专利名称：：一种耐热木聚糖酶及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种耐热木聚糖酶及其编码基因与应用。
背景技术：
：木聚糖酶可广泛应用于食品、饲料、医药、能源、造纸、纺织等行业。例如，在酿造工业中，木聚糖酶可以分解原材料中的(3-木聚糖，降低酿造过程中物料的粘度，促进有效物质的释放；在词料工业中，木聚糖酶可以通过降解木聚糖，降低饲料用粮中的非淀粉多糖的量，促进营养物质的吸收利用。木聚糖酶中的内切木聚糖酶(1，4-p-D-xylanohydrolase:EC3.2.1.8)，主要随机水解木聚糖主链上的(5-l，4-木糖苷键，其特殊作用决定了它是木聚糖复杂酶解过程中的关键酶。应用木聚糖酶的许多工业中，常需要高温条件，这就需要木聚糖酶具有良好的热稳定性，但是一般情况下酶在遇到高温时，其活性往往会降低甚至完全失去。工业所需的苛刻条件和酶稳定性之间的矛盾，制约着木聚糖酶技术的发展和应用，因此，亟待需要一种耐热的木聚糖酶。
发明内容本发明的目的是提供一种耐热的木聚糖酶及其编码基因。本发明所提供的木聚糖酶，来源于嗜热拟青霉(尸seciJo/^cesWe/7ff叩^7a)J18，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且编码所述木聚糖酶的由(a)衍生的蛋白质。其中，序列表中的序列2由226个氨基酸组成，分子量约为24.599Xl(y!kDa。为了使(a)中的木聚糖酶便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的N端或C端连接上如表1所示的标签。表1、标签的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>Poly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYK腦DKStrep-tagII8WSHPQFEKc—myc10EQKLISEEDL上述(a)和(b)中的木聚糖酶可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。(b)中的木聚糖酶的编码基因可通过将序列表中序列1的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。上述木聚糖酶的编码基因也属于本发明的保护范围。所述编码基因可为如下l)、2)或3)的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与l)限定的DNA序列杂交且编码所述木聚糖酶的DNA分子；3)与l)限定的DNA序列有90。/。以上同源性且编码所述木聚糖酶的DNA分子。上述严格条件是，在6XSSC，0.5。/。SDS的溶液中，在65。C下杂交，然后用2XSSC，0.1%SDS和1XSSC，0.1%SDS各洗膜一次。含有上述任一所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也属于本发明的保护范围。实验证明，本发明的木聚糖酶最适反应温度为75°C，在温度不高于60'C条件下处理30min几乎没有酶活损失，80卩时保温30min后还能残留60%的活力；其最适pH值为7.0;用本发明酶水解木聚糖的主要产物为木二糖和木三糖。本发明的木聚糖酶具有耐热特性，可广泛用于分解半纤维素中的木聚糖，生产功能性低聚糖，适合于对温度要求高的很多工业环境，具有在生产中推广应用的巨大潜力。图1为本发明的耐热木聚糖酶基因PCR和回收产物琼脂糖凝胶电泳图。图2为本发明的耐热木聚糖酶的纯化过程图。图3为本发明的耐热木聚糖酶的最适pH。图4为本发明的耐热木聚糖酶的最适温度。图5为本发明的耐热木聚糖酶水解榉木木聚糖的水解产物TLC图。具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，如《分子克隆4实验室手册》(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的方法。实施例1、木聚糖酶的编码基因"t^的分离以嗜热拟青霉(尸seci7o/^cesz^e/7^/7力W3)J18(中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，保藏号为AS3.6885)(Yang,SQ，Yan,QJ,Jiang,ZQ，Li，LT，Tian，HM，Wang，YZ.High-levelofxylanaseproductionbythethermophilic尸3eci2o,cest^e277(9//j73J18onwheatstrawinsolid—statefermentation.BioresourTechnol，2006;97:1794-1800)(中国农业大学)的cDNA序列为模板，用如下引物进行PCR扩增PT-XynA-HFWD(正向):5，—CCATGGTGATCGGTATTACCTCC-3，(含有vVcoI酶切位点)，PT-XynA-历V70TII-His-REV(反向)5，-AAGCTTGCCGACGTCAGCGACGGTGAT-3，(含有酶切位点)。PCR扩增反应混合物为:水，14.810XExTaqbuffer,2pi;2.5mraol/LdNTP，1jxl;100pmol/LPT-XynA-#coI-FTO，0.5pi;100pmol/LPT-XynA-历/2oTI1-His-REV，0.5pi;模板，1pi;Taq酶，0.2^1;反应混合物总体积为20pl。PCR扩增反应的条件为94°C5min;94°C30s，65°C30s和72°C1rain，30个循环后72。C延伸10min，然后冷却至4°C。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外下照射，切下目标DNA片段，然后采用QIAquickGelExtrationKit(Qiagen)从琼脂糖凝胶中回收DNA片段，再进行电泳检测。结果如图l所示(M为DNA分子MarkerDL2000,1为木聚糖酶基因的PCR扩增产物，2为用试剂盒回收的基因片段)，结果表明，木聚糖酶基因的PCR扩增产物的长度大小为700bp左右；用试剂盒回收的该基因片段，条带单一且浓度适当，可以用于接下来的连接实验。采用拓扑TA克隆将上述纯化得到的基因片段克隆到pMD-18T载体上，转化，用菌落PCR和提取质粒双酶切方法筛选带有重组子的菌落。用pMD-18T质粒载体上的标准引物序列作为测序引物，测插入基因的DNA序列。结果表明，插入的上述纯化得到的木聚糖酶基因(xjtl4)的全长为681bp(其核苷酸序列如序列表中序列1所示)，编码226个氨基酸(其氨基酸序列如序列表中序列2所示)，编码的蛋白(xynA)的分子量约为24.599X103kDa。将含有序列表中序列1所示木聚糖酶基因的阳性重组质粒命名为pMD-18TAf，A将核苷酸序列如序列表中序列1所示的基因序列在Genbank中进行比对，比对结果表明，本发明木聚糖酶基因与来源于7Xe_nzw/^c"7a/w&;70^AS的木聚糖酶(No.U35436)编码基因序列同源性最高(91%)，与其余来源的木聚糖酶编码基因的同源性低于75%。在设计上述引物对PT-XynA-#coI-FWD/PT-XynA-His-REV时，引物上引入了能插入pET-28a(+)质粒的Tfeol-酶切位点；在设计PT-XynA-^coI-FWD正向引物时，考虑到在表达载体中C-末端带有6XHis标签，在5'端由引物导入一个密码子突变，即ATGA承TG…一ATGG承TG…，这样翻译后从酶切位点第二个氨基酸由M变为V;根据引物设计的这一突变确保了目的基因克隆于开放阅读框内，同时具有ATG起始密码子和6XHis标签，而不会发生开放阅读框漂移。实施例2、木聚糖酶xynA的表达及性质检测在本实施例中所使用的表达载体为pET-28a(+)(Novagen公司)，靶基因克隆于pET-28a(+)载体上，使其表达置于T7噬菌体强启动子转录及翻译信号控制之下。由于大肠杆菌胞内蛋白多，设计使^7^基因的3'末端带有6XHis标签，这样表达出的目标蛋白质带有6XHistag，利用6XHistag与Ni-NTA的亲和性，可将表达出的重组蛋白进行亲和层析提纯，这样可方便快速地纯化表达的酶。一、木聚糖酶基因XJ77J的亚克隆将上述pMD-18T/xynA质粒，用一对限制性内切酶辰ot和历/7oHI酶切，电泳，在紫外下照射，迅速切下目标DNA，然后采用QIAquickGelExtrationKit(Qiagen)从琼脂糖凝胶中回收DNA片段；用限制性内切酶和酶切pET-28a(+)载体(Novagen公司)，将酶切回收的DNA片段和pET-28a(+)载体混合，并加入T4DNALigase(TaKaRa)，在16。C下连接4h，然后用热激法转入感受态细胞￡BL21(Novagen公司)，将100pl菌液涂在含卡那霉素抗性的LB平板上，37。C培养过夜，将生长出的单菌落标号，采用菌落PCR法筛选带重组质粒的菌落。提取阳性菌落的重组质粒，进行双酶切电泳和DNA序列测定。测序结果表明，测定的重组xy/^基因序列由722对碱基组成(其核苷酸序列如序列表中序列3所示)[该序列是在序列表中序列1所示序列的基础上有以下变化在起始位置加上两个碱基CC，后面接上ATG(起始密码子)，再接GTG，中间与序列表中序列1的相同，终止密码子前加入AAGCTT(历'7oni酶切位点)，以及GCGGCCGCACTCGAG(pET-28载体上的序列)和六个组氨酸CACCACCACCACCACCAC)]，编码239个氨基酸(序列表中序6列4所示)(起始位置由于加入AfcoI酶切位点，第二个氨基酸由M变为V，终止密码子前加入的氨基酸为KLAAALEHHHHHH)，计算分子量约为26kDa。将获得的含有上述722bp核苷酸序列的阳性重组质粒命名为pET28a/xynA，将含有pET28a/xynA的菌命名为BL21-xynA。将得到的含有239个氨基酸残基的氨基酸序列，与已知木聚糖酶蛋白质氨基酸进行同源比对，结果表明，该序列与来源于7Xe，o/^ces7朋收i/oms的XynA(No.AAB94633)同源性最高，达到93%，与来源于尸aec^o/^ces的木聚糖酶(No.P81536)同源性次之，为88%，与其它木聚糖酶的同源性小于73%。通过以上基因序列及其编码的蛋白质序列的同源比较，得出来源于嗜热拟青霉J18的XynA蛋白属于F/11族木聚糖酶，并且只含有一个单一功能区。二、木聚糖酶的表达(一)酶的表达取100|il含有重组质粒pET28a/xynA的大肠杆菌BL21-xynA，于100mlLB(含50ng/ml卡那霉素)培养基中，37'C振荡培养12-16h;再以10%的接种量转接到100mlLB(含50吗/ml卡那霉素)培养基中，30°C振荡培养，当培养液0D6。。m达到0.5-0.6时，加入IPTG至终浓度1咖ol/L，诱导培养10-20h后，离心收集细胞，再用超声波破碎仪破碎细菌细胞，离心收集上清即为粗酶液。(二)酶的纯化1、Ni-NTA纯化用平衡缓冲液(50mmol/L，pH8.0，磷酸缓冲液，0.3mol/LNaCl，20raraol/L咪唑)平衡Ni-NTA(1X5cm);将上述粗酶液以0.1ml/min的速度过平衡好的Ni柱，上样结束后封柱子lh;用相同缓冲液以1.0ml/min的流速洗去未吸附的蛋白及其它杂质；接着用45mmol/L咪唑洗至基线，有少量目标蛋白被洗下来，但从电泳图观察以杂蛋白为主，未收集；用45mmol/L的咪唑溶液为起始液，以175mmol/L的咪唑溶液为终止液，进行线性梯度洗脱，洗脱速度为1ml/min，咪唑的浓度变化速度为1.3mmol/L/min，收集梯度洗脱的各管样品；待洗脱峰趋于平缓后用0.5niol/L的咪唑溶液洗脱吸附的杂质，最后用平衡缓冲液平衡柱料。对上述收集的每管样品分别进行电泳，由于已知目标蛋白的理论分子量，通过与低分子量标准蛋白的比较，即判断目标蛋白在哪些管中存在，保留电泳图上含有目标蛋白的纯度类似的各管。重复三次上述亲和纯化，将每次保存的各管样品超滤到0.8ml。2、S印hadexG50过滤将上述步骤1得到的各管0.8ml样品分别进行如下实验。用50mmol/L、pH6.0的柠檬酸缓冲液平衡S印hadexG50，将步骤1中的0.8ml样品上样于柱中，用50腿ol/L、pH6.0的柠檬酸缓冲液，以0.1ml/min的流速进行洗脱，收集洗脱下来的液体。为确定蛋白含量，测定洗脱下来的溶液的0D28。值(蛋白质分子中色氨酸、酪氨酸最大吸收峰在280nm，蛋白质OD，值与其浓度成正比，故可测定蛋白质的含量)，并将峰值附近各管电泳，通过电泳确定纯的目标蛋白在哪些管中。将粗酶液、Ni-NTA层析得到的酶液、经S印hadexG50凝胶过滤得到的酶液，分别进行电泳，电泳结果如图2所示(M为低分子量标准蛋白；l为粗酶液；2为过Ni-NTA层析得到的酶液；3为经S印hadexG50凝胶过滤得到的酶液)。结果表明，得到的蛋白与预期蛋白的分子量相符(26kDa)。将得到的蛋白的N端测15个氨基酸(Edman化学降解)，C端也测15个氨基酸(串联质谱法)，结果表明，测得的序列正确，证明得到的蛋白正确。SDS-PAGE方法按照Laemmli方法，如文献(LaemraliUK.CleavageofstructuralproteinsduringtheassemblyoftheheadofbacteriophageT4.Nature,1970，277:680-685)中所述进行。分离胶12.5%，浓縮胶4.5%，考马斯亮蓝染色显示蛋白带，低分子量标准蛋白与样品在同一条件下电泳。(三)酶活的测定1、酶活测定方法参照文献(Bailey，MJ，Biely，P，Poutanen，K.Interlaboratorytestingofmethodsforassayofxylanaseactivity.J"Biotechnol1992;23:257-70.)中所述的方法。具体步骤如下向0.9ml含有桦木木聚糖的、pH值为6.5、50mmol/L的MOPS缓冲液(桦木木聚糖在缓冲液中的终浓度为1g/100ml)中，加入O.lml步骤(一)得到的粗酶液(或0.1ml步骤(二)Ni-NTA层析得到的酶液，或0.1ml步骤(二)S印hadexG50凝胶过滤得到的酶液)，50。C反应10rain,采用DNS法(Miller,GL.Useofdinitro-salicylicacidreagentfordeterminationofreducingsugars.AnalChem1959，31:426-428.)测定产生的还原糖量，同时以D-木糖作标准。8酶活力单位(U)定义为上述反应条件下，每分钟产生l)Limol相当于D-木糖的还原糖所需要的酶量为1个酶活力单位。2、蛋白含量的测定方法采用Lowry法，如文献(Lowryetal.Proteinmeasurementwiththefolinphenolreagent.J"BiolChem，1951,193:265-275)中所述，以牛血清白蛋白作为标准蛋白绘制标准曲线。按照如上方法检测粗酶液、Ni-NTA层析得到的酶液、经S印hadexG50凝胶过滤得到的酶液中酶蛋白的量、酶比活，计算回收率和纯化倍数。其中，回收率=各步骤总酶活/粗酶总酶活，纯化倍数=各步骤比活/粗酶比活。实验设3次重复，结果取平均数。结果如表2所示。表2、耐高温木聚糖酶A的纯化表不同步骤的酶液总体积(ml)酶液中酶活(U/ml)总蛋白(mg)总酶活(u)比酶活(U/mg)回收率(%)纯化倍数粗酶液48173.2566.28315.514.71001Ni-NTA层析得到的酶液41147.311.14589.4413.555.228.1S印hadexG50层析得到的酶液2.51440.55.13601.2706.143.348.0蛋白含量以Lowry法测定，以BSA为标准。b酶活在50。C条件下测定，底物为1g/100ml桦木木聚糖，缓冲液为50mraol/LpH6.5M0PS。三、木聚糖酶的酶学性质将上述经S印hadexG50凝胶过滤得到的酶蛋白分别进行下列性质检测。(一)最适反应pH值的测定将上述经S印hadexG50凝胶过滤得到的酶蛋白，分别置于下述不同缓冲体系中，在50'C条件下，测定其活力。测酶活的方法除了所用的缓冲体系不同外，其余均与步骤二中所述的酶活测定方法相同。选择的pH值范围及体系如下(50mmol/L):拧檬酸-柠檬酸三钠pH2.5-4.5;乙酸-乙酸钠pH4-5.5;M0PS(3-吗啉丙磺酸)pH,6-8;Tris-HClpH7-9;CHES9(2-环己胺基乙磺酸)pH8-10;CAPS(3-(环已胺)-1-丙磺酸)pH9-11。通过比较这些缓冲体系下纯酶活力差异，得出酶反应的最适pH值。实验设3次重复，结果如图3所示(其中，"命"为柠檬酸-柠檬酸三钠，"■"为乙酸-乙酸钠，"A"为M0PS，"X"为Tris-HCl，"口"为CHES，"+，，为CAPS)。相对酶活的定义为不同pH下的酶活与最大酶活的百分比。将pH值为7.0(Tris-HC1)、50'C条件下，反应10min的酶活记作100%。结果表明，本发明酶的最适pH值为7.0(图3)。(二)最适反应温度的测定测定在pH值为7.0、不同温度下(即30，40，50，60，70，75，80，85，90和IOO°C)酶的活力，比较得到酶的最适反应温度。其中，除了温度不同、pH值不同，其余测酶活的方法均与步骤二中所述的酶活测定方法相同。实验设3次重复，结果如图4所示。相对酶活的定义为不同温度下的酶活与最大酶活的百分比。将pH值为7.0(Tris-HC1)、75'C条件下，反应10min的酶活记作100%。结果表明，本发明酶的最适温度为75。C。(三)pH值及温度稳定性对酶在50'C的条件下对pH稳定性进行测定，表明，该酶在pH6.5-10.5范围内能保持85%以上的酶活；将经SephadexG50凝胶过滤得到的酶蛋白在不同温度下保温30min;保温后，再于5(TC、pH值为7.0(Tris-HCl)条件下测定残余酶活力，除了pH值不同，其余测酶活的方法均与步骤二中所述的酶活测定方法相同。结果表明，该酶在温度不高于60。C条件下处理30min后几乎没有酶活损失，80。C时保温30min后残留60%的活力，因此，该酶具有良好的温度稳定性。实施例3、木聚糖酶的应用以含有榉木木聚糖或桦木木聚糖的、50mM、pH值为7.0的Tris-HCl缓冲液做底物(其中，榉木或桦木木聚糖在溶液中的终浓度为2g/100ml)，酶添加量为4U/ml底物溶液，于50'C水浴中保温12h，在不同时间(15min，30min，1h，2h，4h，6h，12h)取样进行TLC分析。TLC条件硅胶板(60F254，E.Merk，德国)在2:1:1的正丁醇-乙酸-水系统中展层2次后，在其表面均匀喷洒5%硫酸甲醇溶液，吹干在IOO'C显色。标准为木寡糖混合物。TLC结果表明，该酶水解榉木木聚糖终产物以木二糖和木三糖为主(图5，A为木糖，B为木二糖，C为木三糖，D为木四糖，E为木五糖)，水解桦木木聚糖也以木二糖和木三糖为主，因此该酶可用于水解半纤维素生产低聚木糖。序列表<160〉4<210〉1<211>681〈212>DNA<213〉拟青霉属嗜热拟青霉(尸sed7o历/cesz^e/wop/^^g)<400〉1atgatgatcgttcccgacagtggcacgatg3acctggsagaagggttggs3tcgttgagsgsgtgcgscggacggcstccaccgtccsg3gaccactsctsccgtcgctggtattacctcggaatactacgct3ttactsgcggcaccta3ccctggsctgttscctcgcacttcggcscgtsgc3cct3as3ctttcg3cgggctgccaaccsgatcgt3cgtcggct3ctttgctctcggagctcgaactcctggtggcgagattagcgaacgcaaggggtttacggtctscgstccctcgactcggcccagtactggcttcgacgcctgcgacggaggcggcattggaagcgacsgaagtgacggtgtggggcgatggccsttcscttggacccgcatcctcggatg3sgagcactctcggtccgcctgggctcgcgggctacttcaccgctactggCC3CCCCt33gagcccaggcgcggtaacctttgscggtgt3cccgctcgtccaccgacctgttacaacgcagaacaagcgctggtttgaagcagcggctaggccctggccctcggaaggcC3cgt3C3cccgtcggcggattsccagccccgagtactacgggtaccgtg3cct3gcstcctccagcggccgttaacggttgctcgcatc6816012018024030036042048054060〇660〈210〉2〈211〉226〈212〉Pro〈213〉拟青霉属嗜热拟青霉(/^ecW，/ces^e/m^^7a)<400〉2MetMetlieGlylieThrSerPheAlaLeuAlaAlaLeuAlaAlaThr151015GlyAlaLeuAlaPheProThrGlyAsnThrThrGluLeuGluLysArg202530GinThrThrProAsnSerGluGlyTrpHisAspGlyTyrTyrTyrSer354045TrpTrpSerAspGlyGlyAlaGinAlaThrTyrThrAsnLeuGluGly505560GlyThrTyrGlulieSerTrpGlyAspGlyGlyAsnLeuValGlyGly65707580LysGlyTrpAsnProGlyLeuAsnAlaArgAlalieHisPheAspGly12859095ValTyrGinProAsnGlyAsnSerTyrLeuAlaValTyrGlyTrpThr100105110ArgAsnProLeuValGluTyrTyrlieValGluAsnPheGlyThrTyr115120125AspProSerSerAspAlaThrAspLeuGlyThrValGluCysAspGly130135140SerThrTyrArgLeuGlyLysSerThrArgTyrAsnAlaProSerlie145150155160AspGlylieGinThrPheAspGinTyrTrpSerValArgGinAsnLys165170175ArgSerSerGlyThrValGinThrGlyCysHisPheAspAlaTrpAla180185190ArgAlaGlyLeuAsnValAsnGlyAspHisTyrTyrGinlieValAla195200205ThrGluGlyTyrPheSerSerGlyTyrAlaArglieThrValAlaAsp210215220ValGly225<210〉3<211〉722<212〉DNA<220〉<223>〈400>3ccatggtgatccttcccgscccascctggagaasgggttgcca3cggc333C3tcgttgatggagtgcgatcg3cggcstgcaccgtccagtgaccactatcsccgtcgccggtattsccagggaatacttggct3ttscaggcggcaccgaaccctggacsgttacctcgaacttcggccggtagcacccca33ctttcgacgggctgcctsccsgstctgscgtcggctcctttgctcacggagctcgtactcctggttacgagattactgaacgcaagcggtttacg3cct3cgstctatcgactcggaccagtactcacttcgacggttgcgacggaagcttgcggtcgcggcattggsgtgscgggctggggcgagggccattcagttggacccgcctcctcggsgcaagagcacggtcggtccgcctgggctcgsgggctscttccgcactcg3ggccgctactgsccsccccttggagcccagtggcggtaacctttgscggtC33cccgctctgccaccgactcgttsca3Cccaga3C33gcgctggtttgcsgcagcggcgcscc3cc3cggggccctgg60120gccacgtacs180ctcgtcggcg240gtttaccagc300gtcgsgtact360ctgggtaccg420gcacctagca480cgctccagcg540600tatgctcgca660C3CC3CC3Ct720722〈210〉4<211〉239<212>Pro<220><223〉<400>4MetVallieGlylieThrSerPheAlaLeuAlaAlaLeuAlaAlaThr151015GlyAlaLeuAlaPheProThrGlyAsnThrThrGluLeuGluLysArg202530GinThrThrProAsnSerGluGlyTrpHisAspGlyTyrTyrTyrSer354045TrpTrpSerAspGlyGlyAlaGinAlaThrTyrThrAsnLeuGluGly50556014GlyThrTyrGlulieSerTrpGlyAspGlyGlyAsnLeuValGlyGly65707580LysGlyTrpAsnProGlyLeuAsnAlaArgAlalieHisPheAspGly859095ValTyrGinProAsnGlyAsnSerTyrLeuAlaValTyrGlyTrpThr100105110ArgAsnProLeuValGluTyrTyrlieValGluAsnPheGlyThrTyr115120125AspProSerSerAspAlaThrAspLeuGlyThrValGluCysAspGly130135140SerThrTyrArgLeuGlyLysSerThrArgTyrAsnAlaProSerlie145150155160AspGlylieGinThrPheAspGinTyrTrpSerValArgGinAsnLys165170175ArgSerSerGlyThrValGinThrGlyCysHisPheAspAlaTrpAla180185190ArgAlaGlyLeuAsnValAsnGlyAspHisTyrTyrGinlieValAla195200205ThrGluGlyTyrPheSerSerGlyTyrAlaArglieThrValAlaAsp210215220ValGlyLysLeuAlaAlaAlaLeuGluHisHisHisHisHisHis22523023权利要求1、一种木聚糖酶，选自如下(a)或(b)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且编码所述木聚糖酶的由(a)衍生的蛋白质。2、权利要求l所述木聚糖酶的编码基因。3、根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述编码基因选自如下l)、2)或3):1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与l)限定的DNA序列杂交且编码所述木聚糖酶的DNA分子；3)与l)限定的DNA序列有9(^以上同源性且编码所述木聚糖酶的DNA分子。4、含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体。5、含有权利要求2或3所述编码基因的重组菌。6、含有权利要求2或3所述编码基因的转基因细胞系。7、含有权利要求2或3所述编码基因的表达盒。8、权利要求l所述木聚糖酶在降解半纤维素中的应用。全文摘要本发明公开了一种木聚糖酶及其编码基因与应用。该木聚糖酶是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且编码所述木聚糖酶的由(a)衍生的蛋白质。实验证明，本发明的木聚糖酶在温度不高于60℃条件下处理30min几乎没有酶活损失，其最适反应温度为75℃，最适pH值为7.0；用本发明酶水解木聚糖的主要产物为木二糖和木三糖。本发明的木聚糖酶具有耐热特性，可广泛用于分解半纤维素中的木聚糖，生产功能性低聚糖，适合于对温度要求高的很多工业环境，具有在生产中推广应用的巨大潜力。文档编号C12N9/42GK101659948SQ20081022573公开日2010年3月3日申请日期2008年11月10日优先权日2008年11月10日发明者敏张,李里特,杨绍青,江正强,闫巧娟申请人:中国农业大学