专利名称：表达颗粒状甲烷单加氧酶的方法及其专用工程菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种表达颗粒状甲烷单加氧酶的方法及其专用工程菌。
背景技术：
甲烷是重要的化工原料和化学能源，在人类的生产生活中扮演着重要的作用；同 时也是造成温室效应最为重要的气体之一。有效、合理地利用甲烷，必将对全球能源 利用、环境保护和循环经济产生重大的影响。由于甲烷是最稳定的垸烃化合物，C-H 键能为104kcalmo1—1，因此，甲垸直接转化其它高附加值化学品对于化学科学和工程 都是一个很大的挑战。特别的，现有工艺通过氧化甲烷生成甲醇需要非常苛刻的反应 条件，经过长期的工艺改进和催化剂改良，目前工业上从甲烷生产甲醇仍需255'C的 温度和5 15MPa的压力。此外，这些工艺过程中所用的甲烷一般来自于天然气，但 在自然界中分布广、密度低的沼气等甲垸资源由于其纯度较低，不能作为工业催化的 原料。
自然界中的一类特殊微生物——甲垸氧化菌——可以在常温常压的情况下，依靠 体内的甲烷单加氧酶无污染的实现甲烷到甲醇的专一性转化。甲烷单加氧酶不仅可以 将甲烷转化成为甲醇，而且还可以催化其它一系列的单加氧反应，可以广泛地应用于 生物转化及环境治理。如果能将甲烷单加氧酶进行表达，开发出一种细胞形态生物催 化剂，那么在常温常压下就能将天然气转化为甲醇。这将大大降低甲醇的生产成本， 是一种高度节能的、环境友好的甲醇生产工艺。同时，以可再生资源为原料通过厌氧 甲垸发酵可以提供廉价的甲烷，是实现循环工业的极具潜力的一条途径。因此甲烷的 资源化利用技术的研发具有重要的工业应用价值。
甲烷单加氧酶(EC.U4.13.25, Methane Monooxygenase，简称MMO)分两种，一 种是可溶性的甲烷单加氧酶(soluble methane monooxygenase，简称sMMO)，另一 种是与细胞膜结合的颗粒状甲垸单加氧酶(particulate methane monooxygenase,简称 (pMMO)。尽管sMMO和pMMO都能氧化甲烷生成甲醇，但二者还是存在很多的不 同。sMMO存在于细胞质中，它底物范围广，许多的烃类化合物和芳香族化合物都能 被氧化。与sMMO相比，pMMO的底物选择性相对较窄，只能氧化五碳以内的烷烃和 烯烃，不能氧化芳香烃。但是pMMO却具有很多sMMO不具备的优势。pMMO存在于 细胞膜上而不是细胞质中。该性质有利于底物与酶的接触和反应产物及时排出，意味 着该酶催化的反应传质阻力更低，因而有利于在生物转化中应用。pMMO存在四级结
构，由三个亚基组成(分别是23kDa的pmoC、 27kDa的pmoA和45kDa的pmoB, Genbank 31650 AF186586 )，pMMO是a3(33丫3的三聚体结构，铜离子位于pmoB中。尽管在pMMO 酶分子研究方面取得了一系列的进展，而且Mef /ococcws ca/ww/flf附(Bath)和 Mef/z;;/ay/"t^ R/cAcwjwr/wn OB3b的pmo基因已经克隆测序，但pMMO的重组异源表达 却进展甚微，至今在大肠菌及其他宿主细胞中没有表达成功。但pMMO的异源表达技 术仍不成熟，既便有个别成功的例子，但重组菌的活性仅为原始菌的千分之一，不能 得到高活性的表达。主要原因是pMMO的异源表达大都以大肠杆菌为宿主，得不到转 化子，推测是pMMO的表达产物对大肠菌具有毒害作用。
尽管利用野生型甲烷氧化菌能够将甲烷转化甲醇，但是其在大规模的工业应用还 存在一系列难以克服的技术问题。首先，甲垸氧化菌的培养比较困难，与其他工业应 用的微生物相比增殖速度极慢，而且能够得到的细胞密度低。尽管通过添加特殊底物 (氯甲垸、有机酸、维生素或甲醇等)能促进甲烷氧化菌生长，但其生长速度还是远远 低于其它菌类。其次，利用野生甲垸氧化菌进行甲烷转化甲醇的过程中，甲醇的积累 不易控制。在这些菌中都含有甲醇脱氢酶，因此甲醇会进一步地被氧化成为甲醛，进 一步进入的细胞合成代谢。如果加入特殊的化学试剂，选择性地抑制甲醇脱氢酶的活 性，这样虽然暂时促进甲醇的积累，但细胞的代谢途径却被中断，特别是阻止细胞的 辅酶再生，严重影响细胞的代谢活性，进而阻止甲垸氧化反应。这主要是因为对于甲 垸氧化菌而言，MMO氧化甲垸所需的NADH只能由甲醛进入相应的代谢途径后才能 产生，因此如果将细胞控制在生产甲醇这一步的话，胞内原有的NADH被耗竭时，反 应就停止了。
发明内容
本发明的目的是提供一种表达颗粒状甲烷单加氧酶的方法及其专用工程菌。 本发明所提供的可表达颗粒状甲烷单加氧酶的工程菌，是将可表达颗粒状甲垸单
加氧酶的重组表达载体导入宿主菌中，筛选得到的可表达颗粒状甲烷单加氧酶的重组菌株。
所述重组表达载体为含有单加氧酶的启动子及其下游连接的颗粒状甲烷单加氧 酶的编码基因的可在宿主菌中表达的载体。
所述单加氧酶基因的启动子为垸烃单加氧酶基因的启动子或颗粒状甲垸单加氧 酶基因的启动子；所述垸烃单加氧酶基因的启动子的核苷酸序列为自GENBANK号 为AJ302087的5'端第2008 — 2150位核苷酸序列，所述颗粒状甲烷单加氧酶基因的 启动子的核苷酸序列为自GENBANK号为U31650 AF186586的5'端第34—499位 核苷酸序列。
所述颗粒状甲垸单加氧酶的编码基因的的核苷酸序列为自GENBANK号为 U31650 AF186586的5'端第500 — 3743位核苷酸序列。所述宿主菌为产气肠杆菌(五"&ro&acter aerage"^y)、恶臭假单胞菌(尸sewctowo"(xs 、施氏假单胞菌(尸sewd画owfl5 Wwtem')、 铜绿假单胞菌(尸^Mt/o附。"(ZS1 aerwg/wo犯)，甲基扭曲杆菌(她鄉/o6acte"'謂exto wem)、巴氏毕赤酵母Wc/z/a / aWo/^)或酉良酒酵母(Sacc/7(3Tom^yces cerev/s/ae)。所述重组表达载体的构建出发载体可为pComl0、酵母表达载体等，其中pCom10 质粒可用于上述产气肠杆菌、恶臭假单胞菌、施氏假单胞菌、铜绿假单胞菌，甲基扭 曲杆菌等宿主中，而酵母表达载体可用于上述巴氏毕赤酵母或酿酒酵母中。所述重组表达载体优选为将颗粒状甲垸单加氧酶的编码基因插入到pCom10的 AWe/和/^>^///酶切位点之间或将所述单加氧酶基因的启动子及其下游连接的所述颗 粒状甲垸单加氧酶的编码基因插入到pCom10的五coi /和历>^///酶切位点之间得到 的可表达颗粒状甲垸单加氧酶的重组载体。本发明所提供的表达颗粒状甲烷单加氧酶的方法，是诱导表达上述的工程菌，得 到含有颗粒状甲烷单加氧酶的发酵菌液。所述方法中，所述诱导表达的方法为发酵至对数生长初期的权利要求l一6中任 意一项所述的工程菌的发酵液中，加入0.05n/。(v/v)正辛烷，在15-2(TC诱导培养得到 含有颗粒状甲烷单加氧酶的发酵菌液。本发明通过生物信息学比对，选择与颗粒状甲垸单加氧酶同源性较高(大于30%) 的单加氧酶，并利用其启动子作为调控颗粒状甲烷单加氧酶功能基因; moC45的启动 子构建构建单加氧酶启动子^^moC45表达体系，同时选择适当的表达载体，构建得 到可表达颗粒状甲烷单加氧酶的重组表达载体。本发明选择了具有较多膜蛋白氧化还 原酶的菌作为宿主菌，并利用化学转化或电穿孔转化及原生质体融合等手段将表达载 体转入宿主菌中构建了可表达颗粒状甲烷单加氧酶的工程菌，实验证明这些工程菌具 有稳定、高效表达颗粒状甲烷单加氧酶的功能。本发明的方法利用上述具有颗粒状甲垸单加氧酶表达活性的重组菌，彻底避开甲 醇脱氢酶基因的影响，使甲垸氧化停留在甲醇这一步反应，克服了野生型甲垸氧化菌 的缺陷，更易培养(能用含葡萄糖等普通碳源的培养基培养)。本发明还利用具有颗 粒状甲垸单加氧酶活性的重组菌成功地解决了颗粒状甲垸单加氧酶的异源表达问题。所构建的基因工程重组菌能将天然气的烷烃液化成为相应的醇类，能将沼气转化为甲 醇，能将丙烯氧化成1,2 —环氧丙垸。本发明的工程菌可以用于环境中难降解化合物 如石油中烃类化合物的羟化分解，因而可用于环境的生物治理。
图1为pCompmo质粒构建图 图2为pCHP质粒构建3为五.flera取"^ pCompmo SDS-PAGE电泳图。 图4为含有pCHP质粒重组菌SDS-PAGE电泳图。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。 实施例l、可表达颗粒状甲垸单加氧酶的工程菌的构建及其颗粒状甲烷单加氧酶 的表达1、可表达颗粒状甲烷单加氧酶的工程菌的构建 1)可表达颗粒状甲烷单加氧酶的重组表达载体(pCompmo)的构建 选择pComlO质粒(其核苷酸序列为自GENBANK Accession Number为AJ302087 的第l-7675位核苷酸，可按照文献(Theo H. M. Smits，尸/謹"，2001， 46:16-24) 描述的方法构建，清华大学)作为可表达颗粒状甲烷单加氧酶的重组表达载体的出发 载体， 一方面是其为广谱质粒，可以在不同的革兰氏阴性细菌复制；另一方面，该质 粒启动子PalkB为烷烃单加氧酶启动子(自GENBANK Accession Number为AJ302087 的5'端第2008 — 2150位核苷酸序列)，而烷烃单加氧酶与甲烷单加氧酶在结构与功 能上有许多相似性。可表达颗粒状甲垸单加氧酶的重组表达载体构建示意图如图l所示，具体方法如 下所述以M^c/zo^o〃'Mm OB3b的基因组DNA为模版，扩增pmoC45功能基因 (GENBANK Accession Number为U31650 AF186586的5'端第500 —3743位核苷酸序 列),所用上下游引物分别为5 ， -CATATGAATTCAACAACAGAGACAACAG-3 ，(带 下划线的序列为MM的识别序列)和5'-AAGCTTCCAAACGCCGCATTCTATC-3'(带 下划线的序列为历'wdn的识别序列)，分别引入A^I和历^III酶切位点。PCR扩增反应条件如下先94"C，预变性4分钟后进行30个循环的扩增反应；循环反应条件是94。C变性l分钟，54"C退火1分钟，72C延伸4分钟；30个循环结束后72"C补充延伸10 分钟。扩增得到了预期的3.4kb的片段，经测序表明，扩增得到的片段具有自 GENBANK Accession Number为U31650 AF186586的5，端第500 — 3743位核苷酸序列， 即为pmoC4B功能基因片段。将纯化后的PCR产物经限制性内切酶A^M和/Z/^ffll进行双酶切，将酶切得到的带 有AWd禾卩历MJIII粘性末端的pmoC^功能基因片段插入pCom 10的A^M和历wffll酶识
别位点之间，得到重组表达载体，将该重组表达载体进行酶切和测序验证，将验证表明含有启动子PalkB与其下游连接的上述PCR得到的/wzoC4S的重组表达载体命名为 pCompmo。2)可表达颗粒状甲烷单加氧酶的工程菌的构建为了将/7moC45基因在不同宿主中表达，选择了富含氧化还原酶的革兰氏阴性细 菌作为宿主菌。利用电转化的方法将构建好的质粒pCompmo分别转入产气肠杆菌flerage"M，中国工业微生物菌种保藏管理中心购买，编号10293)、 恶臭假单胞菌(尸^"^mo"w ;n^Wa，中国工业微生物菌种保藏管理中心购买，编号 10298)、施氏假单胞菌(尸"^/omo"aw加zer/，美国典型微生物菌种保藏中心购买， 编号11607)、铜绿假单胞菌(i^"&mo"w aerag/mwa，中国工业微生物菌种保藏管 理中心购买，编号10204)或甲基扭曲杆菌(Me^y/o6acto^m exto^wms，美国典型 微生物菌种保藏中心购买，编号8457)，将得到的重组工程菌株提取质粒测序验证， 将验证表明含有质粒pCompmo的产气肠杆菌(五"^o6flcteraerage"^)工程菌、恶臭 假单胞菌(尸^Mc/纖(9"as1拜"c/a)工程菌、施氏假单胞菌(尸sewd謹o"as 工 程菌、铜绿假单胞菌(尸化Wowo"^ aerag/"(Wfl )工程菌，甲基扭曲杆菌 (Afer/2_y/o6acten'ww ex,ow〃em ) 工禾呈菌分另U命名为产气肠杆菌(五",ero6acter aeragewesO pCompmo、恶臭假单胞菌(尸sewfifo,"ay/^/c/a) pCompmo、施氏假单胞 菌(尸sew(io附o;ms pCompmo、 铜绿假单胞菌(aerwg/wosa)pCompmo ， 甲基扭曲杆菌(Me鄉/oZ)acfe",謂e加r《Mem1) pCompmo。 2、颗粒状甲垸单加氧酶的表达将产气肠杆菌(五"fera6acter aerage"eiO pCompmo、恶臭假单胞菌pCompmo、施氏假单胞菌(尸sei^/謹o"os1pCompmo、铜绿假单胞菌 (i^e^/画owaw aerwg7> (wa) pCompmo ， 甲基扭曲杆菌(^/6—/。^"6〃'扁e加r，e— pCompmo分别进行诱导表达；具体方法如下所述将上述工程菌下述基础培养基中培养至对数生长初期，然后分别在发酵液中，加 入0.05。/0(v/v)正辛烷，在18TH秀导培养5小时得到含有颗粒状甲烷单加氧酶的发酵菌 液。基础培养基每升溶液中含有甘油lg， NaNH4HP04'4H20 3.5g， K2HP04'3H20 7.5g， KH2P043.7g， MgS047H20 0.246g， MT lt液lml，去离子水定容至1L;其中 MT贮液为每升溶液中含有FeS(V7H20 2.78g，MnCl2'4H20 1.98g， CoS04'7H20 2.81g， CaCl2.2H20 1.47g， CuCl2'2H20 0.17g， ZnS04'7H20 0.29g， lmol.L-1 HC1定容至1L。将上述诱导培养5小时后得到的培养液，分别离心收集lml培养液的菌体，用 无菌水洗涤后，按照下述方法提取整细胞蛋白1) 以0.5ml用冰预冷的50mmol/LTris'Cl(PH 7.4)振荡沉淀的菌体使之复悬，用 微量离心机于零度以12000g离心30秒回收菌体。再次吸出上清液，小心的吸净管壁 上的液滴，尽可能是沉淀物不带有残留液体。2) 在步骤l)得到的沉淀中加入25ul水，振荡使沉淀复悬， 一旦菌体分散开来， 立即加入25ul 2倍的SDS凝胶加样缓冲液(含有100mmol/L Tris'HCl (PH 6.8)， 200mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)，质量百分含量为4%的SDS (电泳级)，质量百分含 量为0.2%的溴酚蓝，质量百分含量为20%的甘油的溶液)，继续振荡20秒钟。3) 将步骤2)得到的样品在沸水裕中放置5分钟，采用带有浸入尖头或能在冷 却杯中同时处理多个样品的超声处理仪对样品进行剪切。4) 将步骤3)得到的剪切后的样品于室温仪12000g离心10分钟，将上清液移 至另一个管中，弃沉淀物得到蛋白样品。吸取上述得到的经剪切或超声处理的样品25u进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分 析。然后用蛋白电泳图像分析软件计算表达的蛋白占总蛋白的量。分别以上述工程菌 的野生型菌产气肠杆菌(五"tera6acteraeragwe^中国工业微生物菌种保藏管理中心 购买，编号10293)、恶臭假单胞菌(尸wz^omoww;^^fa，中国工业微生物菌种保藏 管理中心购买，编号10298)、施氏假单胞菌(/^w^mo^H加zen'，美国典型微生物 菌种保藏中心购买，编号11607)、铜绿假单胞菌(尸"^fomoww aewg/"o叫中国工 业微生物菌种保藏管理中心购买，编号10204)或甲基扭曲杆菌(Afe^y/ote"en^m exto^M叫美国典型微生物菌种保藏中心购买，编号8457)进行上述同样的诱导培 养后按照上述提取整细胞蛋白后进行蛋白电泳为对照。结果表明，上述产气肠杆菌(五"ferakzcfer flerage朋s) pCompmo、恶臭假单胞菌 (/^eMctowo"fiw/7wafifa) pCompmo、施氏假单胞菌(尸seMtfomo打os Wwteen') pCompmo、 铜绿假单胞菌(f^ewt/omo"oy aerag/"osa) pCompmo，甲基扭曲杆菌(A/e/Z^/o6a"eWww extor^e"力pCompmo均可表达pMMO蛋白，表达的pMMO蛋白均包括其pmoB、 pmoA和pmoC亚基，表达量达总蛋白的5%以上。用美国GE Healthcare公司的 ImageMaster VDS凝胶成像系统配套软件分析表明，产气肠杆菌(五"tero6ac^ pCompmo、恶臭假单胞菌(尸wz^/omowaw/ M^fa) pCompmo、施氏假单胞 菌(尸sewiomowas 5tMZzen') pCompmo、 铜绿假单胞菌(尸seMfitowo"cw aerag/"osa) pCompmo，甲基扭曲杆菌(Me^y/o6fl"eWww exto/^wem) pCompmo的pMMO蛋白表达 量分别为0.8g/L发酵液、1.0g/L发酵液、0.7g/L发酵液、1.0g/L发酵液、0.5g/L发酵 液。其中，产气肠杆菌(五"fera6fl"er pCompmo表达蛋白电泳图如图3所 示，图3中，Ml为24 97kD分子量的标准蛋白marker， M2为16 115kD分子量的标准 蛋白marker， E为用产气肠杆菌(五Wera6a"w pCompmo整细胞蛋白上样 的条带，Control为用野生菌产气肠杆菌(五wferak c^^erage"w,中国工业微生物菌
种保藏管理中心购买，编号10293)整细胞蛋白上样的条带。工程菌产气肠杆菌(五"tera6acter pCompmo与野生菌产气肠杆菌相比，在36kD 53kD处、24kD 36kD和24kD处均有明显条带，分子量大小约为45kD、 27kD和24kD。而pMMO 的三个亚基大小分别为23kD (pmoC) 、 27kD (pmoA)和45kD (pmoB)。图3中箭 头所指三处为pMMO的亚基，从上至下分别为pmoB、 pmoA禾卩pmoC。 SDS-PAGE电 泳说明编码pmoCAB的mRNA可以在基因工程宿主产气肠杆菌(^&^ra^cter 中进行翻译。蛋白电泳图像分析软件分析表明，从整细胞蛋白的电泳中 可以发现工程菌表达pMMO的量为菌体总蛋白的5。/。以上。实施例2、可表达颗粒状甲烷单加氧酶的工程菌的构建及其颗粒状甲烷单加氧酶 的表达1、可表达颗粒状甲垸单加氧酶的工程菌的构建1) 可表达颗粒状甲烷单加氧酶的重组表达载体(pCHP)的构建 可表达颗粒状甲垸单加氧酶的重组表达载体(pCHP)的构建流程示意图如图2所示。以M fr/c/2cw^on'wm OB3b的基因组DNA为模版，扩增; mo功能全基因簇 (AF186586 )，所用上下游引物分另U为5，-AGTAGAATTCATTGA GAAGTGAGCAGCCT-3 ，(带下划线的序列为的识别序列)和5 ， -ATACA AAGCTTTGAAGATAATGCTGCCGA-3，(带下划线的序列的识别序列)， 分别引入&^1和///"^111酶切位点。PCR扩增反应条件如下先94'C，预变性4分钟后 进行30个循环的扩增反应；循环反应条件是94。C变性l分钟，56t:退火l分钟，72°C 延伸4分钟；30个循环结束后72。C补充延伸10分钟。得到了预期的4.4kb的片段，经测 序表明，扩增得到的片段具有自GENBANKAccessionNumber为U31650AF186586的 5'端第34bp—4474bp位核苷酸序列，即为; mo全基因簇，其中自GENBANK Accession Number为U31650 AF186586的5'端第34—499位核苷酸序列为启动子序列。将纯化后 的PCR产物经限制性内切酶五coi I和历"JIII进行双酶切，将酶切得到的带有AWd和 历"dll粘性末端的; moC^功能基因片段与插入pComlO的Ecoi I和历m/in酶识别位 点之间，得到重组表达载体，将该重组表达载体进行酶切和测序验证，将验证表明含 有上述PCR得到的片段的重组表达载体命名为pCHP。2) 可表达颗粒状甲垸单加氧酶的工程菌的构建为了将;wK)C45基因在不同宿主中表达，选择了富含氧化还原酶的革兰氏阴性细 菌作为宿主菌。利用电转化的方法将构建好的质粒pCHP分别转入产气肠杆菌 (五"bokzcbflm ge"M中国工业微生物菌种保藏管理中心购买，编号10293)、恶
臭假单胞菌(尸Mwdomo"w /n^V/a,中国工业微生物菌种保藏管理中心购买，编号 10298)、施氏假单胞菌(尸^^omo"aH&teen'，美国典型微生物菌种保藏中心购买，. 编号11607)、铜绿假单胞菌(尸^^owo"w"en^'"o叫中国工业微生物菌种保藏管 理中心购买，编号10204)和甲基扭曲杆菌(M^/^/o6acten'Mm ejcto^wew,美国典型 微生物菌种保藏中心购买，编号8457)中，将得到的重组工程菌株提取质粒测序验证， 将验证表明含有质粒pCHP的产气肠杆菌(五wfera6acter 、恶臭假单胞菌(尸扁do腳腿戸,/fifa)、施氏假单胞菌(尸扁domo謹血zen')、铜绿假单胞菌 (尸5ewfifewzo"oy aen^7'"ara)， 甲基牛丑曲杆菌(A/"/zy/o6acfen'MW exto wera)分另U命 名为产气肠杆菌(五她ra6a"er aerage廳)pCHP、恶臭假单胞菌(/^e油膽"os戸 油) pCHP、施氏假单胞菌(尸wwcfowo"w pCHP、铜绿假单胞菌(尸wMtfomomwGer，'"osfl) pCHP ， 甲基扭曲杆菌(M"/z—6a"m'調extor，era) pCHP 。 2、颗粒状甲垸单加氧酶的表达将产气肠杆菌(五wfera6a"er aeragewes) pCHP、 恶臭假单胞菌(尸sewicwzo"iM ;w^fe) pCHP、施氏假单胞菌(i^ew&wo"w ) pCHP 、铜绿假单胞菌(尸set^/omo"iW aerwg/wosa) pCHP，甲基扭曲杆菌(A/e^y/o6a"en'wm exto we"s) pCHP 分别进行诱导表达；具体方法如下所述将上述工程菌下述基础培养基中培养至对数生长初期，然后分别在发酵液中，加 入0.05°/一~)正辛烷，在2(TC诱导培养5小时得到含有颗粒状甲烷单加氧酶的发酵菌 液。基础培养基每升溶液中含有甘油lg (或lg葡萄糖)，NaNH4HP044H20 3.5g， K2HPCV3H20 7.5g， KH2P04 3.7g， MgS04'7H20 0.246g， MT贝i液lml，去离子水定 容至1L;固体培养基中加入15g琼脂粉；其中MT贮液为每升溶液中含有FeSCV7H20 2.78g， MnCl2'4H20 1.98g， CoS04'7H20 2.81g， CaCl2-2H20 1.47g， CuCl2.2H20 0.17g， ZnS04'7H20 0.29g， lmol'L" HC1定容至1L。将上述诱导培养5小时后得到的培养液，分别离心收集细胞，用无菌水洗涤后， 对整细胞蛋白(按照实施例1的步骤2所述的提取整细胞蛋白的方法提取得到)然后 分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检验。然后用蛋白电泳图像分析软件计算表达的蛋白占 总蛋白的量。分别以上述工程菌的野生型菌产气肠杆菌(五"敏o&c^aeragewey,中 国工业微生物菌种保藏管理中心购买，编号10293)、恶臭假单胞菌(尸wwAmo"氾 ; ^V/a，中国工业微生物菌种保藏管理中心购买，编号10298)、施氏假单胞菌 (尸wz^omomss加zm'，美国典型微生物菌种保藏中心购买，编号11607)、铜绿假单 胞菌(/^et^omoMasaewg&osfl，中国工业微生物菌种保藏管理中心购买，编号10204) 或甲基扭曲杆菌(7kfe^y/Wa"en'wm exto^wera,美国典型微生物菌种保藏中心购买， 编号8457)进行上述同样的诱导培养后进行蛋白电泳为对照。
结果表明，上述产气肠杆菌(￡"tera6acter "eroge"m) pCHP、恶臭假单胞菌 (i^ewctomw2GW/ w"da) pCHP、施氏假单胞菌(尸se^/omo"(Xs pCHP、铜乡录4叚单胞菌(尸^wAmoMasflen^/"ow) pCHP在上述两种培养基的诱导培养后，均可表达 pMMO蛋白，表达的pMMO蛋白均包括其pmoB、 pmoA和pmoC亚基，表达量达 总蛋白的5 %以上。用美国GE Healthcare公司的ImageMaster VDS凝胶成像系统配 套软件分析表明，产气肠杆菌(五"fera6fl"er aeragew^) pCHP、恶臭假单胞菌 (i^ewt/omo"(zy; m^/a) pCHP、施氏假单胞菌(尸sewctomomw pCHP、铜绿假单胞菌(/^ewcfomo"as aewg/"asfl)pCHP的用添加葡萄糖的培养基诱导培养时pMMO 蛋白表达量为分别0.4g/L发酵液、0.3g/L发酵液、0.4g/L发酵液、0.5g/L发酵液、0.4g/L 发酵液；用添加甘油的培养基诱导培养时pMMO蛋白表达量为分别为0.7g/L发酵液、 0.8g/L发酵液、0.7g/L发酵液、0.6g/L发酵液、0.7g/L发酵液。部分菌株蛋白电泳如图4所示，其中，泳道M为标准蛋白marker，分子量如图所 示；泳道l-3分别为阴性对照产气肠杆菌(五Mfera^"waerage"M,中国工业微生物菌 种保藏管理中心购买，编号10293)、恶臭假单胞菌(尸w^fomo"w戶^/a,中国工业 微生物菌种保藏管理中心购买，编号1029S)、施氏假单胞菌(尸M^/oww7a^加zerh 美国典型微生物菌种保藏中心购买，编号11607)在甘油培养基中的培养后蛋白电泳 情况；泳道l'-3'分别为重组菌产气肠杆菌(五wtera6acter aeragen^) pCHP、施氏假 单胞菌(尸化wt/omomxs Wwtee〃') pCHP禾口恶臭假单胞菌(尸wmc/owo"w ; w^ifl) pCHP 在甘油培养基中培养后的蛋白电泳情况；泳道4-5分别为阴性对照产气肠杆菌 (五"fero6a"er fleragwM)禾口施氏假单胞菌(尸化^/owomw 在添力口葡萄糖的 培养基中的培养后蛋白电泳情况；泳道4'-5'分别为重组菌产气肠杆菌(五ntera^cto" aerage"M) pCHP和施氏假单胞菌(/^wcfemo"as pCHP在葡萄糖培养基中 的情况。工程菌与野生型菌株相比，在24kDa附近明显多一条带，而这条带大小与 pmoC相同(蛋白电泳采用整细胞全蛋白上样，pmoA、 pmoB可能由于其它蛋白条带 的影响在电泳图中条带差别不明显)，可以说明pMMO在三株重组菌中都得到转译， 形成了三个亚基pmoC、 pmoA和pmoB。蛋白电泳图像分析软件，从整细胞蛋白的电 泳中可以发现工程菌表达pMMO的量为菌体总蛋白的5。/。以上。
权利要求
1、表达颗粒状甲烷单加氧酶的工程菌，是将表达颗粒状甲烷单加氧酶的重组表达载体导入宿主菌中，筛选得到的表达颗粒状甲烷单加氧酶的重组菌株。
2、 根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于所述重组表达载体为含有单加 氧酶的启动子及其下游连接的颗粒状甲烷单加氧酶的编码基因的可在宿主菌中表达 的载体。
3、 根据权利要求2所述的工程菌，其特征在于所述单加氧酶基因的启动子为烷烃单加氧酶基因的启动子或颗粒状甲烷单加氧酶基因的启动子；所述烷烃单加氧酶 基因的启动子的核苷酸序列为自GENBANK号为AJ302087的5'端第2008—2150 位核苷酸序列，所述颗粒状甲烷单加氧酶基因的启动子的核苷酸序列为自GENBANK 号为U31650 AF186586的5'端第34—499位核苷酸序列。
4、 根据权利要求2所述的工程菌，其特征在于所述颗粒状甲烷单加氧酶的编 码基因的核苷酸序列为自GENBANK号为U31650 AF186586的5'端第500bp— 3743bp位核苷酸序列。
5、 根据权利要求1-4中任意一项所述的工程菌，其特征在于所述工程宿主菌 为产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas ptida)、施 氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)， 甲基扭曲杆菌(Methylobacterium extroquens)、 巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)或 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
6、 根据权利要求5所述的工程菌，其特征在于所述重组表达载体是将颗粒状 甲垸单加氧酶的编码基因插入到pComlO的NdeI和HindIII酶切位点之间或将所述单 加氧酶基因的启动子及其下游连接的所述述颗粒状甲烷单加氧酶的编码基因插入到 pComlO的EcoRI和HindIII酶切位点之间得到的可表达颗粒状甲垸单加氧酶的重组 载体，所述pComlO的核苷酸序列为自GENBANK Accession Number为AJ302087的 第1-7675位核苷酸。
7、 一种表达颗粒状甲烷单加氧酶的方法，是诱导表达权利要求l一6中任意一项所述的工程菌，得到含有颗粒状甲烷单加氧酶的发酵菌液。
8、 根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述诱导表达的方法为发酵至对 数生长期的权利要求1_6中任意一项所述的工程菌的发酵液中，加入体积百分含量 为0.05%的正辛烷，在15-2(TC诱导培养5小时得到含有颗粒状甲烷单加氧酶的发酵 菌液。
全文摘要
本发明公开了一种表达颗粒状甲烷单加氧酶的方法及其专用工程菌。该方法，是诱导表达具有颗粒状甲烷单加氧酶表达活性的工程菌，得到含有颗粒状甲烷单加氧酶的发酵菌液。该工程菌，是将可表达颗粒状甲烷单加氧酶的重组表达载体导入宿主菌中，筛选得到的可表达颗粒状甲烷单加氧酶的重组菌株。所述重组表达载体为含有单加氧酶的启动子及其下游连接的颗粒状甲烷单加氧酶的编码基因的可在宿主菌中表达的载体。本发明的工程菌可高效表达颗粒状甲烷单加氧酶，可用于沼气转化为甲醇，将丙烯氧化成1，2-环氧丙烷等的催化反应。
文档编号C12N1/19GK101392233SQ200810225730
公开日2009年3月25日 申请日期2008年11月10日 优先权日2008年11月10日
发明者昊 吴, 程 杨, 皓 江, 涛 苏, 邢新会, 冰 韩 申请人:清华大学