttacagaatgttgccaagctgctgataaagctgcc540tgcctgttgccaaagctcgatgaacttcggg^tg鄉gg3aggcttcgtctgccaaacag600agactcaagtgtgccagtctctttcaaagc660gctcgcctgagccagagatttcccaaagctgagtttgcag^gtttcca^gttagtgaca720gatcttaccaaagtccacacgg犯tgctgccatggagatctgcttgaatgtgctgatgac780agggcggaccttgccaagtatatctgtgaacgatctccagtaaactgaag840gaatgctgtgaaaaacctctgttgg3a^3tcccactgcattgccgaagtggaaaatgat■g卿tgcctgctgacttgccttcattagctgctgattttgttgaaagtaaggatgtttgc960a^aactatgctgaggcaaaggatgtcttcctgggcatgtttttgtatgaatatgcaaga1020aggcatcctgattactctgtcgtgctgctgctgagacttgccaagacatatgaaaccact1080ctagagaagtgctgtgccgctgcagatcctcatgaatgctatgccaaagtgttcgatgaa1140tttaaacctcttgtggaagagcctcagaataaaattgtgagctttttgag1200cagcttggagagtacaaattccagaatgcgctattagttcgttacaccaagaaagtaccc1260caagtgtcaactccaactcttgt卿ggtctaggaaaagtgggcsgca^1320tgttgtaaacatcctg肌gc犯daa^atgccctgtgcagaagactatctatccgtggtc1380ctgaaccagttatgtgtgttgcatgeLgaaaacgccagtaagtgacagagtcaccaaatgc1440tgcacagaatccttggtgaacaggcgaccatgcttttcagctctggaagtcga^tga^ica1500tacgttcccaaELgagttta^tgctg￡La^ca<ttcaccttcca^tgcagatatatgcacactt1560tctg卿3ggcccaaggcaaaagtgctgcagctgcaagtctc3gcagt犯gacgagaaga_g卿ttg卿33ga^cEicca_tccatcctggattgtctgccatccgcgacagatatcaagtggcttcctgcgacgtcgatggtgcctaagtgaagataacacgccagcagcgscctgagctcagtcggaccttgtaaagagacaaatcaaaagagcaaggctgacgaaagctgccttaa_gcsgcacgccggtgtccacctcttacactttacatcacgcacacacttaccgctggacgcg鄉3ga3cgtctctgtcgtgacg叫taccacttggcatcgatgctacgtgccagcgttg3tCg3g3CggC3CMgggccaacggtctca^gaaa^caaactgaaagctta^ggagaccaggcttaggactacggcaaggacggtgtaccaaggccgsccgccaagcagC3ttg3g33gccggatggacgcggaatgtgcggcctgacccaccacacttgtggaag组ctgggccactgcaggccacttgtcgagtaccctcca^aacgatcaagtgtactgcacttggttatggatgtgctttgccgggtggaggttgacaatgtccgagatgaccgaacagcgtcaaaccccgttatacaaccacaattgacggcacaggtggacggtgctg33geiaaggagacctttcagtggacgctcgcgaggtcgttgccta8ccggca￡ig3accgtcggccttgagcttgtatttcgcagcagg鄉gtaaccggtggagggcgtctacaatctgtgtgctttgtcgcaacctcctcccgatccatgccgc3gCC3C3CCCtggtcgaggggcaccaactcgggaccgtattccaggaggttcactctgaatggc卿gcaacgccgaggtgttcctctcagaaacac^gttttgtagagaaaacttgtttggatctatgggttcacaagtctggagggtcgactccattgctgttcggctcacgtcaactcactccttcC犯gggC3tCgcagttctggcctgagcaccccgctcgcacgacttttgctaatcctggcgtttcgaaatccttcgctcctga_3gtcta_aa16201680174018001860192019802040210021602220228023402400246025202580264027002706〈210〉2〈211〉897<212〉PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉<400>2AspAlaHisLysGluAsnPheLys20GinCysProPhe35PheAlaLysThr50SerLeuHisThrSer5AlaGluCysLeuGluValAlaLeuVslLeuAspHisVal40ValAlaAsp55PheGlyAspHisArgPheLysAspLeuGlyGlu1015lieAlaPheAlaGinTyrLeuGin2530LysLeuValAsnGluValThrGlu45GluSerAlaGluAsnCysAspLys60LysLeuCysThrValAlaThrLeu65ArgGluGluArgProArgAspAsn130ArgHis145TyrLysCysLeuSerAlaArgAla210LysAla225ValHisArgAlaSerLysCyslie290LeuAla305GluAlaArgHisTyrGlu70ThrTyrGlyGlu85AsnGluCysPhe100LeuValArgPro115GluGluThrPheProTyrPheTyr150AlaAlaPheThr165LeuProLysLeu180LysGinArgLeu195PheLysAlaTrpGluPheAlaGlu230ThrGluCysCys245AspLeuAlaLys260LeuLysGluCys275AlaGluValGluAlaAspPheVal310LysAspValPhe325ProAspTyrSer340ThrThrLeuGlu355MetLeuGluLeu135AlaGluAspLysAla215ValHis丁yrCysAsn295GluLeuValLysAlaGinVal120LysProCysGluCys200ValSerGlylieGlu280AspSerGlyValCys360AspHis105AspLysGluCysLeu185AlaAlaLysAspCys265LysGluLysMetLeu345CysCys9075CysAspAlaAspLysAsnValMetCysThr125TyrLeuTyrGlu140LeuLeuPhePhe155GinAlaAlaAsp170ArgAspGluGlySerLeuGinLys205ArgLeuSerGin220LeuValThrAsp235LeuLeuGluCys250GluAsnGinAspProLeuLeuGlu285MetProAlaAsp300AspValCysLys315PheLeuTyrGlu330LeuLeuArgLeuAlaAlaAlaAsp365GinPro110AlalieAlaLysLys190PheArgLeuAlaSer270LysLeuAsnTyrAla350Pro80GluPro95AsnLeuPheHisAlaArgLysArg160AlaAla175AlaSerGlyGluPheProThrLys240AspAsp255lieSerSerHisProSerTyrAla320AlaArg335LysThrHisGluCysTyrAlaLys370GinAsnLeulie385TyrLysPheGinGinValSerThr420ValGlySerLys435AlaGluAspTyr450GluLysThrPro465LeuValAsnArgTyrValProLys500lieCysThrLeu515LeuValGluLeu530LysAlaValMet545AlaAspAspLysAlaAlaSerGin580GlyGlySerMet595ValArgValTyr610ValTyrGluMet625SerTyrThrLysLysAsnThrlieValLysAsn405ProCysLeuValArg485GluSerValAspGlu565AlaSerLysThrAla645TyrPheGin390AlaThrCysSerSer470ProPheGluLysAsp550ThrAlaAlaValVal630AsplieAsp375AsnLeuLeuLysVal455AspCysAsnLysHis535PheCysLeuValHis615CysAsnThrGluCysLeuValHis440ValArgPheAlaGlu520LysAlaPheGlyLys600LysValSerAlaPheGluValGlu425ProLeuValSerGlu505ArgProAlaAlaLeu585AlaAspLeuValLysLysLeuArg410ValGluAsnThrAla490ThrGinLysPheGlu570GlyAlaGluLeulie650GinProPhe395TyrSerAlaGinLys475LeuPhelieAlaVal555GluGlyArgLysGlu635ValAsnLeu380GluThrArgLysLeu460CysGluThrLysThr540GluGlyGlyTyrThr620GlyAlaProValGinLysAsnArg445CysCysValPheLys525LysLysLysGlyGly605GlyGluThrValGluGluProLeuLysLeu430MetValThrAspHis510GinGluCysLysSer590LysVallieAspThrGlyGlu400ValPro415GlyLysProCysLeuHisGluSer480GluThr495AlaAspThrAlaGinLeuCysLys560LeuVal575GlyGlyAspAsnGinThrGluThr640Serlie655ProProGluLeuHislie690MetAsp705GluGluAsplieSerGinThrTrp770LysGin785AspAlaGluAspGinlieProAsn850GinAsn865AsnGlyLeuPhe675HislieLysLysPhe755AspPheThrAsnLeu835LysThrLeu660GlyAlaAspArgSer740TrpArgSerTrpSer820AlaHisGlylieSerAlaGlyAsn725SerGlylieGlyAla805AlaArgTyrLysLys885lieHisLys710ValLeuPheLeuLeu790ThrSerGinPheAsn870CysLeuVal695ProGinSerLeuSer775GinAlaValGinGlu855AlaThr665GlyThrHisPhe680AsnlieValCysHisProHisSer715ValAspValVal730GlyLeuThrVal745ArgAspGluTyr760ThrAspValAspGluValArgSer795ArgGluValThr810GinAlaThrMet825LeulieGluThr840lieAspLeuSerGluValPheAla875ValGlyArgSer890lieHis700PheGluLeuThrAla780HisLeuTyrValTrp860ProSerGlu685ArglieGlyLysThr765ThrValLysLysGlu845HisGinGin670LysTrpArgLysSer750LeuTrpProThrMet830TyrLysSerLysTyrAsnThrArgAspSer720Glylie735ThrAsnLysGluGinTrpLysPhe■PheAla815AlaGluSerLeuGlyLeuAspPro880SerLys895<210>3<211>2781<212>DNA〈213>人工序列〈220〉<223〉<400〉3ggatccaccatgaagtgggtaacctttatttcccttctttttctctttagctcggcttat60tccaggggtgtgtttcgtcgagatgcacacaagagtgaggttgctcatcggtttaiaagat120ttgggagaag犯aatttcaaagccttggtgttgattgcctttgctcagtatcttcagcag180tgtccatttgaagatcatgtaaaattagtgaatgaagtaactgaatttgcaaaaacatgt240gttgctgatgagtcagctgaaaattgtgacaaatcacttcataccctttttggagacaaa300ttatgcacagttgcaactcttcgtgaaacctatggtgaaatggctgactgctgtgcaaaa360caagaacctgagagaaatgaatgcttcttgcaacacaaagatgacaacccaaacctcccc420cgattggtgagaccagaggttgatgtgatgtgcactgcttttcatgacaatgaagagaca480tttttgaaaaaatacttatatgaaattgccagaagacatccttacttttatgccccggaa540ctccttttctttgctaaaaggtataaagctgcttttacagaatgttgccaagctgctgat600aaagctgcctgcctgttgccaaagctcgatgaacttcgggatgaagggaaggcttcgtct660gccaaacagagactcaagtgtgccagtctccaaaaatttggagaaagagctttcaaagca720tgggcagtagctcgcctgagccagagatttcccaaagctgagtttgcagaagtttccaag780t"tagtgacagatcttaccaaagtccacacggaatgctgccatggagatctgcttgaatgt840gctgatgacagggcggaccttgccaagtatatctgtgaaaatcaagattcgatctccagt900aaactgaaggaatgctgtgeiaaaacctctgttggaaaaatcccactgcattgccgaagtg%0gaaaatgatgagatgcctgctgacttgccttcattagctgctgattttgttgaaagtaag1020gatgtttgcaaaaactatgctgaggcaaaggatgtcttcctgggcatgtttttgtatgaa1080tatgcaagaaggcatcctgattactctgtcgtgctgctgctgagacttgccaagacatat1140gaaaccactctagagaagtgctgtgccgctgcagatcctcatgaatgctatgccaaagtg1200ttcgatgaatttaaacctcttgtggaagagcctcagaatttaatcaaacaaaattgtgag1260ctttttgagcagcttggagagtacaaattccagaatgcgctattagttcgttacaccaag1320aaagtaccccaagtgtcaactccaactcttgtagaggtctcaagaaacctaggaaaagtg1380ggcagc^atgttgtaa^catcctga^gcaaaaagaatgccctgtgc3gaagactatcta1440tccgtggtcctgaaccagttatgtgtgttgcatgagaaaacgccagtaagtgacagagtc1500accaaatgctgcacagaatccttggtgaacaggcgaccatgcttttcagctctggaagtc1560gatgaaacatacgttcccaaagagtttaatgctgaaacattcaccttccatgcagatata1620tgcacactttctgagaaggagagacaaatcaagaaacaaactgcacttgttgagcttgtg1680^acac犯gcccaaggc3acaa^g3gca^ctg3￡i￡Lgctgttatgg￡itgatttcgcsgct1740tttgtagagaagtgctgcaaggctgacgataaggagacctgctttgccgaggagggtaaa1800aaacttgttgctgcaagtcaagctgccttaggcttaggaggtggaggttccggtggaggt1860ggatxtatgtccgctgttaaggctgctagatacggtaaggacaacgttagagtttacaag1920gttcacaaggacgagaagaccggtgttcaaaccgtttacgagatgaccgtttgtgttttg1980ttggagggtgagatcgagacctcctacaccaaggctgacaactccgttatcgttgctacc2040gactccatcaagaacaccatctacatcaccgctaagcaaaacccagttaccccaccagag2100ttgttcggttccatcttgggtacccacttcatcgagaagtacaaccacatccacgctgct2160cacgttaacatcgtttgtcacagatggaccagaatggacatcgacggtaagccacaccca2220cactccttcatcagagactccgaggagaagagaaacgttcaagttgacgttgttgagggt2280aagggtatcgacatcaagtcctccttgtccggtttgaccgttttgaagtccaccaactcc2340caattctggggtttcttgagagacgagtacaccaccttgaaggagacctgggacagaatc2400ttgtccaccgacgttgacgctacctggcaatggaagcaattctccggtttgcaagaggtt2460agatcccacgttccaaagttcgacgctacctgggctaccgctagagaggttaccttgaag2520accttcgctgaggacaactccgcttccgttcaagctaccatgtacaagatggctgagcaa2580atcttggctagacaacaattgatcgagaccgttgaatactccttgccaaacaagcactac2640ttcgagatcgacttgtcctggcacaagggtttgcaaaacaccggtaagaacgctgaggtt2700ttcgctccacaatccgacccaaacggtttgatcaagtgtaccgttggtagatcctcccaa2760aagtccaagttgtaagaattc2781<210>4〈211〉921〈212〉PRT<213〉人工序列<220><223>〈400〉4MetLysTrpValThrPhelieSerLeuLeuPheLeuPheSerSerAla151015TyrSerArgGlyValPheArgArgAspAlaHisLysSerGluValAla202530HisArgPheLysAspLeuGlyGluGluAsnPheLysAlaLeuValLeu354045lieAlaPheAlaGinTyrLeuGinGinCysProPheGluAspHisVal505560LysLeuValAsnGluValThrGluPheAlaLysThrCysValAlaAsp65707580GluSerAlaGluAsnCysAspLysSerLeuHisThrLeuPheGlyAsp859095LysLeuCysThrValAlaThrLeuArgGluThrTyrGlyGluMetAla100105110AspCysCysAlaLysGinGluProGluArgAsnGlirCysPheLeuGin115120125HisLysAspAspAsnProAsnLeuProArgLeuValArgProGluVal130135140AspValMetCysThrAlaPheHisAspAsnGluGluThrPheLeuLys145150155160LysTyrLeuTyrGlulieAlaArgArgHisProTyrPheTyrAlaPro165170175GluLeuLeuPhePheAlaLysArgTyrLysAlaAlaPheThrGluCys180185190CysGinAlaAlaAspLysAlaAlaCysLeuLeuProLysLeuAspGlu195200205LeuArgAspGluGlyLysAlaSerSerAlaLysGinArgLeuLysCys210215220AlaSerLeuGinLysPheGlyGluArgAlaPheLysAlaTrpAlaVal225230235240AlaArgLeuSerGinArgPheProLysAlaGluPheAlaGluValSer245250255LysLeuValThrAspLeuThrLysValHisThrGluCysCysHisGly260265270AspLeuLeuGluCysAlaAspAspArgAlaAspLeuAlaLysTyrlie275280285CysGluAsnGinAspSerlieSerSerLysLeuLysGluCysCysGlu290295300LysProLeuLeuGluLysSerHisCyslieAlaGluValGluAsnAsp305310315320GluMetProAlaAspLeuProSerLeuAlaAlaAspPheValGluSer325330335LysAspValCysLysAsnTyrAlaGluAlaLysAspValPheLeuGly340345350MetPheLeuTyrGluTyrAlaArgArgHisProAspTyrSerValVal355360365LeuLeuLeuArgLeuAlaLysThrTyrGluThrThrLeuGluLysCys370375380CysAlaAlaAlaAspProHisGluCysTyrAlaLysValPheAspGlu385390395400PheLysProLeuValGluGluProGinAsnLeulieLysGinAsnCys405410415GluLeuPheGluGinLeuGlyGluTyrLysPheGinAsnAlaLeuLeu420425430ValArgTyrThrLysLysValProGinValSerThrProThrLeuVal435440445GluValSerArgAsnLeuGlyLysValGlySerLysCysCysLysHis450455460ProGluAlaLysArgMetProCysAlaGluAspTyrLeuSerValVal465470475480LeuAsnGinLeuCysValLeuHisGluLysThrProValSerAspArg485490495ValThrLysCysCysThrGluSerLeuValAsnArgArgProCysPhe500505510SerAlaLeuGluValAspGluThrTyrValProLysGluPheAsnAla515520525GluThrPheThrPheHisAlaAsplieCysThrlxuSerGluLysGlu530535540ArgGinlieLysLysGinThrAlaLeuValGluLeuValLysHisLys545550555560ProLysAlaThrLysGluGinLeuLysAlaValMetAspAspPheAla565570575AlaPheValGluLysCysCysLysAlaAspAspLysGluThrCysPhe580585590AlaGluGluGlyLysLysLeuValAlaAlaSerGinAlaAlaLeuGly595600605LeuGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerMetSerAlaValLys610615620AlaAlaArgTyrGlyLysAspAsnValArgValTyrLysValHisLys625630635640AspGluLysThrGlyValGinThrValTyrGluMetThrValCysVal645650655LeuLeuGluGlyGlulieGluThrSerTyrThrLysAlaAspAsnSer660665670VallieValAlaThrAspSerlieLysAsnThrlieTyrlieThrAla675680685LysGinAsnProValThrProProGluLeuPheGlySerlieLeuGly690695700ThrHisPhelieGluLysTyrAsnHislieHisAlaAlaHisValAsn705710715720lieValCysHisArgTrpThrArgMetAsplieAspGlyLysProHis725730735ProHisSerPhelieArgAspSerGluGluLysArgAsnValGinVal740745750AspValValGluGlyLysGlylieAsplieLysSerSerLeuSerGly755760765LeuThrValLeuLysSerThrAsnSer'GinPheTrpGlyPheLeuArg770775780AspGluTyrThrThrLeuLysGluThrTrpAspArglieLeuSerThr785790795800AspValAspAlaThrTrpGinTrpLysGinPheSerGlyLeuGinGlu805810815ValArgSerHisValProLysPheAspAlaThrTrpAlaThrAlaArg820825830GluValThrLeuLysThrPheAlaGluAspAsnSerAlaSerValGin835840845AlaThrMetTyrLysMetAlaGluGinlieLeuAlaArgGinGinLeu850855■lieGluThrValGluTyrSerLeuProAsnLysHisTyrPheGlulie865870875880AspLeuSerTrpHisLysGlyLeuGinAsnThrGlyLysAsnAlaGlu885890895ValPheAlaProGinSerAspProAsnGlyLeulieLysCysThrVal■905910GlyArgSerSerGinLysSerLysLeu915920权利要求1、一种融合蛋白，包括尿酸氧化酶和白蛋白，所述尿酸氧化酶为非人源的尿酸氧化酶，优选为来源于微生物的尿酸氧化酶；所述白蛋白为与人血清白蛋白具有90％以上同源性的蛋白，优选为人血清白蛋白。2、根据权利要求l所述的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白还包括连接肽。3、根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白为下述1)、2)、3)或4)的蛋白质:1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质；3)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；4)将序列表中序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由3)衍生的蛋白质。4、权利要求l-3中任一所述融合蛋白的编码基因。5、根据权利要求4所述的编码基因，其特征在于所述编码基因为如下l)一6)中任一所述的基因1)其编码序列是序列表中序列1自5'末端第13-2703位脱氧核糖核苷酸；2)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码所述融合蛋白的DNA分子；3)与l)的基因具有90%以上的同源性，且编码所述融合蛋白的DNA分子；4)其编码序列是序列表中序列3自5'末端第10-2772位脱氧核糖核苷酸；5)在严格条件下可与序列表中序列3限定的DNA序列杂交且编码所述融合蛋白的DNA分子；6)与4)的基因具有90%以上的同源性，且编码所述融合蛋白的DNA分子。6、含有权利要求4或5所述基因的重组载体、转基因细胞系或重组菌。7、根据权利要求6所述的转基因细胞系，其特征在于所述出发细胞为哺乳动物、鱼、昆虫、植物或微生物细胞，优选为微生物细胞。8、根据权利要求6所述的重组菌，其特征在于所述出发菌为酿酒酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、念珠菌属(Candida)、孢园酵母属(Tarulaspora)或裂殖酵母属的菌株；优选为毕赤酵母属巴斯德菌种(Pichiapastoris)。9、扩增权利要求4或5所述基因的全长或任一片段的引物对。10、权利要求l一3所述的融合蛋白或权利要求4或5所述基因在制备治疗和/或预防高尿酸血症和痛风症药物中的应用。全文摘要本发明公开了一种融合蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的融合蛋白，包括尿酸氧化酶和白蛋白，所述尿酸氧化酶为非人源的尿酸氧化酶，优选为来源于微生物的尿酸氧化酶；所述白蛋白为与人血清白蛋白具有90％以上同源性的蛋白，优选为人血清白蛋白。本发明的融合蛋白具有以下优点1)对人体而言免疫原性极低；2)可以延长尿酸氧化酶在人体内的半衰期；3)可以重复给药，提高疾病的治疗效果；4)保持尿酸氧化酶原有的分解尿酸的活性；5)减少潜在的尿酸氧化酶使用时伴随的副作用或毒性，主要是减少抗体的产生和减少过敏反应。文档编号C12N1/15GK101402688SQ20081022701公开日2009年4月8日申请日期2008年11月18日优先权日2008年11月18日发明者戴红梅,方宏清,李招发,李树龙,陈惠鹏申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所