专利名称：：抗旱相关转录因子及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及抗旱相关转录因子及其编码基因与应用。
背景技术：
：由于气候逐渐变暖，干旱、半干旱地区逐渐扩大，面对水资源逐渐匮乏的压力，改良树木的抗旱能力，提高树木水分利用效率，对于保障我国林业经济发展具有重要意义。抗旱基因的转录调控对于树木的抗旱是非常重要的，树木的抗旱性是受多基因控制的复杂性状，DREB(DehydrationResponsiveElementBinding)转录因子可以调控多个与干旱、高盐耐性相关功能基因的表达。DREB转录因子与顺式作用元件DRE(DehydrationResponsiveElement)结合调控抗旱相关基因的表达，保护自身免受伤害。DREB转录因子属AP2/EREBP类家族转录因子。AP2/EREBP类家族转录因子存在多种植物中，在植物中AP2/EREBP功能保守域是DREB类转录因子的特异性结构，调控植物对干旱、高盐胁迫的分子应答，参与调控植物的干旱、高盐等信号途径。DREB类某些基因能接受环境胁迫信号并启动逆境应答基因，使得植物耐逆性提高。桃树作为一种重要的经济作物，改善其耐逆性表现特征一直是桃树育种研究的重要目的之一。
发明内容本发明的目的是提供一种抗旱相关转录因子及其编码基因与应用。本发明所提供抗旱相关转录因子，命名为PpDREBl，来源于桃树(Pru皿spersica)，是如下a)或b)的蛋白a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)在序列表中序列2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与抗旱相关的由a)衍生的转录因子。为了使a)的PpDREBl蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1.标签的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>上述b)中的PpDREBl蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述b)中的PpDREBl蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表l所示的标签的编码序列得到。所述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。所述蛋白的编码基因，是如下1)至3)中任一所述的基因；1)其核苷酸序列是序列表中序列1;2)在严格条件下与1)限定的DNA片段杂交且编码与抗旱相关的转录因子的DNA分子；3)与1)或2)的基因具有90%以上的同源性，且编码与抗旱相关的转录因子的DNA分子。所述步骤3)中的基因，与1)的基因最好有95%以上的同源性。上述严格条件可为在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在68°C下杂交，然后用2XSSC，0.1%SDS和1XSSC，0.1%SDS各洗膜一次。扩增PpDREBl基因全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。含有上述PpDREBl基因的重组载体、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。可用现有的植物表达载体构建含有PpDREBl基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。携带有本发明的PpDREBl基因的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。使用PpDREBl基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiquitin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。本发明的另一个目的是提供一种培育抗旱植物的方法。4本发明所提供的培育抗旱植物的方法，是将所述的PpDREBl基因导入植物细胞中，得到抗旱能力提高的转基因植物。本发明的PpDREBl转录因子基因编码的蛋白含有一个高度保守的AP2/EREBP结构域、一个核定位信号和一个激活域，属于AP2/EREBP类家族转录因子的新成员。PpDREBl在桃树根、茎和叶中都表达，同时PpDREBl表达被ABA和干旱诱导，PpDREBlmRNA累积速度较快，高盐和低温也能诱导PpDREBl高效表达。PpDREBl蛋白具有明显的转录激活能力，用PpDREBl基因培育的拟南芥抗旱性明显增强。图1为SDS-PAGE分析结果。图2为PpDREBl基因组织特异性表达。图3为PpDREBl基因受胁迫条件诱导表达。图4为pGEX-4Tl-PpDREBl表达载体的构建示意图。图5为Y印GAP-PpDREBl表达载体的构建示意图。图6为pCAMBIA1304-PpDREBl表达载体的构建示意图。图7为转pCAMBIA1304-PpDREBl拟南芥和转pCAMBIA1304拟南芥根系比较。具体实施例方式实施例1、桃树PpDREB1基因的克隆用Promega尺嫩§61^5总RNA提取试剂盒提取生长15天的桃树幼苗的总RNA，用Stratagene试剂盒构建cDNA文库。采用酵母单杂交系统筛选cDNA文库。取cDNA转录激活结构域(AD)融合表达文库的质粒20iig进行转化后，涂布到含15mmol/L3-AT的SD/附8-/^￡1-/1611-选择性培养基上，3(TC培养3d。选取生长较旺盛的酵母菌落，在含30mmo1/L341的50/附8-川1^-/161!-选择性培养基上培养，对阳性克隆进行P-半乳糖甘酶活性检领"得到8个阳性克隆。提取阳性克隆质粒DNA，用限制内切酶Sal1、NotI进行双酶切，连到T载体构建重组载体T，进行测序。测序结果中有1个cDNA克隆编码的蛋白含有AP2/EREBP结构域，且具有完整的编码框，命名为PpDREBl。PpDREBl基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示，长为814bp，含有522bp的开放阅读框架，编码的230个氨基酸组成的多肽，其氨基酸序列如序列表中的序列2。利用带有EcoRI和SalI酶切位点的引物PPF(5'-AACAGAATTCTGGACATGTTCTCCGCTC-3')和PPR(5'-ACCAGTCGACGATAGAGAAACTCCATAA-3')，以重组载体T为模板，进行PCR扩增，获得片段A，片段A通过琼脂糖凝胶电泳回收，用EcoRI和SalI双酶切回收的片段A，然后将EcoRI和SalI双酶切过的片段A连入酶切的pGEX_4T_l载体，构建融合GST基因的原核表达载体pGEX-4T1-PpDREB1。pGEX-4Tl-PpDREBl表达载体的构建过程如图4所示。将pGEX-4Tl-PpDREBl和pGEX_4T_l分别转入大肠杆菌XL1-Blue，获得重组菌PpDREBl和重组菌4T-1，提取IPTG诱导下重组菌PpDREBl和重组菌4T-1的总蛋白，进行SDS-PAGE分析。SDS-PAGE检测结果如图l，表明PpDREBl基因在大肠杆菌中表达。图l中，"l"代表为诱导的重组菌4T-1，"2"为未诱导的重组菌PpDREBl，"3-6"为诱导的重组菌PpDREBl，"M"为Markero实施例2、PpDREBl基因编码转录因子提取将在25t:恒温培养箱中培养15天的桃树幼苗不同组织的总RNA，进行Northorn杂交。将在25。C恒温培养箱中培养15天的桃树幼苗，分别置于干旱条件、高盐溶液、ABA溶液中进行干旱、低温、高盐、ABA处理。胁迫处理后将材料放入液氮速冻。通过Promga公司RNA提取试剂盒提取不同胁迫处理下的桃树幼苗的总RNA，进行Northorn杂交。Northorn杂交结果如图2和3所示，PpDREBl基因在桃树植株中的表达呈现了组织特异性的特点；PpDREBl在根中的表达量最高，在茎中的表达量没有根中的高，而在叶中的表达量最低。PpDREBl的表达受胁迫条件的诱导，干旱和高盐能诱导PpDREBl的高效表达；在ABA处理时，PpDREBl基因表达量的增加；低温处理时，PpDREBl的诱导表达特别缓慢，与干旱条件下PpDREBl的表达相比，表达量增加的比较少。图2中，"L"为叶，"R"为根，"S"为茎。上述结果说明PpDREBl可能参与了干旱和高盐胁迫信号转导途径。EcoRI和SalI双酶切片段A，回收后连接到同样双酶切的Y印GAP载体(MATCHMAKERTranscription-activationSystem,Clontech公司)(没有GAL4domain)酵母表达载体上，构建重组载体Y印GAP-PpDREBl，构建过程如图5。重组载体Y印GAP-PpDREBl转入大肠杆菌XL1-Blue构建得到重组菌X-PpDREBl。将含有4个DRE元件的片段5，-GAATTC-DRE-DRE-DRE-DRE-GTCGAC_3，(DRE的核心序列TACCGACAT)分别构建到pHis-1载体(MATCHMAKEROne-HybridSystem，Clontech公司)的PminHIS3启动子和pLacZi载体(MATCHMAKEROne-HybridSystem，Clontech公司)PCTCI启动子上游，分别得到重组载体pHis-l-DRE和pLacZi-DRE，用XhoI和NcoI内切酶分别将pHis-l-DRE和pLacZi-DRE载体切成线状。先将线状pHis-l-DRE载体转化到酵母细胞(YM4271株系，MATCHMAKEROne-HybridSystem,Clontech公司)内，获得能在SD/His—培养基上正常生长的酵母转化子(Yeasttransformant)，接着以这种酵母转化子为寄主细胞，继续转化含有4个重复DRE元件的pLacZi-DRE载体，这样在同时缺乏组氨酸和尿嘧啶的SD/His7Ura—培养基上，选择获得含有pHis-l-DRE和pLacZi-DRE的双报告基因His3和LacZ的酵母菌，获得带有DRE-box且含有双报告基因His3和LacZ的酵母菌预4271。将4个DRE元件的核心序列CCGAC突变成TTTTT(MDRE)，即5'-GAATTC-MDRE-MDRE-MDRE-MDRE-GTCGAC-3'，按正常的双重酵母报道子构建方法，再构建带突变的DRE-box的双报告基因His3和LacZ的酵母菌YM4271。重组质粒Y印GAP-PpDREBl和载体Y印GAP，用热激法分别转入带有DRE-box且含有双报告基因His3和LacZ的酵母菌预4271和带突变的DRE-box的双报告基因His3和LacZ的酵母菌预4271中，在SD/His—Ura—Leu—培养基上筛选出转化子，挑取阳性克隆，从酵母中提取质粒DNA进行PCR检测。PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果表明，含有一条特异性的片段，且与DRE-box的大小一致，说明已经将Y印GAP-PpDREBl转入带有DRE-box且含有双报告基因His3和LacZ的酵母菌预4271和带突变的DRE-box的双报告基因His3和LacZ的酵母菌预4271中，然后对转化子进行3-AT抗性检测。所有携带Y印GAP-PpDREBl载体的酵母菌株在0mmol/L3-AT的SD/His—Ura—Leu—选择培养基上都能很好地生长，而且携带Y印GAP-PpDREBl能生长于30mmol/L3-AT的SD/His—Ura—Leu—培养基上，且生长状态较好。但是，携带Y印GAP-PpDER1/突变的DRE-box的酵母及携带载体Y印GAP的酵母没有表现出3-AT抗性。实验结果表明，PpDREBl基因编码蛋白能够特异地识别结合DRE-box，并激活报告基因HIS3的表达，但不能识别突变的mDREbox。表1为酵母中P-半乳糖苷酶活性的检测结果。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>上述实验结果说明PpDREBl基因编码一个转录因子。实施例3、利用PpDREBl基因培育抗旱植物用？1~011168￡11^^§61^5总RNA提取试剂盒提取生长15天的桃树幼苗的总RNA，反转录成cDNA，用引物1(5，-AACAAGATCTATGGACATGTTCTCCGCT-3'禾P2(5'-ACAAACTAGTCATCAGCTTCAGTTTCCA-3'，通过PCR扩增PpDREBl的cDNA。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳回收后用BglII和SPeI双酶切，与同样双酶切的pCAMBIA1304载体连接，PpDREBl的cDNA定向插入pCAMBIA1304表达载体的CaMV35S启动子下游，得到重组双元表达载体pCAMBIA1304-PpDREBl，图6为构建示意图。将pCAMBIA1304-PpDREBl重组质粒分别导入农杆菌GV3101中，获得重组菌，重组菌在YEB固体培养基(含50iig/mLRif，50yg/mLKna)上筛选，28。C培养2天，挑取克隆，从农杆菌中提取质粒DNA进行PCR检测，农杆菌中的质粒DNA扩增与pGEM-PpDREBl质粒DNA的扩增结果一致的重组菌为重组菌GV3101-PpDREBl。将载体pCAMBIA1304导入农杆菌GV3101获得重组菌GV3101-1304。重组菌GV3101-PpDREBl和重组菌GV3101-1304用来转化拟南芥。将拟南芥种子放于4°C黑暗条件下春化3d，然后播种于MS固体培养基上，在22/1『C、16/8h光周期下培养10d后移栽，同样的条件下继续培养。拟南芥植株刚开花，且只有少量种夹时用于农杆菌转化。采用Floraldip法转化野生型拟南芥植株，将浸染过的拟南芥植株盖上塑料膜以保持湿度，在暗处放置过夜，然后移入温室继续培养，转化后植株正常地开花生长，23周后种夹开始变黄，然后收集种子进行筛选。将TO代种子平铺于MS选择培养基(含25iig/mL潮霉素)上，4°C黑暗条件下春化3天，然后在22/18°C、16/8小时光周期条件下培养10天。转pCAMBIA1304-PpDREBl拟南芥苗大、根长、根毛、侧根比转pCAMBIA1304拟南芥明显增加(图7)。图7中，"l和2"为转pCAMBIA1304-PpDREBl拟南芥，"3-6"为转pCAMBIA1304拟南芥。转pCAMBIA1304-PpDREBl拟南芥和转pCAMBIA1304拟南芥Tl代种子在抗性培养基上筛选出转基因苗，4t:冰箱放置3天后置于正常培养间光照培养，10天后将抗性苗移至蛭石和草炭土的营养基质中，常规培养，两个半月后收种为T2代种子。将用上述方法筛选得到的T2代转基因植株的种子培育成小苗，进行耐旱试验。共得到了30个株系的转pCAMBIA1304-PpDREBl拟南芥，25株转pCAMBIA1304拟南芥。将30个株系的转pCAMBIA1304-PpDREBl拟南芥和25株转pCAMBIA1304拟南芥，每个株系各7株，同时对称地移栽到同一小钵的两侧。每个转基因株系设3个重复。常规管理，浇水3次后停止浇水，三周后复水，一周后观察并拍照。实验结果显示，转pCAMBIA1304拟南芥全部枯死，而转pCAMBIA1304-PpDREBl拟南芥的30个株系中，有10个株系的转基因植株存活，且大部分叶片保持绿色，植株生长良好。序列表〈110〉国家林业局科技发展中心中国农业大学中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所〈120〉抗旱相关转录因子及其编码基因与应用〈130〉CGGNARW81874〈160>2〈210>1〈211>814〈212>DNA〈213>Primuspersica〈400>1tctccgctcagctttctgactcccccgaccagcctgagtcgagttctttc60120180240300360420■5406006603tgg3C3tgttccgacgccagcgtcaccaccctgccggcatcttcctccgacgaaaacgtcatattggcgtcgagccggccgaagaagcgcgctgggaggagggttttcaaggagacgaggcacccggtttacaggggcgtgaggag肌gg肌c肌c肌c肌gtgggtatgtgagttgag3g肌CCC肌Caacaagaagtcaaggatttggcttggaacgtatccgacggctgagatggctgctcgtgcccatgacgtggcggcattggcgttcagagggaagcttgcctgcataaactttgctgactccgcatggcggctgcccttgccggcttccatggacaccatggatattcgaagggcagccgctgaggccgccgaagggttcaggcctgcggagttcggtggattatccagcggcagcagtgatg3g肌gg3g3tg肌ttt肌gCgtgg3tatgg肌3肌肌C3gcagcttgtgcttgttttatttggatgaggaggaaatgtttgatatgccaaggttgattgataacatggctcaagggcttcttctttctccacctcaatgctcagctggctacttgaattgggatgacgtggaaactgaagctgatgccaaattatggagtttctctatctgattgatgttttttttagtcaatctgtat8tcatttgtgtgtttttcattggatttatttgttcatgtgtgagttgctgataaagattgt780aggtgtgttttttccttgttcgatcttta^〗14〈210>2〈211>230〈212>PRT〈213〉Prunuspersica〈400>2MetAspMetPheSerAlaGinLeuSerAspSerProAspGinProGlu151015SerSerSerPheSerAspAlaSerValThrThrLeuProAlaSerSer202530SerAspGluAsnVallieLeuAlaSerSerArgProLysLysArgAla354045GlyArgArgValPheLysGluThrArgHisProValTyrArgGlyVal505560ArgArgArgAsnAsnAsnLysTrpValCysGluLeuArgGluProAsn65707580AsnLysLysSerArglieTrpLeuGlyThrTyrProThrAlaGluMet859095AlaAlaArgAlaHisAspValAlaAlaLeuAlaPheArgGlyLysLeu100105110AlaCyslieAsnPheAlaAspSerAlaTrpArgLeuProLeuProAla115120125SerMetAspThrMetAsplieArgArgAlaAlaAlaGluAlaAlaGlu130135140GlyPheArgProAlaGluPheGlyGlyLeuSerSerGlySerSerAsp145150155160GluLysGluMetAsnLeuSerValAspMetGluLysAsnSerSerLeu165170175CysLeuPheTyrLeuAspGluGluGluMetPheAspMetProArgLeu180185190lieAspAsnMetAlaGinGlyLeuLeuLeuSerProProGinCysSer195200205AlaGlyTyrLeuAsnTrpAspAspValGluThrGluAlaAspAlaLys210215220LeuTrpSerPheSerlie9225230权利要求一种蛋白质，是如下a)或b)的蛋白a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)在序列表中序列2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与抗旱相关的由a)衍生的转录因子。2.权利要求l所述蛋白的编码基因。3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下1)或2)或3)的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列1;2)在严格条件下与1)限定的DNA片段杂交且编码与抗旱相关的转录因子的DNA分子；3)与l)或2)的基因具有90X以上的同源性，且编码与抗旱相关的转录因子的DNA分子。4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体。5.含有权利要求2或3所述基因的转基因细胞系或重组菌。6.—种培育抗旱植物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入植物细胞中，得到抗旱的转基因植物。7.扩增权利要求2或3所述基因的全长及其任意片段的引物对。8.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述基因、权利要求4所述重组表达载体、权利要求5所述转基因细胞系或重组菌在培育抗旱植物中的应用。全文摘要本发明公开了一种抗旱相关转录因子及其编码基因与应用。该转录因子是如下a)或b)的蛋白a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)在序列表中序列2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与抗旱相关的由a)衍生的转录因子。所述蛋白的编码基因是如下1)或2)或3)的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列1；2)在严格条件下与1)限定的DNA片段杂交且编码与抗旱相关的转录因子的DNA分子；3)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性，且编码与抗旱相关的转录因子的DNA分子。用所述基因培育的拟南芥抗旱性明显增强。文档编号C12N1/21GK101735312SQ20081022606公开日2010年6月16日申请日期2008年11月5日优先权日2008年11月5日发明者侯玉霞,张永安,王琦,王青华,龚玉梅申请人:国家林业局科技发展中心;中国农业大学;中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所