一种制备原生质体的方法

专利名称：一种制备原生质体的方法
技术领域：
本发明涉及一种制备原生质体的方法。
技术背景BY2细胞(Bright Yellow-2)是由烟草的叶肉细胞制备得到的一个悬浮细胞体 系。该细胞系生长速度快，可进行规模化培养，生长条件容易控制，目前被广泛的 用来进行植物细胞生物学研究，也被誉为是高等植物的"Hela"细胞。同时由于BY2 细胞没有叶绿体的自发荧光，因此可以方便的用于蛋白的亚细胞定位分析。利用荧光蛋白融合进行蛋白的亚细胞定位和动态分析对于研究蛋白的生物学 功能至关重要。目前利用稳定转化的方法转化BY2悬浮细胞系或者拟南芥植株，通 常需要几个月的时间。通过制备原生质体和PEG介导的瞬时转化来进行相关的研究 则可以大大縮短研究所需时间，提高效率。 发明内容本发明的目的是提供一种高效制备植物原生质体，并且重复性好的简便方法。 本发明所提供的制备植物原生质体的方法，包括以下步骤(1) 用0. 5-1M的甘露醇溶液处理植物细胞，然后收集细胞；(2) 用酶解液酶解步骤(1)收集的细胞；所述酶解液为水溶液，溶质为如下 终浓度的物质质量百分含量为1%-2%的纤维素酶；质量百分含量为0.2%-0.5%的 离析酶；l-3mg/ml的脂肪酸甲酯磺酸钠；l-5mg/ml的牛血清白蛋白；400-500 mM 甘露醇；l-5mMCaCl2;所述酶解液的pH为5.5-5.8。(3) 在经过步骤(2)处理的体系中加入A溶液，除去未酶解的细胞凝块后进 行离心处理，收集沉淀，即得到原生质体；所述A溶液为水溶液，溶质为如下终浓 度的物质100-200 mMNaCl， 100-150 mM CaCl2， 2-10mMKCl， 5-10 mM葡萄糖， 1-3 mM脂肪酸甲酯磺酸钠；所述A溶液的pH为5.5-5.8。所述方法还包括用所述A溶液洗涤所得到的原生质体，以除去酶解液的步骤。 所述步骤l)的甘露醇溶液中甘露醇的浓度优选为0. 8-lM。甘露醇溶液处理植 物细胞的温度为23-28X:，时间为10-20min。所述植物细胞为双子叶植物细胞；所述双子叶植物细胞优选为烟草细胞或拟南芥细胞。其中，所述烟草细胞具体可为BY2悬浮细胞，所述拟南芥细胞具体为拟南 芥悬浮细胞。所述酶解液优选为溶质为如下终浓度的物质质量百分含量为1.5%的纤维素酶；质量百分含量为0.5%的离析酶；2mg/ml的脂肪酸甲酯磺酸钠；lmg/ml的牛血清 白蛋白；500mM甘露醇；lmMCaCl2;所述酶解液的pH优选为5.7。本发明中的酶 解液可经0.45iim的滤膜过滤除菌后再使用。所述酶解的温度可为23-28'C,酶解的时间可为3-5小时。所述A溶液优选为溶质为如下终浓度的物质i54mMNaCl， 125mMCaCl2， 5mMKC1， 5mM葡萄糖，1.5mM脂肪酸甲酯磺酸钠；所述A溶液的pH优选为5.7。上述A溶液可称为W5溶液。本发明的方法适用于制备BY2悬浮细胞原生质体和拟南芥悬浮细胞原生质体。 当采用本发明的方法制备BY2悬浮细胞原生质体时，选用的细胞为培养2-3天的BY2悬浮细胞。因为细胞的生长状态对原生质体的分离效率至关重要，为保证悬浮细胞的生长状态一致，BY2悬浮细胞转接比例优选为1: 5，每周转接两次，于24'C， 130rpm避光培养。对本发明方法得到的原生质体进行PEG介导转化，具体方法如下 将分离得到的原生质体先用MaMG溶液重悬，然后用PEG溶液进行瞬时转化，用W5溶液洗涤终止转染过程，最终重悬于原生质体培养基中。MaMG溶液的组成为0.4M甘露醇，15mMMgCl2， 4mM脂肪酸甲酯磺酸钠，pH为5.7。PEG-Ca转染液的组成为质量百分含量为40。/。PEG4000 (Fluka) ， 0.2M甘露 醇，100mMCaCl2，用前配制，完全溶解PEG后至少1小时才能进行转染，PEG溶液 可以在室温保存，并于5天内使用。该溶液不可高压灭菌。为达到较好的转染效果， 推荐使用PEG4000 (Fluka， cat. No. 81240)原生质体培养基组成为4.3g/LMS基本盐(Sigma M5524) ; 0.4M蔗糖(13.7 %) ; 500mg/L脂肪酸甲酯磺酸钠；750mg/L CaCl2'2H20; 250mg/L NH4N03; pH 为5.7。本发明中所用的纤维素酶可为市售的各种纤维素酶，尤以cellulase R-10 (Yakult HonshaCo.Ltd)效果最佳，所用的离析酶可为市售的各种离析酶，尤以macerozyme R-10 (Yakult Honsha Co. Ltd)效果最佳。本方法是首先利用高渗液的甘露醇对植物细胞进行质壁分离处理，用渗透压为0.5M的酶解液进行酶解，酶解完成后，加入与酶解液等体积的低渗液A溶液，离 心收集原生质体，再次用A溶液洗涤，并使原生质体处于膨胀状态，有利于下一步 在PEG介导下外源基因的导入。该方法同样适用于拟南芥悬浮细胞原生质体的制 备。本发明制备原生质体的方法，简便、高效并且重复性好。用该方法制备的原生 质体可以满足PEG介导的瞬时转化等实验的需要。


图1为实施例制备的BY2悬浮细胞原生质体的显微镜图片。图2为实施例中PEG介导的原生质体瞬时转化后在荧光显微镜下的图片，右下角为对应的明场照片。
具体实施方式
实施例l、 BY2悬浮细胞原生质体的制备1、 收集细胞在超净台中取10ml培养2-3天的BY2悬浮细胞于离心管中。用孔 径为4(^im的滤器过滤，收集细胞。2、 质壁分离将收集的细胞加入到10mllM的甘露醇高渗溶液中，在25'C处理 10-20min，使细胞质壁分离后再次过滤收集细胞。3、 酶解将收集的细胞沉淀转移到10ml的酶解液中(初始体积10ml悬浮细胞 对应10ml酶解液)，在室温下于摇床上60rpm振荡避光酶解3小时；所述酶解液为水 溶液，含有如下终浓度的各种物质质量百分含量为1.5y。的纤维素酶cellulaseR-10 (Yakult Honsha Co. Ltd);质量百'分含量为0.5。/。的离析酶macerozyme R-10 (Yakult Honsha Co. Ltd); 2mg/ml的脂肪酸甲酯磺酸钠；lmg/ml的牛血清白蛋白；500mM甘 露醇；lmMCaCl2，所述酶解液的pH为5.7。4、 除去未酶解细胞团酶解结束后，在上述酶解液中加入10ml的W5溶液，继 续静置10-20min，然后用40pm的滤网过滤，除去未酶解的细胞团，收集滤液，酶解 好的B Y2悬浮细胞原生质体位于滤液中。5、 收集原生质体将步骤4得到的滤液转移到离心管中，室温下以1000rpm的 转速离心15min，收集沉淀(BY2悬浮细胞原生质体)，显微镜图片见图l。由图l 可知，酶解得到的原生质体数目较多，细胞状态良好(状态不好的原生质体可能破 裂呈碎片，形状非正圆，细胞内有明显的液泡化等)。6、 洗涤除酶液用10mlW5溶液洗涤得到的原生质体，冰上静置，使原生质体自然沉降，约15-30min后小心吸取上清液，尽可能吸干净上清而不触及原生质体沉 淀；再次用10mlW5溶液悬浮原生质体，冰上静置至少两个小时，使原生质体再次 自然沉降。二、 PEG介导的原生质体转化7、 去除上清，尽可能除尽上清而不触及原生质体沉淀；在原生质体沉淀中添 加MaMG溶液使BY2悬浮细胞原生质体的浓度为5xl(^个/ml (用血细胞计数板计算 原生质体浓度)。其中，MaMG溶液的组成为0.4M甘露醇，15mMMgCl2， 4 mM 脂肪酸甲酯磺酸钠，pH为5.7。8、 添力t]10-20昭的MT-GK (拟南芥生物资源中心(ABRC) ， CD3-987)的DNA (浓度^l^ig/pl)于300iil步骤7制备的原生质体悬液中，得到悬液a。9、 在悬液a中，加入与悬液a体积相等的PEG-Ca转染液(即"(300 +DNA) )， 轻柔颠倒10次使充分混匀，室温孵育30min。其中，PEG-Ca转染液的组成为质量 百分含量为40%的PEG4000(Fluka， cat. No. 81240) ， 0.2M甘露醇，100mMCaCl2。10、 在步骤9的体系中，加入相当于四倍悬液a体积的W5溶液(即"4x(300 十DNA)nl")，颠倒混匀，终止转染过程，离心1000rpmx3min;收集沉淀(转染 后的原生质体)，然后用原生质体培养基重悬(原生质体培养基的组成为4.3g/LMS 基本盐(SigmaM5524) ; 0.4M蔗糖(13.7%); 500mg/L脂肪酸甲酯磺酸钠；750mg/L CaCl2.2H2O;250mg/LNH4NO3; pH为5.7) ， 25-27。C孵育12-18小时后用荧光显微 镜观察转染效果(见图2)。图2为在荧光显微镜下拍摄的成功转化的BY2原生质 体，图中绿色荧光为绿色荧光蛋白标记的线粒体；图2右下方为对应的明场图片， 说明成功转染的原生质体细胞生长状态正常。
权利要求
1、一种制备植物原生质体的方法，包括以下步骤(1)用0.5-1M的甘露醇溶液处理植物细胞，然后收集细胞；(2)用酶解液酶解步骤(1)收集的细胞；所述酶解液为水溶液，溶质为如下终浓度的物质质量百分含量为1％-2％的纤维素酶；质量百分含量为0.2％-0.5％的离析酶；1-3mg/ml的脂肪酸甲酯磺酸钠；1-5mg/ml的牛血清白蛋白；400-500mM甘露醇；1-5mM CaCl2；所述酶解液的pH值为5.5-5.8；(3)在经过步骤(2)处理的体系中加入A溶液，除去未酶解的细胞凝块后进行离心处理，收集沉淀，即得到植物原生质体；所述A溶液为水溶液，溶质为如下终浓度的物质100-200mM NaCl，100-150mM CaCl2，2-10mM KCl，5-10mM葡萄糖，1-3mM脂肪酸甲酯磺酸钠；所述A溶液的pH值为5.5-5.8。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法还包括用所述A溶液 洗涤步骤(3)得到的原生质体的步骤。
3、 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步骤l)的甘露醇溶液 中甘露醇的浓度为0. 8-1M。
4、 根据权利要求l-3中任一所述的方法，其特征在于所述步骤l)中处理植物 细胞的温度为23-28'C,时间为10-20min。
5、 根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述植物细胞为双子 叶植物细胞；所述双子叶植物细胞优选为烟草细胞或拟南芥细胞。
6、 根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述烟草细胞为BY2 悬浮细胞，所述拟南芥细胞为拟南芥悬浮细胞。
7、 根据权利要求l-6中任一所述的方法，其特征在于所述酶解液中的溶质为 如下终浓度的物质质量百分含量为1.5%的纤维素酶；质量百分含量为0.5%的离析酶；2mg/ml的脂肪酸甲酯磺酸钠；lmg/ml的牛血清白蛋白；500mM甘露醇；1 mM CaCl2;所述酶解液的pH为5.7。
8、 根据权利要求l-7中任一所述的方法，其特征在于所述步骤2)中所述酶解 的温度为23-28'C，酶解的时间为3-5小时。
9、 根据权利要求l-8中任一所述的方法，其特征在于所述A溶液中的溶质为如 下终浓度的物质154mMNaCl， 125mMCaCl2， 5mMKCl， 5 mM葡萄糖，1.5 mM 脂肪酸甲酯磺酸钠；所述A溶液的pH值为5.7。
10、根据权利要求1-9中任一所述的方法，其特征在于所述植物原生质体为 BY2悬浮细胞原生质体或拟南芥悬浮细胞原生质体。
全文摘要
本发明公开了一种进行高效制备植物悬浮细胞原生质体的方法。该方法包括以下步骤(1)用0.5-1m的甘露醇溶液处理植物细胞，然后收集细胞；(2)用酶解液酶解步骤(1)收集的细胞；(3)在经过步骤(2)处理的体系中加入A溶液，除去未酶解的细胞凝块后进行离心处理，收集沉淀，即得到原生质体；所述A溶液为水溶液，溶质为如下终浓度的物质100-200mm NaCl，100-150mm CaCl₂，2-10mm KCl，5-10mm葡萄糖，1-3mm脂肪酸甲酯磺酸钠；所述A溶液的pH为5.5-5.8。该方法主要适用于BY2悬浮细胞和拟南芥悬浮细胞原生质体的制备。用本发明的方法分离的悬浮细胞原生质体得率高，细胞生长状态好，结合PEG介导的瞬时转化可满足对目的基因进行细胞学定位，免疫共沉淀，Western杂交等多种研究目的。
文档编号C12N5/04GK101402938SQ20081022661
公开日2009年4月8日 申请日期2008年11月17日 优先权日2008年11月17日
发明者林金星, 锋 王 申请人:中国科学院植物研究所