专利名称：黄伞多糖及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种黄伞多糖，其是从黄伞中提取得到的多糖，该多糖的纯化产品能够提高人体免疫力，本发明还涉及该多糖的制备方法。
背景技术：
黄伞学名Pholiota adiposa(Fr.)Qu él.在分类学上属真菌门Eumycota，担子菌亚门Basidiomycotina，层菌纲Hymenomycetes，伞菌目Agaricales，球盖菇科Strophariaceae，环锈伞属GenusPholipta，是一种食药两用菌。《中国大型真菌》(卯晓岚，2000)(1)记载黄伞“子实体表面有一层粘质，经盐水、温水、碱溶液或有机溶剂提取可得多糖体，此多糖体对小白鼠肉瘤180及艾氏腹水癌的抑制率达80％～90％”。苏延友(2004)(2)运用正交试验法初步对黄伞多糖提取工艺及有关水浸提多糖体外诱导巨噬细胞作用进行了研究，其研究结果表明，黄伞多糖具有免疫增强剂的作用，能有效地激活巨噬细胞，通过增强细胞因子分泌、增强NO的产生水平、增强其吞噬功能及体外杀伤活性等多种途经来调节免疫系统。王谦(2006)(3)等通过小鼠实验得知，黄伞发酵提取物具有辅助调节甘油三酯的作用；目前对黄伞的野生驯化、生物学特性及人工栽培技术、液体培养等方面的技术也取得一定进展(4)(5)。但黄伞子实体生产周期长、产量不高、产品质量不稳定，黄伞多糖提取得率低，纯度不高，目前对黄伞提取多糖的纯化及其高级结构的研究国内外均未见报道，纯化后黄伞多糖的生理活性也未见有报道。
本发明通过对黄伞液体培养菌丝体进行多糖提取与纯化，通过改进提取工艺，及多级纯化处理，获得高纯度多糖。
发明内容
本发明的目的是提供一种黄伞多糖，其能提高人体免疫能力。
本发明的另一个目的在于提供制备黄伞多糖的方法。
本发明黄伞多糖是以黄伞(菌丝体或子实体)为原料，通过提取纯化获得，其是一种由葡萄糖、果糖、甘露糖以及半乳糖四种单糖组成的一种杂多糖。
本发明黄伞多糖通过如下方法制备获得 1.黄伞多糖的提取 ①材料预处理将黄伞(菌丝体或子实体)冻干，粉碎至120～160目，优选粉碎至140目；料水比1∶20～30、超声波处理5～15min，功率600～1000W，优选处理功率600W，处理时间10min。
②浸提回流提取1～4小时，提取温度60～90℃，得浸提液； ③醇析向浸提液中加入3～5倍量的无水乙醇，醇析8～16小时。
④浓缩醇析后3500～5000rpm离心15～25min弃上清液，得沉淀物，依次用无水乙醇(1次)、丙酮(2次)洗涤沉淀。
⑤真空冷冻干燥得黄伞粗多糖。
2.黄伞多糖的纯化 黄伞多糖纯化是将黄伞多糖中的游离蛋白及色素去除的过程，黄伞多糖中游离蛋白的去除采用等电点结合seveg法，首先将黄伞粗多糖制成1～5％的多糖溶液，滴加适量的浓氨水使其pH值达到8～10，静置10～15min后在4500～5000rpm下离心10～15min除去蛋白沉淀。然后将多糖溶液稀释1～3倍，再加入等体积的seveg试剂(正丁醇∶氯仿＝1∶4)剧烈振荡25-30min后，4500-5000rpm下离心10～15min，取上清液重复seveg除蛋白操作一次。将多糖溶液浓缩后冷冻干燥。
取多糖溶于蒸馏后经由D152及D301T串联而组成的离子交换柱进一步室温20～28℃下纯化，洗脱液为蒸馏水，纯化后，再经Sephadex G-100凝胶柱层析纯化(室温20～28℃)，以蒸馏水作为洗脱液，即可得到高纯度多糖产品。
以上提取纯化过程中通过冷冻干燥可以除去浓缩过程中不能完全去除的多糖溶液中的有机溶剂，从而减少有机溶剂去后续步骤中柱子的破坏，同时，可以计算上步除蛋白过程中，多糖的得率及纯度。
按照上述方法得到的多糖产品，采用苯酚硫酸法测定其多糖含量可达93.67％，采用Folin-酚法测定蛋白未检出。
本发明还提供了一种黄伞菌丝体液体培养方法，通过该方法可以提高菌丝体的生长量，从而提高生产效率，降低成本。
本发明提供的黄伞菌丝体液体培养方法如下 ①液体培养基配方葡萄糖15～25g/L、酵母浸粉6～10g/L、维生素B1 200～400μg/L、Mg2SO4 0.3～0.5g/L、KH2PO4 0.8～1.2g/L、K2HPO4 0.8～1.2g/L，水余量，高压灭菌备用； ②液体菌种培养按无菌操作方法，取母种菌丝体，按接种量1～10％(V/V)，转接灭菌后的液体培养基中，培养温度在24～26℃；摇床转速120r/min～140r/min条件下，培养时间10～14天； ③发酵培养将种子培养菌种，无菌操作方法，按接种量5～10％(V/V)接种至发酵罐中，发酵培养基为葡萄糖20～40g/L，玉米浆15～25g/L，磷酸二氢钾1.5～2.5g/L，pH值6.5～7.0，控制温度24～26℃、搅拌转速150～180r/min，通气量为0.8～2(V/V·min)，发酵培养7～10天。
其中步骤①优选液体培养基配方为葡萄糖20g/L、酵母浸粉8g/L、维生素B1 300μg/L、Mg2SO4 0.4g/L、KH2PO4 1g/L、K2HPO41g/L，pH 5.5-7，余量为水。
其中步骤②优选按无菌操作方法，用直径0.5cm打孔器取母种，取接种量为为3块的固体菌种，转接灭菌后的液体培养基中(接种量约为3％)。培养温度在25℃；摇床转速120r/min～140r/min条件下，培养时间12天。
其中步骤③优选发酵培养将种子培养菌种，无菌操作方法接种至发酵罐中，接种量为8％(V/V)，发酵培养基为葡萄糖30g/L，玉米浆20g/L，磷酸二氢钾2g/L，pH值6.5～7.0，控制温度为25℃，搅拌器转速为150～180r/min，通气量为0.8～2(V/V·min)，发酵培养7～10天。
在本申请中，术语“通气量”是指每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比(V/V·min)。如内装3m3培养液的发酵罐，若每分钟通入1.5m3的无菌空气，则通气比为3∶1.5＝1∶0.5，简称通气量为0.5(V/V·min)。
本申请中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指溶液100ml中含有溶质若干克；液体之间的百分比，系指在20℃时容量的比例。
本发明为人类提供一种新型保健食品--黄伞多糖，其能提高人体免疫力，具有防癌、抗癌，抗衰老等作用。因此，可将本发明黄伞多糖可发成具有治疗作用的药物，或者具有保健作用的功能食品。此外，本发明黄伞还可与灵芝多糖、云芝多糖等配合使用。本发明克服了黄伞多糖提取率低，含量低(一般粗多糖含量在50％以下)，多糖组份复杂等难题，提供一种黄伞多糖的提取纯化方法，多糖得率达60％以上，多糖的纯度高达到93.67％，此外结合菌丝体液体培养技术，可提高菌丝体生长量10％以上，从而降低生产成本，提高生产效率，特别是大大提高了多糖产品的生物活性作用，例如抗癌，搞肿瘤，清除体内自由基等。
图1为多糖PP-HMW的高压液相色谱图； 图2为黄伞多糖PP-HMW的紫外线扫描图。
具体实施例方式 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1黄伞菌丝体液体培养 ①液体培养基配方葡萄糖20g/L、酵母浸粉8g/L、维生素B1300μg/L、Mg2SO4 0.4g/L、KH2PO4 1g/L、K2HPO4 1g/L，pH 6，高温灭菌备用。
②种子培养按无菌操作方法，用直径0.5cm打孔器取母种，取接种量为3块的固体菌种，转接灭菌后的液体培养基中(接种量约3％)。培养温度在25℃；摇床转速120r/min～140r/min条件下，培养时间12天。
③发酵培养将种子培养菌种，无菌操作方法接种至发酵罐中，接种量为8％(V/V)，发酵培养基为葡萄糖30g/L，玉米浆20g/L，磷酸二氢钾2g/L，pH值6.5～7.0，控制温度为25℃，搅拌器转速为150～180r/min，通气量为0.8(V/V·min)。发酵结束后，每升溶液中的黄伞菌丝体干重达到13.6g。
实施例2黄伞菌丝体液体培养 ①液体培养基配方葡萄糖15g/L、酵母浸粉10g/L、维生素B1200μg/L、Mg2SO4 0.5g/L、KH2PO4 0.8g/L、K2HPO4 1.2g/L，pH 6，高温灭菌备用。
②种子培养按无菌操作方法，用直径0.5cm打孔器取母种，取接种量为5块的固体菌种，转接灭菌后的液体培养基中(接种量约6％)。培养温度在25℃；摇床转速120r/min～140r/min条件下，培养时间10天。
③发酵培养将种子培养菌种，无菌操作方法接种至发酵罐中，接种量为10％(V/V)，发酵培养基为葡萄糖40g/L，玉米浆25g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，pH值6.5，控制温度为25℃，搅拌器转速为150～180r/min，通气量为1.5(V/V·min)。发酵结束后，每升溶液中的黄伞菌丝体干重达到14.5g。
实施例3黄伞菌丝体液体培养 ①液体培养基配方葡萄糖25g/L、酵母浸粉6g/L、维生素B1400μg/L、Mg2SO4 0.3g/L、KH2PO4 0.1.2g/L、K2HPO4 0.8g/L，pH 6，高温灭菌备用。
②种子培养按无菌操作方法，用直径0.5cm打孔器取母种，取接种量为2块的固体菌种，转接灭菌后的液体培养基中(接种量约2％)。培养温度在25℃；摇床转速120r/min～140r/min条件下，培养时间16天。
③发酵培养将种子培养菌种，无菌操作方法接种至发酵罐中，接种量为5％(V/V)，发酵培养基为葡萄糖30g/L，玉米浆15g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，pH值6.5，控制温度为25℃，搅拌器转速为150～180r/min，通气量为2(V/V·min)。发酵结束后，每升溶液中的黄伞菌丝体干重达到13.1g。
实施例4黄伞人工栽培 采用代料熟化栽培栽培方式，秋季栽培应在春季1～2月份制栽培袋，3～5月份出菇。秋季在8～9月份制栽培袋，10～12月份出菇。秋季栽培较春季栽培病虫害少，出菇质量较高。黄伞栽培菇房可选用塑料大棚或室内层架出菇方式；也可以工厂化栽培模式，可在控温条件下进行周年多批次的人工栽培。
黄伞的袋料栽培有6个操作程序培养基质拌料→装袋灭菌→无菌接种→发菌培养→出菇管理→采收加工。
栽培原料主料木屑、棉籽壳，辅料麦麸、石膏粉。人工栽培培养基配方如下 ①棉子壳88％，麸皮10％，石膏1％，过磷酸钙1％。
②棉子壳68％，杂木屑20％，麸皮10％，石膏1％，过磷酸钙1％。
③棉子壳78％，玉米芯粉10％，麸皮10％，石膏1％，过磷酸钙1％。
培养基配制棉子壳在使用前要按1∶1加水堆置8～12h，这样有利于棉籽壳吸水和部分营养成份的分解，从而确保黄伞的高产。将上述堆置好的棉籽壳按各配方加入辅料并拌匀，再加入适量水将料培养料含水量调至60％～65％，pH自然。
装袋采用17cm×33cm×0.04cm的聚乙烯或聚丙烯塑料袋，每袋装干料重约0.45kg～0.55kg。料要适度压紧，然后将袋口用套环封好，套环通气好，可使发菌时间缩短5～10天。
灭菌高压或常压灭菌。常压灭菌要求将培养料袋放置于灭菌锅内，加热至100℃，保持10小时，停火焖5小时～6小时，然后将袋取出冷却接种。高压灭菌，用大容量高压灭菌锅，料袋亦分层放置，保持压力1.2kg/cm2灭菌2h，然后自然冷却至压力为零时，开锅盖将料袋取出冷却。
接种按无菌操作程序进行。
菌丝培养接种后将料袋直接码放于干净培养室的培养架，培养室温度应保持在23℃～25℃。发菌时间约30～35天左右。当菌袋完全成黄褐色时，即可移入出菇室，进行出菇管理。
出菇管理菌袋移入出菇室后，脱掉套环，将袋口旋拧两圈，使菌袋尽量减少与空气接触面积，有利于菌袋保持水分，防止表面菌皮干燥板结。进入出菇室后6～10天，原基开始分化，此时可将菌袋完全打开。出菇管理主要是湿度的控制，具体措施1.增加空气相对湿度依据菌袋不同时期对水分的需要，主要可分为三个不同阶段进行管理。第一阶段原基分化前，调整出菇室内空气相对湿度80％～90％之间，以刺激原基分化，但如果湿度过大，容易造成绿霉感染；第二阶段小菇蕾生长期，此时空气相对湿度不易过大，否则会导致小菇腐烂，降低产量，应将湿度控制在70％～85％之间；第三阶段黄伞快速生长期，调整空气相对湿度在85％～95％之间，以满足黄伞快速生长对水分的需要，同时有利于提高黄伞的产量和品质。加湿可采用加湿器喷雾和地面浇水相结合的方式。2.温度黄伞是一种中低温型食用菌，适合于春秋出菇，黄伞子实体生长发育阶段菇房内温度应维持在15～20℃，因此在不同栽培地区要计算好时间，保证出菇温度，如有条件也可在出菇室增加降温升温设备，不过会增加成本。3.适当通风换气每天通风1～2次，每次1～2小时左右，要结合天气情况进行，天热早、晚通风，天寒冷，采取中午气温高时通风，以不断补充新鲜空气，排除CO2。4.保持出菇室内一定的光照度，黄伞不能在完全黑暗的条件下正常发育，出菇室应有300～800勒克斯左右的照度，平时以正常人视力能看清报纸上的小字即可以了。5.保持出菇室内清洁，定期清扫出菇室内卫生，以减少菌棒污染率。
采收黄伞在严格的出菇管理下，从原基出现开始约经过7～10天即可采摘。采摘标准为菌柄不再生长，菌盖有平展趋势，此时应及时采摘，否则开伞降低商品价值。采摘后搔菌，将袋口拧紧，进入菌丝恢复期，降低出菇室空气相对湿度，控制在60％～80％。待菌丝恢复后重复上述操作进行出菇，一般可采3～4潮菇，生物学转化率达100％～120％。
实施例5黄伞多糖提取与纯化 1.黄伞多糖提取 ①材料预处理将实施例1制得的菌丝体冻干，粉碎至140目，料水比1∶30、超声波功率600W，处理10min； ②浸提将预处理后的菌丝体放入回流瓶中，浸提时提取时间3小时、提取温度75℃，得多糖浸提液； ③醇析向多糖浸提液中加入3.5倍量的无水乙醇，醇析12小时； ④浓缩醇析后4500rpm离心10min弃上清液，得沉淀物，依次用无水乙醇(1次)、丙酮(2次)洗涤沉淀。
⑤真空冷冻干燥得菌丝体粗多糖。
按上述提取方法，黄伞粗多糖提取率达到23.41％，多糖含量达到55.69％。
2.黄伞多糖纯化 将上述制得的多糖用蒸馏水制备成3％的多糖溶液，滴加适量的浓氨水使其pH值达到10，静置10min后在4500rpm下离心10min除去蛋白沉淀。然后将多糖溶液稀释一倍，再加入等体积的seveg试剂(正丁醇∶氯仿＝1∶4)剧烈振荡30min后，4500rpm下离心10min，取上清液重复操作一次。将多糖溶液浓缩后冷冻干燥。
取多糖溶于适量蒸馏水后经经由D152及D301T串联而组成的离子交换柱进一步室温20～28℃下纯化，洗脱液为蒸馏水，纯化后，再经Sephadex G-100凝胶柱层析纯化(室温20～28℃)，以蒸馏水作为洗脱液，即可得到高纯度多糖产品。经检测多糖含量达93.67％。
3、多糖纯度鉴定 (1)采用高压液相色谱法(HPLC)对上述方法获得的纯多糖样品进行鉴定，结果如图1.所示。高压液相色谱图为单一对称峰，说明所得黄伞多糖组分为均一组分。
(2)紫外扫描结果如图2所示，没有发现核酸吸收峰(260nm～290nm)及蛋白质吸收峰(250～300nm)，证明黄伞多糖溶液中无核酸及蛋白。
4.包装保存把干燥后的纯多糖粉碎成细粉后，装入铝箔包装袋内封口保存或进行产品加工。
实施例6黄伞多糖提取与纯化 1.黄伞多糖提取 ①材料预处理将实施例1制得的菌丝体冻干，粉碎至120目，料水比1∶30、超声波功率1000W，处理15min； ②浸提将预处理后的菌丝体放入回流瓶中热水提取，提取时间2.5小时、提取温度90℃，得多糖浸提液； ③醇析向多糖浸提液中加入3倍量的无水乙醇，醇析12小时； ④浓缩醇析后3500rpm离心25min弃上清液，得沉淀物，依次用无水乙醇(1次)、丙酮(2次)洗涤沉淀。
⑤真空冷冻干燥得菌丝体粗多糖。
按上述提取方法，黄伞粗多糖提取率达到21.32％，多糖含量达到53.42％。
2.黄伞多糖纯化 将上述制得的多糖用蒸馏水制备成5％的多糖溶液，滴加适量的浓氨水使其pH值达到9，静置15min后在4500rpm下离心15min除去蛋白沉淀。然后将多糖溶液稀释一倍，再加入等体积的seveg试剂(正丁醇∶氯仿＝1∶4)剧烈振荡30min后，4500rpm下离心10min，取上清液重复操作一次。将多糖溶液浓缩后冷冻干燥。
取多糖溶于适量蒸馏水后经经由D152及D301T串联而组成的离子交换柱进一步室温20～28℃下纯化，洗脱液为蒸馏水，纯化后，再经Sephadex G-100凝胶柱层析纯化(室温20～28℃)，以蒸馏水作为洗脱液，即可得到高纯度多糖产品。经检测多糖含量达91.82％。
3.包装保存把干燥后的纯多糖粉碎成细粉后，装入铝箔包装袋内封口保存或进行产品加工。
实施例7黄伞多糖提取与纯化 1.黄伞多糖提取 ①材料预处理将黄伞子实体冻干，粉碎至160目，料水比1∶20、超声波功率600W，处理5min； ②浸提将预处理后的子实体放入回流瓶中热水提取，提取时间3小时、提取温度80℃，得多糖浸提液； ③醇析向多糖浸提液中加入5倍量的无水乙醇，醇析8小时； ④浓缩醇析后4500rpm离心10min弃上清液，得沉淀物，依次用无水乙醇(1次)、丙酮(2次)洗涤沉淀。
⑤真空冷冻干燥得子实体粗多糖。
按上述提取方法，黄伞粗多糖提取率达到9.39％，多糖含量达到41.89％。
2.黄伞多糖纯化 将上述制得的多糖用蒸馏水制备成2％的多糖溶液，滴加适量的浓氨水使其pH值达到10，静置10min后在4500rpm下离心10min除去蛋白沉淀。然后将多糖溶液稀释一倍，再加入等体积的seveg试剂(正丁醇∶氯仿＝1∶4)剧烈振荡30min后，4500rpm下离心10min，取上清液重复操作一次。将多糖溶液浓缩后冷冻干燥。
取多糖溶于适量蒸馏水后经由D152及D301T串联而组成的离子交换柱进一步室温20～28℃下纯化，洗脱液为蒸馏水，纯化后，再经Sephadex G-100凝胶柱层析纯化(室温20～28℃)，以蒸馏水作为洗脱液，即可得到高纯度多糖产品。经苯酚-硫酸法检测多糖含量达89.69％。
3.包装保存把干燥后的纯多糖粉碎成细粉后，装入铝箔包装袋内封口保存或进行产品加工。
实施例8黄伞多糖活性检验 (1)黄伞多糖促进小鼠脾淋巴细胞增殖作用 试验材料a.试验样品黄伞菌丝体多糖(样品A)；黄伞发酵液多糖(样品a) b.试验小鼠C57纯系小鼠，体重20克，购于中国医学科学院实验动物研究所。b.主要实验试剂和仪器新生牛血清，GIBCO产品，Cat No.16010-159.Lot No.600202；RPMI 1640培养基，GIBCO产品，Cat No.31800-022.LotNo.1165062；96孔培养板，Costar产品，产地美国。ATP生物荧光检测试剂盒为北京金紫晶生物医药技术有限公司产品，产地北京；微孔板荧光分析仪，BMP9504，北京滨松光子技术有限公司产品；二氧化碳培养箱，Forma 3111，产地美国；离心机，OLYMPUS OPTICAL CO.LTD，产地日本。
试验方法a.小鼠脾淋巴细胞悬液的制备小鼠断头处死，无菌取脾。将脾脏置于盛有适量无菌Hank`s液平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hank`s液洗2次，每次离心10min(1000r/min)。将细胞悬浮于10％的NBS-RPMI-1640中，用台盼兰染色计数，细胞活性为98％，调整细胞浓度为2×106个/mL。b.细胞培养和多糖浓度设定在无菌条件下，用完全RPMI1640培养液将多糖溶解，多糖溶液滤器除菌，再稀释至所需浓度。每种多糖设6个浓度，浓度分别为25、50、100、200、400和600μg/mL，每孔加入多糖溶液100μL；空白对照组(CK)加100μL培养液，均设3个重复孔。于96孔细胞培养板中，每孔加100μl脾细胞悬液，然后加入供试样品，于37℃、CO2浓度为5％、空气相对湿度为95％的CO2培养箱中培养4天，取出培养板每孔加入ATP提取液50μL，室温下放置5min，每孔取50μl，加入到测定白板中，然后每孔加入50μL荧光酶/荧光素测定液，于荧光测定仪上测定吸收值。c.检测与数据分析据实验组吸光值与空白组比较从而确定样品对脾细胞的增殖效果。SI(刺激指数)＝样品孔吸光值/空白孔吸光值。SI值大于1，表明样品对脾细胞有增殖作用，且SI越大，其增值效果越好。实验结果采用t检验，当P≤0.05时，各组与对照组(CK)比较有统计学意义。
试验结果从表1.可以看出黄伞菌丝体多糖(样品A)在剂量为25μg/mL～400μg/mL时，具有对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用，且与对照组差异显著(P＜0.05)。黄伞发酵液多糖(样品a)各剂量组具有对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用，且随着剂量其增殖作用增强，各剂量与对照组相比差异显著。以相同剂量相比，浓度为50～600μg/mL时，黄伞发酵液多糖的增殖作用显著大于菌丝体多糖。
表1黄伞多糖对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用
(2)黄伞多糖对Lvwis肺癌实体瘤抗性作用 试验材料A.黄伞菌丝体多糖(实施例5制得)；B.供试小鼠为C57纯系小鼠，雄性，18～22g，由北京力科爱达生物技术咨询服务中心提供，合格证号scxk2004-0001。C.供试瘤株Lewis肺癌瘤株购自中国医学科学院动物研究所。阳性对照药环磷酰胺，山西普德药业有限公司生产，批号20061102。
试验方法 A.动物分组 将实验动物随机分为5组，空白对照组CK1，阳性对照组CK2，多糖低、中、高剂量组。每组10只。
CK1——生理盐水对照组，同体积生理盐水； CK2——阳性对照组，剂量为30mg/kg； A1——黄伞多糖低剂量组，剂量50mg/kg； A2——黄伞多糖中剂量组，剂量100mg/kg； A3——黄伞多糖高剂量组，剂量200mg/kg； B.接种 将接种Lewis肺癌7后天生长良好的C57荷瘤小鼠脱臼处死，选取生长良好的瘤组织，制作细胞悬液，于腋下接种，0.2ml/只(5×106个)。
C.给药方案8组小鼠分为于接种瘤细胞悬液24h后开始灌胃给药，每日一次，连续给药9天，每次容量为0.2ml。空白对照组每天给予等量生理盐水。
D.观察指标第10天颈椎脱臼处死小鼠，剥取瘤块、脾脏、胸腺，用电子天平称重。用如下公式计算肿瘤抑制率、脾指数、胸腺指数进行药效评价。
抑瘤率＝(C-T)/C×100％，C为空白对照组平均瘤重(mg)，T为实验组平均瘤重(mg) 胸腺或脾脏指数＝胸腺(mg)或脾脏(mg)质量/体重(g) 数据分析数据以平均数±标准差(x±s)表示，，各组分别与阴性对照组进行比较数据用SPSS12.0软件进行分析。P＝0.05。
试验结果 A.从表2可以看出，低，中，高浓度抑瘤率分别为54.7％，34.7％，16.5％。低剂量组抑瘤率最高，试验组与生理盐水对照组和阳性对照组均差异显著。
表2菌伞菌丝体多糖对Lewis肺癌小鼠瘤重的影响
注▲表示与生理盐水对照组比较差异显著，△表示与阳性对照组比较差异显著。
B.在胸腺指数方面，阳性对照(CK2)很低，仅为0.39±0.24，阳性对照组与多糖组和生理盐水组均有显著差异；多糖各剂量组与空白对照相比较，以及多糖组之间均差异不显著(表3)。
表3黄伞菌丝体多糖对Lewis肺癌小鼠胸腺的影响
注▲表示与生理盐水对照组比较差异显著，△表示与阳性对照组比较差异显著。
C.在脾脏指数方面，阳性对照(CK2)较低，仅为2.06±0.55，阳性对照组与多糖组和生理盐水组均有显著差异；多糖各剂量组与空白对照相比较，以及多糖组之间均差异不显著(表4)。
表4黄伞菌丝体多糖对Lewis肺癌小鼠脾脏的影响
注▲表示与生理盐水对照组比较差异显著，△表示与阳性对照组比较差异显著。
(3)黄伞多糖的免疫调节作用 试验材料 a.实验动物山东实验动物中心提供的近交系、18-22克、雄性小白鼠，试验处理共24组，每组试验10只。
b.试剂与仪器 生理盐水、溴甲酚紫指示剂、甲醇、Giemsa染料、KH2PO4、NAH2PO4·12H2O、DMPO(5.5-dimethyl-1-pyrroline-1-oxide)、黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶均为美国Sigma公司产品；二乙三胺五乙酸、过氧化氢、硫酸亚铁胺，北京化学试剂公司化学纯试剂。SRBC绵羊颈静脉取血，将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中，朝一个方向摇动，摇脱纤维，放入4℃冰箱保存备用。Giemsa染液a.取Giemsa染料0.5g，中性甘油33mL，甲醇333mL。先将Giemsa染料置清洁研钵体中，加甘油后，研磨片刻，倒入棕色瓶内，放置55～60℃水浴箱内2小时，不断摇匀，在加入甲醇摇匀，保存备用。b.稀释姬姆萨氏染色液——使用时用pH6.8的缓冲液8份加姬姆萨氏染色原液1份，即成应用液。
PBS缓冲液KH2PO4 6.66g，NaH2PO4·12H2O将上述试剂溶于水1000mL蒸馏水中调pH值至7.2即成。
1％鸡红细胞悬液实验前取鸡静脉或动脉血，置于盛有玻璃珠(20个左右)的三角瓶中，连续顺一个方向充分摇动5～10min，除去纤维蛋白，4℃冰箱保存。实验前用生理盐水洗涤3次，1500r/min，离心10min，弃去上清，按血球压积用Hank’s液配制成1％鸡红细胞悬液。
3％琼脂取琼脂3克，加水100mL，加热煮沸至透明，加1％溴甲酚紫指示剂1～2。
Giemsa染液的脱色液甲醇20mL，蒸馏水80mL。混合后2N HCl两滴。
DMPO(5.5-dimethyl-1-pyrroline-1-oxide)用前经活性碳处理。
c.仪器 计数器、手术器械、注射器、染色槽均为实验室常规仪器；微量血凝实验板济南博赛公司。
实验方法A.体液免疫功能测定血清溶血素测定实验(血凝法)[7]。B.单核-巨噬细胞功能测定小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验(滴片法)[7]。C.受试样品剂量及时间黄伞样品设3个剂量组，即1mg/d、2mg/d、10mg/d摄入量；另设阴性对照组。每组试验10只。D.受试样品给予方式高压灭菌纯水溶解后灌胃。每天灌胃一次，持续15天。E.统计学方法实验数据均采用SPSS13.0统计软件进行统计分析。F.增强免疫力功能判定根据《保健食品检验与评价技术规范》中的结果判定原则，即在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能、NK细胞活性四个方面任两个结果阳性，就可判定该受试样品具有增强免疫力功能作用。
实验结果 通过小鼠每日分别灌喂5倍、10倍以及50倍人体剂量A1，A2和PA 15d后，小鼠血清溶血素与未灌喂空白相比较，来探讨三种多糖是否具有提高人体体液免疫功能，结果显示A1样品5倍人体剂量、10倍人体剂量、50倍人体剂量，A2样品5倍人体剂量、10倍人体剂量，PA样品10倍人体剂量实验结果为阳性，可见三种多糖均不同程度的提高小鼠体液免疫功能，其中A1和A2均有两个(包括)以上水平实验阳性，因此可以判定A1和A2体液免疫功能测定实验阳性，即具有提高体液免疫力功能。实验结果还表明，A1三个剂量均具有提高体液免疫功能，而A2只在低浓度时起作用。
(4)黄伞多糖体外抗氧化作用 试验材料5种样品子实体提取多糖A1、菌丝体提取多糖A2、、菌丝体粉A3、子实体粉A4。
上述样品用三蒸水溶解稀释至所需浓度(1.0、10.0、100.0mg/mL+1.5mL50％乙醇)在517nm处测定A2；对照组用双蒸水。
仪器试剂DMPO(5.5-dimethyl-1-pyrroline-1-oxide)、黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶均为美国Sigma公司产品。DMPO用前经活性碳处理。检测仪器为日本REIX型顺磁共振波谱仪(EPR)(测试条件实验参数微波频率9.66GHz，微波功率20mW，调制频率100kHz，调制幅度0.5mT)。
试验方法EPR测定分别取一定量样品溶液(≤0.1ml)，按试剂盒所标明操作方法进行试验，反应体系的总体积为3.4ml。
氧自由基的产生产生氧自由基模型为黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶体系XH+O2→X+H++O-2·；羟自由基产生的模型为Fenton反应H2O2+Fe2+→Fe3++2·OH。
波谱分析电子自旋共振波谱信号分别为代表羟自由基和超氧阴离子自由基被捕捉后的加合物DMPO-OH和DMPO-OOH，其峰值与体系中产生的氧自由基浓度呈正比。
计算方法样品对自由基清除的百分率E，E＝[(h0-hx)/h0]×100％，h0为对照组电子自旋共振信号平均峰值，hx为实验组峰高平均值。
试验结果 三种黄伞多糖具有较好的抗氧自由基和羟自由基作用。在氧自由基实验中A2菌丝体提取多糖-10mg/mL剂量清除氧自由基的效果最好，达72.7％，其他两种多糖在最高浓度时清除率也达69.1％，均优于菌丝体粉和子实体粉55％左右，且除A2外；羟自由基实验中A1-100mg/mL剂量对清除率最高，达到95.8％，也优于A3和A4的70％左右，多糖对羟自由基的清除作用与多糖浓度也成线性关系(表5、表6)。
表5 多糖对氧自由基的清除作用
参考文献
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7.保健食品检验与评价技术规范(2003版).中华人民共和国卫生部，2003.22～3权利要求
1.黄伞多糖，其通过如下方法制备获得
1)黄伞粗多糖的提取
以黄伞菌丝体或子实体为原料，经①材料预处理，②浸提，③醇析，④浓缩，⑤真空冷冻干燥，得黄伞粗多糖；
2)黄伞多糖纯化
将黄伞粗多糖制成1～5％的水溶液，滴加适量的浓氨水使其pH值达到8～10，静置10～15min后在4500～5000rpm下离心10～15min除去蛋白沉淀；然后将多糖溶液稀释1～3倍，再加入等体积的seveg试剂，剧烈振荡25～35min后，4500～5000rpm下离心10～15min，取上清液加入等体积seveg试剂重复除蛋白操作一次，将多糖溶液浓缩后冷冻干燥；取多糖溶于蒸馏水后经由D152及D301T串联而组成的离子交换柱进一步室温20～28℃下纯化，洗脱液为蒸馏水，纯化后，再经Sephadex G-100凝胶柱层析纯化，以蒸馏水作为洗脱液进行洗脱，即得黄伞多糖。
2.一种制备黄伞多糖的方法，其包括如下步骤
1)黄伞粗多糖的提取
以黄伞菌丝体或子实体为原料，经①材料预处理，②浸提，③醇析，④浓缩，⑤真空冷冻干燥，得黄伞粗多糖；
2)将黄伞粗多糖制成1～5％的水溶液，滴加适量的浓氨水使其pH值达到8～10，静置10～15min后在4500～5000rpm下离心10～15min除去蛋白沉淀；然后将多糖溶液稀释1～3倍，再加入等体积的seveg试剂剧烈振荡25～30min后，4500～5000rpm下离心10～15min，取上清加入等体积seveg试剂重复除蛋白操作一次，将多糖溶液浓缩后冷冻干燥；取多糖溶于蒸馏水后经由D152及D301T串联而组成的离子交换柱进一步室温20～28℃下纯化，洗脱液为蒸馏水，纯化后，再经Sephadex G-100凝胶柱层析纯化，以蒸馏水作为洗脱液进行洗脱，即得黄伞多糖。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，其中步骤1)
①材料预处理将黄伞菌丝体或子实体冻干，粉碎至120～160目，加去离子水1∶20～30，超声波处理5～15min；
②浸提回流提取，提取时间1～4小时、提取温度60～90℃；
③醇析向浸提液中加入3～5倍量的无水乙醇，醇析8～16小时；
④浓缩醇析后3500～5000rpm离心15～25min弃上清液，得沉淀物，先用无水乙醇洗涤沉淀一次，再用丙酮洗涤沉淀两次；
⑤真空冷冻干燥。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，其中步骤1)
①材料预处理将黄伞菌丝体或子实体冻干，粉碎至140目，料水比1∶30、超声波功率600W，处理时间10min；
②浸提回流提取，提取时间3小时、提取温度75℃；
③醇析向浸提液中加入4倍量的无水乙醇，醇析12小时；
④浓缩醇析后3500-5000rpm离心20min弃上清液，得沉淀物，先用无水乙醇洗涤沉淀一次，再用丙酮洗涤沉淀两次；
⑤真空冷冻干燥。
5.如权利要求2～4任一项所述的方法，其中所述黄伞菌丝体通过如下方法制备获得
①液体培养基配方葡萄糖15～25g/L、酵母浸粉6～10g/L、维生素B1200～400μg/L、Mg2SO40.3～0.5g/L、KH2PO40.8～1.2g/L、K2HPO40.8～1.2g/L，水余量，高压灭菌备用；
②种子培养按无菌操作方法，取母种菌丝体，按接种量1～10％(V/V)，转接灭菌后的液体培养基中，培养温度在24～26℃；摇床转速120r/min～140r/min条件下，培养时间10～14天；
③发酵培养将种子培养菌种，无菌操作方法，按接种量5～10％(V/V)接种至发酵罐中，按常规发酵培养，发酵培养基为葡萄糖20～40g/L，玉米浆15～25g/L，磷酸二氢钾1.5～2.5g/L，pH值6.5～7.0，控制温度24～26℃、搅拌转速150～180r/min，通气量为0.8～2(V/V·min)，发酵培养7～10天。
6.含有权利要求1所述黄伞多糖的药物或保健食品。
全文摘要
本发明提供了一种黄伞多糖，其是从黄伞菌丝体或子实体中经提取纯化获得，其是一种由葡萄糖、果糖、甘露糖以及半乳糖四种单糖组成的一种杂多糖。其能提高人体免疫力，具有防癌、抗癌，抗衰老等作用。可与灵芝多糖、云芝多糖等配合使用。本发明还提供了一种制备黄伞多糖的方法，改进水提法，粗多糖得率达23％以上，多糖含量55％；粗多糖的纯化后含量高达到93.67％，结合菌丝体液体培养技术，可提高菌丝体生长量10％以上，从而降低生产成本，提高生产效率，特别是大大提高了多糖产品的生物活性作用。
文档编号C12N1/20GK101735329SQ20081022605
公开日2010年6月16日 申请日期2008年11月4日 优先权日2008年11月4日
发明者胡清秀 申请人:中国农业科学院农业资源与农业区划研究所