专利名称：：可激发机体对鼠疫产生免疫力的保护性抗原组合物及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种组合物及其应用，特别是涉及一种可激发机体对鼠疫产生免疫力的保护性抗原组合物及其在制备鼠疫疫苗中的应用。
背景技术：
：鼠疫是由鼠疫耶尔森氏菌引起的烈性传染病。人类鼠疫按发病形式分为三种腺鼠疫、肺鼠疫和败血症鼠疫。近年来，世界鼠疫疫情呈上升趋势，2000年世界卫生组织将鼠疫列为重新抬头的传染病(WHO:humanplaguein1998and1999.『ee^y印j'cfe肌'oA^icaJrecord2000，75:338-343.)。此外，鼠疫耶尔森氏菌又是一种潜在的生物战剂和生物恐怖剂，美国已将鼠疫耶尔森氏菌列为恐怖分子最有可能使用的六个生物剂之一。鼠疫灭活疫苗仅对腺鼠疫具有一定的保护作用，而且保护时间短，因此这类疫苗不适合于人规模的预防接种。美军曾在越战中使用的USP灭活疫苗于1999年停止生产。EV76疫苗株是最好的减毒活疫苗，能提供早期的保护作用，减毒活疫苗虽比灭活疫苗有效，但有时副作用严重，存在毒力返强的危险，而且减毒活疫苗对肺鼠疫也无保护作用(RussellP，EleySM，HibbsSE,MancheeRJ,StaggA丄TitballRW:AcomparisonofPlaguevaccine,USPandEV76vaccineinducedprotectionagainstYersiniapestisinamurinemodel.Kaccf^e1995，13(16):155H556.)。亚单位疫苗能够克服传统疫苗的许多缺陷，不含感染性组分，无致病性，而且对腺鼠疫和肺鼠疫均具有一定的免疫保护作用。因此，亚单位疫苗研究成为当前鼠疫疫苗研究的热点。鼠疫耶尔森氏菌的主要保护性抗原是F1(荚膜抗原)(AndrewsGP，HeathDG,AndersonGW,Jr.，WelkosSL,FriedlanderAM:Fraction1capsularantigen(Fl)purificationfromYersiniapestisC092andfromanEscherichiacolirecombinantstrainandefficacyagainstlethalplaguechallenge,i>7/e"/tm/朋1996，64(6):2180-2187.)和LcrV(V-抗原)(AndersonGW，Jr.，LearySE，WilliamsonED，TitballRW，WelkosSL，WorshamPL,FriedlanderAM:RecombinantVantigenprotectsmiceagainstpneumonicandbubonicplaguecausedbyFl-capsule-positiveand-negativestrainsofYersiniapestis./"/ecti"皿;w71996，64(11):4580-4585.)。Fl抗原由鼠疫耶尔森氏菌pMTl质粒上的Fl操纵子编码，以多聚体的形式在细胞表面形成荚膜，F1抗体通过阻断F1蛋白的抗吞噬作用从而具有免疫保护作用(DuY，RosqvistR，ForsbergA:Roleoffraction1antigenofYersiniapestisininhibitionofphagocytosis.7>j/ecf/卿〃/72002,70(3):1453-1460.)。V抗原是一种多功能蛋白，与鼠疫耶尔森氏菌的抗吞噬能力有关，除具有免疫保护作用外还具有免疫抑制作用(PetterssonJ,HolmstromA，Hill丄LeaxyS，Frithz-LindstenE,vonEuler-MatellA，CarlssonE，TitballR,ForsbergA,Wolf-WatzH:TheV-antigenofYersiniaissurfaceexposedbeforetargetcellcontactandinvolvedinvirulenceproteintranslocation.#oJi/z.croZio/1999，32(5):961-976.)。现已发现V抗原产生免疫抑制作用的区段，通过去掉V抗原免疫抑制活性的区段，将其余部分连接在一起(命名为rV10)，可有效降低V抗原的免疫抑制作用，同时保留免疫保护活性(KatieA.0verheim，R.WilliamDePaolo,KristinLDeBord:IxrVPlagueVaccinewithAlteredImmunomodulatoryProperties.INFECTIONANDIMMUNITY2005，73(8):5152-5159.)。虽然基于F1抗原与V抗原的新型疫苗对腺鼠疫和肺鼠疫均有效，但Fl抗原不能代表鼠疫耶尔森氏菌的全部毒力(TitballRW，WilliamsonED:Yersiniapestis(plague)vaccines.(9;w'/77力er2004，4(6):965-973.)。最近，研究人员发现在云南感染东方型鼠疫耶尔森氏菌的病人血清中检测不到V抗原的抗体，提示某些鼠疫菌株的V抗原不具有免疫保护作用(LiB，JiangL，SongQ，YangJ,ChenZ，GuoZ，ZhouD,DuZ，SongY，WangJ"aJ:ProteinmicroarrayforprofilingantibodyresponsestoYersiniapestislivevaccine./鹏""2005，73(6):3734-3739.)。
发明内容本发明提供了一种可激发机体对鼠疫产生免疫力的保护性抗原组合物。本发明所提供的可激发机体对鼠疫产生免疫力的保护性抗原组合物，是按重量份数比为1-2:2-1混合的天然Fl抗原与rV270抗原的组合物。所述rV270抗原为V抗原(全长326个氨基酸)的自氨基端第1-270位氨基酸残基，具有序列表中序列i的氨基酸残基序列。所述rV270抗原可为经发酵表达的重组rV270抗原，表达方法可为先根据已知的V抗原基因的核苷酸序列，避开V抗原产生免疫抑制作用的区段设计带有裂解酶切割位点的引物，再在此引物的引导下扩增带有裂解酶切割位点的rV270抗原基因，然后将含有上述带有裂解酶切割位点的rV270抗原基因的重组表达载体导入宿主细胞进行表达，最后将表达产物进行柱纯化，并在纯化过程中用裂解酶切除His标签，得到重组rV270抗原。所述扩增带有裂解酶切割位点的rV270抗原基因的引物对可具有序列表中序列2和序列3的核苷酸序列或序列表中序列4和序列5的核苷酸序列。所述宿主可为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动，胞、昆虫细胞或枯草杆菌等，优选为大肠杆菌。所述大肠杆菌可为Ecoh'BL21(DE3)、Eco力'DH5a或￡T叩IO等。用于构建所述含有rV270抗原基因的表达载体的出发载体可为任意一种可在大肠杆菌中表达外源基因的原核表达载体，如pET32a、pET28a、pET24a、pET-lie或pET-22b等。以pET28a为出发载体，构建的含有带有裂解酶切割位点的rV270抗原基因的表达载体为pET28a-Xa/rV270或pET28a-Enterokinase/rV270。上述重组表达载体均可按照常规方法构建。将上述重组表达载体转化宿主菌的方法可为生物工程领域中常用的转化方法，如热激法、电转化法、接合转化法、PEG介导的原生质体转化法等。培养含有本发明的带有裂解酶切割位点的rV270抗原基因的宿主细胞的培养基和培养条件，均可为培养出发宿主细胞的培养基和培养条件。发酵重组大肠杆菌时需加入IPTG诱导剂，所加入IPTG的浓度为0.8-1.2mM，诱导温度为30-37t:，诱导时间为3-4小时。所述裂解酶可为Xa或肠激酶。所述纯化柱可为Co"亲和层析柱或Ni"亲和层析柱和S印hacrylS-200HR凝胶柱。所述天然F1抗原的提取、纯化方法，是先从鼠疫耶尔森氏菌培养物中分离培养上清和菌体沉淀，再利用饱和硫酸铵沉淀从培养上清中以及利用玻璃珠从菌体沉淀中分别提取出多部分鼠疫耶尔森氏菌天然F1抗原粗蛋白，再将各部分鼠疫耶尔森氏菌天然Fl抗原粗蛋白各自通过饱和硫酸铵沉淀、凝胶过滤得到多部分纯化的鼠疫耶尔森氏菌天然F1抗原。具体来讲，上述鼠疫耶尔森氏菌天然F1抗原的提取、纯化方法，可包括以下获取第一部分至第四部分任意一种鼠疫耶尔森氏菌天然F1目标抗原的必要步骤1)鼠疫耶尔森氏菌的培养将鼠疫耶尔森氏菌接种到添加质量/体积(W/V)百分浓度为0.1-0.3%木糖的心脑浸液培养基中，在35-4(TC下培养12-96h;2)对步骤l)得到的鼠疫耶尔森氏菌培养物进行离心，分离出上清和菌体沉淀；3)鼠疫耶尔森氏菌天然F1抗原粗蛋白的提取将步骤2)分离出的上清用30-50。^(W/V)饱和硫酸铵沉淀，盐析，再离心，分离出上清和沉淀，弃掉上清，得到A部分粗蛋白；将步骤2)分离出的菌体沉淀用PBS缓冲液重悬后，加入玻璃珠，在35-40。C、100-400rpm下振摇12-24h，再离心，分离出用于提取B部分和C部分粗蛋白的上清和用于提取D部分粗蛋白的菌体沉淀；将用于提取B部分和C部分粗蛋白的上清用30-50%饱和硫酸铵沉淀，盐柝，再离心，弃掉上清，将沉淀用0.005-0.015M的PB缓冲液重新溶解后，再用20-30%饱和硫酸铵沉淀，盐析，离心，分离出含B部分粗蛋白的上清和含C部分粗蛋白的沉淀；将用亍提取D部分粗蛋白的菌体沉淀重悬于0.005-0.015M的PBS缓冲液中，超声，离心，弃掉沉淀，将上清用30-50%饱和硫酸铵沉淀，盐析，再离心，分离出上清和沉淀，弃掉上清，得到D部分粗蛋白；4)将步骤3)获得的A部分粗蛋白溶于0.005-0.015M的PBS缓冲液中后，用20-30%饱和硫酸铵沉淀，盐析，离心，弃掉沉淀，将上清再用1-10%饱和硫酸铵沉淀，盐析，离心，弃掉上清，将沉淀溶于0.005-0.015M的PBS缓冲液中，过S印hacrylS-200HR凝胶柱，洗脱液为pH7.5-8.5、0.005-0.015M的Tris-HCl缓冲液，透析，得到第一部分天然F1抗原纯化蛋白。5)将步骤3)获得的含B部分粗蛋白的上清用1-10%饱和硫酸铵沉淀，盐析，离心，弃掉上清，将沉淀重新溶于0.005-0.015M的PB缓冲液中，过S印hacrylS-200服凝胶柱，洗脱液为pH7.5-8.5、0.005-0.015M的Tris-HCl缓冲液，透析，得到第二部分天然F1抗原纯化蛋白；6)将步骤3)获得的含C部分粗蛋白的沉淀溶于0.005-0.015M的PB缓冲液中，再用20-30%饱和硫酸铵沉淀，盐析，离心，弃掉沉淀，将上清用1_10%饱和硫酸铵沉淀，离心，弃掉上清，将沉淀重新溶于0.005-0.015M的PB缓冲液中，过S印hacrylS-200服凝胶柱，洗脱液为pH7,5-8,5、0.005-0.015M的Tris-HCl缓冲液，透析，得到第三部分天然Fl抗原纯化蛋白；7)将步骤3)获得的D部分粗蛋白溶于0.005-0.015M的PB缓冲液中，用20-30%饱和硫酸铵沉淀，盐析，离心，弃掉沉淀，将上清用1-10%饱和硫酸铵沉淀，盐析，离心，弃掉上清，将沉淀重新溶于0.005-0.015M的PB缓冲液中，过S印hacrylS-200HR凝胶柱，洗脱液为pH7.5-8.5、0.005-0.015M的Tris-HC1缓冲液，透析，得到第四部分天然F1抗原纯化蛋白；第一至第四部分天然F1抗原纯化蛋白(成分相同)中的一种或它们之间任意几种组合的混合产物(混合比例任意)构成所要的鼠疫耶尔森氏菌天然F1目标抗原。在上述鼠疫耶尔森氏菌天然F1抗原的提取、纯化方法中，步骤l)所用的鼠疫耶尔森氏菌可为任意可产生F1抗原的鼠疫耶尔森氏菌菌株，如鼠疫耶尔森氏菌EV76疫苗株、EV40疫苗株、Tjiwidej株、A1122株、M23、P175或0Uen等，优选为鼠疫耶尔森氏菌EV76疫苗株。步骤l)中所述心脑浸液培养基中木糖的质量/体积百分浓度优选为0.2%;鼠疫耶尔森氏菌的培养温度优选为37°C，培养时间优选为72h。'此外，为提供菌体的生长速率，步骤l)中在鼠疫耶尔森氏菌的培养过程中可对其进行振荡培养，振荡速率可为100-400rpm。步骤3)中的超声条件为5秒间5秒，时间为30min。步骤3)至步骤7)中30-50%饱和硫酸铵均优选为40%饱和硫酸铵，20-30%饱和硫酸铵均优选为25%饱和硫酸铵，1-100%饱和硫酸铵均优选为5%饱和硫酸铵；盐析条件均为；在3-5r下盐析5-20h，优选为在4"下盐析12h;所述PB缓冲液的浓度均优选为0.OIM，PBS缓冲液的浓度均优选为0.01M;步骤2)至步骤7)中的离心条件均为在4000-12000rpm下离心20-40min。步骤4)至步骤7)中S印hacrylS-200HR凝胶柱的洗脱液均优选为pH8.0、0.01M的Tris-HCl缓冲液；所用的透析液为O.005-0.015M的PBS缓冲液，优选为0.01M的PBS缓冲液。步骤4)至步骤7)中得到的四部分天然F1抗原纯化蛋白均为本发明所要得到的鼠疫耶尔森氏菌天然Fl抗原。本发明的第二个目的是提供一种鼠疫亚单位疫苗。本发明所提供的鼠疫亚单位疫苗的活性成份为上述可激发机体对鼠疫产生免疫力的保护性抗原组合物。需要的时候，在上述疫苗中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、吸收促进剂等。为获得更好的免疫效果，本发明的疫苗中还可以加入CpG、MF59、A1(0H)3和CTB等佐剂中的一种或多种作为免疫佐剂。上述疫苗的用量一般为0.5-2pg/kg体重/次，21天免疫一次，共需免疫2次。剂量和免疫次数可根据实际情况调整。本发明提供了可激发机体对鼠疫产生免疫力的保护性抗原组合物。该保护性抗原组合物是将天然Fl抗原与rV270抗原组成不同的疫苗配方，并通过动物实验评价了疫苗的免疫保护作用。结果表明天然Fl抗原与重组rV270抗原构成的保护性抗原组合物对鼠疫菌引起的小鼠、豚鼠和兔感染具有良好的免疫保护作用，且安全性较高，可用于制备鼠疫亚单位疫苗。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。图1为rV270蛋白的12%SDS-PAGE电泳检测结果图2为rV270蛋白的Westernblot鉴定结果具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，第三版，2002，科学出版社)。所用弓I物合成工作由上海英骏公司完成。实施例1、利用pET28a和凝血酶Xa因子制备不带标签的rV270抗原蛋白一、引物设计依据鼠疫菌LcrV基因的核苷酸序列，设计合成带有Xa因子酶切位点的一对寡核苷酸引物，上游引物为5-CGCGGATCdg雄g7T67ATGATTAGAGCCTACGAAC(划线部分为"朋WI酶切位点，斜体部分为Xa因子酶切位点，序列表中序列2);下游引物为5-CCGGCCAAGCTTTTAGGCAAAGTGAGATMTTC(划线部分为历'/^III酶切位点，序列表中序列3)。二、rV270基因的扩增以鼠疫菌DNA(20ng)为模板，步骤一的上、下游引物(5"M)各l"1，dNTP(10幽)3ul，10Xbuffer3yl，TaqDNA聚合酶(5U/ul)0.2^1，加无菌去离子水至总体积30ul。扩增条件为95。C预变性5min;94。C变性40sec，56。C退火40sec,72。C延伸lmin，30个循环；最后72T:延伸10min。反应结束后，对扩增产物进行l%琼脂糖凝胶电泳检测，结果获得了810bp的DNA条带，在紫外灯下检测PCR产物,用DNA纯化回收试剂盒(购自TIANGEN)纯化扩增产物。三、重组表达质粒的构建将纯化后的PCR产物和pET28a载体(购自Novagen)分别用5s/^I和历V^III进行双酶切，用咖A快速纯化试剂盒回收酶切产物。取经酶切后的载体2u1、DNA片段6u1、加T4DNA连接酶和10X缓冲液各ltil组成10ul连接体系，于4。C连接过夜(10-12小时)，然后将连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂于含O.lmg/raL卡那霉素的LB培养基平板上，37C培养过夜。四、阳性克隆的筛选与鉴定随机挑取长出的单菌落，接种于5mL含0.lmg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37。C培养过夜。培养结束后，取5ul菌液，置沸水中煮沸5min，用上清作模板，在步骤一上、下游引物的引导下进行PCR扩增筛选出正确的阳性克隆，送交奥科生物制品有限公司测序，测序结果用DNAStar软件进行分析。结果表明克隆的基因序列与已报道的该基因序列完全一致，说明rV270基因已成功克隆到载体中，将构建的含有带裂解酶切割位点的rV270抗原基因的表达载体命名为pET28a-Xa/rV270。五、rV270抗原的诱导表达将鉴定正确的阳性克隆接种于含O.lmg/mL卡那霉素的LB培养基中，37。C培养至OD600为0.60.8时，加入终浓度为lmmoL/mL的IPTG溶液诱导培养4h。培养结束后，离心收集菌体，经超声波破碎后离心，分别收集上清和沉淀，用SDS-PAGE电泳分析表达情况。结果表明rV270抗原蛋白主要以可溶性方式表达。六、表达蛋白的纯化将Co2+亲和层析柱(购自AmershamBiosciences)用平衡液(O.05MTris-HC1缓冲液)平衡，培养菌经超声波超声后离心收集上清，用0.05MTris-HCl缓冲液稀释至200mL，加入0.5MNaCl，调节PH值至7.2，将处理过样品上Co"亲和层析柱。先用200mLwashbuffer洗柱，再用含0.5MNaCl的0.01MPBS缓冲液洗柱。用0.01MPBS溶解Xa，上样充分与柱中的蛋白结合，4。C反应24h，然后用含O.3MNaCl的0.05MPBS缓冲液洗脱，收集出现目的吸收峰的流出液。得到样品过0.01MPBS(PH值7.2)平衡后的S印hacrylS-200HR凝胶柱(购自AmershamBiosciences)，继续用0.01MPBS(PH值7.2)洗脱柱子，待出现目的紫外吸收峰时收集流出液。将流出液用0.01MPBS(PH值7.2)透析液透析12h，每4h换一次透析液，用12%SDS-PAGE电泳分析纯化的蛋白，结果图l所示(泳道l:S印hacrylS-200服凝胶柱纯化后的结果；泳道2:Xa切割与Co2+亲和层析柱纯化结果；泳道M:分子量标准。)。结果表明经凝血酶Xa因子切除HIS标签和CcZ+亲和层析柱纯化后，多数杂蛋白已被除去，只在66.2kDa处有一弱杂蛋白条带。用S印hacrylS-200服凝胶柱纯化后，66.2kDa杂蛋白条带消失，得到分子量大小与目的蛋白理论值29.7kDa基本相应的rV270抗原蛋白。七、rV270蛋白的鉴定1、Westernblot鉴定目的蛋白将不同浓度的rV270蛋白进行蛋白电泳，切下前两个蛋白条带进行考马斯亮染色作对照。剩下的蛋白条带转膜，转膜后用TBS缓冲液洗3次，然后与兔抗V抗原IgG(参考文献制备CowanC,PhilipovskiyAV，Wulff-StrobelCRetal:Anti-LcrVAntibodyInhibitsDeliveryofYopsby/ei^i/^'apestj'sKIM5byDirectlyPromotingPhagocytosis2005,73(9):6127-6137.)反应lh，再用TBS缓冲液洗膜3次，加辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG(购自达科为生物技术有限公司)反应lh，用TBS缓冲液洗膜3次，最后用DAB显色，结果如图2所示(泳道l:rV270蛋白考马斯亮染色结果；泳道2:低分子量蛋白标准；泳道3-4:不同稀释度rV270蛋白(31:2，41:5)与抗体(一抗I:IOOO，二抗1:4000)反应结果；泳道5:不加一抗的阴性对照。)。Westernblot结果表明，rV270蛋白与兔抗V抗原IgG呈特异性反应，而不加一抗的阴性对照无特异性反应条带，表明本发明表达纯化的rV270蛋白具有良好的抗原性。2、rV270蛋白N-端测序将纯化的rV270蛋白送交军事医学科学院仪器分析中心测序，测定序列与序列表中序列1一致，其N端15个氨基酸测序结果为MIRAYEQNPQHFIED，证明经表达获得了序列正确的rV270蛋白。实施例2、利用pET28a和肠激酶制备不带标签的rV270抗原蛋白一、引物设计依据鼠疫菌LcrV基因的核苷酸序列，设计合成带有肠激酶酶切位点的一对寡核苷酸引物，上游引物为5-CGGGGTACC(￡4，aTGATTAGAGCCTACGAAC(划线部分为^D/2l酶切位点，斜黑体部分为肠激酶酶切位点，序列表中序列4);下游引物为5-CGGAATTCTTAGGCAAAGTGAGATAATTC(划线部分为fcoWI酶切位点，序列表中序列5)。二、rV270基因的扩增以鼠疫菌DNA(20ng)为模板，步骤一的上、下游引物(5uM)各lu1，dNTP(10MM)3ul，10Xbuffer3ul，TaqDNA聚合酶(5U/ul)0.2u1，加无菌去离子水至总体积30nl。扩增条件为95。C预变性5min;94。C变性40sec，56。C退火40sec，72。C延伸lrain，30个循环；最后72r延伸10min。反应结束后，对扩增产物进行l%琼脂糖凝胶电泳检测，结果获得了810bp的DNA条带，在紫外灯下检测PCR产物，用DNA纯化回收试剂盒(购自TIANGEN)纯化扩增产物。三、重组表达质粒的构建将纯化后的PCR产物和pET28a载体(购自Novagen)分别用《/wI和5boiI进行双酶切，用DNA快速纯化试剂盒回收酶切产物。取经酶切后的载体2nl、DNA片段6ul、加T4DNA连接酶和10X缓冲液各lul组成10ul连接体系，于4"连接过夜(10-12小时)，然后将连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂于含O.lrog/mL卡那霉素的LB培养基平板上，37C培养过夜。四、阳性克隆的筛选与鉴定随机挑取长出的单菌落，接种于5mL含0.lmg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37。C培养过夜。培养结束后，取5ul菌液，置沸水中煮沸5min，用上清作模板，在步骤一上、下游引物的引导下进行PCR扩增筛选出正确的阳性克隆，送交奥科生物制品有限公司测序，测序结果用DNAStar软件进行分析。结果表明克隆的基因序列与已报道的该基因序列完全一致，说明rV270基因已成功克隆到载体中，将构建的含有带裂解酶切割位点的rV270抗原基因的表达载体命名为pET28a-Eenterokinase/rV270。五、rV270抗原的诱导表达将鉴定正确的阳性克隆接种于含O.lmg/mL卡那霉素的LB培养基中，37'C培养至0D600为0.60.8时，加入终浓度为lmmoL/mL的IPTG溶液诱导培养4h。培养结束后，离心收集菌体，经超声波破碎后离心，分别收集上清和沉淀，用SDS-PAGE电泳分析表达情况。结果表明rV270抗原蛋白主要以可溶性方式表达。六、表达蛋白的纯化将(]02+亲和层析柱(购自AmershamBiosciences)用平衡液(O.05MTris-HCl缓冲液)平衡，培养菌经超声波超声后离心收集上清，用0.05MTris-HCl缓冲液稀释至200raL，加入0.5MNaCl，调节PH值至7.2，将处理过样品上(V+亲和层析柱。先用200raLwashbuffer洗柱，再用含0,5MNaCl的0.01MPBS缓冲液洗柱。用0.01MPBS溶解肠激酶，上样充分与柱中的蛋白结合，4X:反应24h，然后用含O.3MNaCl的0.05MPBS缓冲液洗脱，收集出现目的吸收峰的流出液。得到样品过0.01MPBS(PH值7.2)平衡后的S印hacrylS-200HR凝胶柱(购自AraershamBiosciences)，继续用0.01MPBS(ra值7.2)洗脱柱子，待出现目的紫外吸收峰时收集流出液。将流出液用0.01MPBS(ra值7.2)透析液透析12h，每4h换一次透析液，用12%SDS-PAGE电泳分析纯化的蛋白，结果图l所示(泳道l:S印hacrylS-200服凝胶柱纯化后的结果；泳道2:Xa切割与Co2+亲和层析柱纯化结果；泳道M:分子量标准。)。结果表明经肠激酶切除HIS标签和Co2+亲和层析柱纯化后，多数杂蛋白已被除去，只在66.2kDa处有一弱杂蛋白条带。用S印hacrylS-200HR凝胶柱纯化后，66.2kDa杂蛋白条带消失，得到分子量大小与目的蛋白理论值29.7kDa基本相应的rV270抗原蛋白。七、rV270蛋白的鉴定1、Westernblot鉴定目的蛋白将不同浓度的rV270蛋白进行蛋白电泳，切下前两个蛋白条带进行考马斯亮染色作对照。剩下的蛋白条带转膜，转膜后用TBS缓冲液洗3次，然后与兔抗V抗原IgG(参考文献制备CowanC,PhilipovskiyAV，Wulff-StrobelCRetal:Anti-LcrVAntibodyInhibitsDeliveryofYopsbyyer57'"is;e5^.sKIM5byDirectlyPromotingPhagocytosis2005，73(9):6127-6137.)反应lh，再用TBS缓冲液洗膜3次，加辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG(购自达科为生物技术有限公司)反应lh，用TBS缓冲液洗膜3次，最后用DAB显色，结果如图2所示(泳道1:rV270蛋白考马斯亮染色结果；泳道2:低分子量蛋白标准；泳道3-4:不同稀释度rV270蛋白(31:2，4l:5)与抗体(一抗1:1000，二抗1:4000)反应结果；泳道5:不加一抗的阴性对照。)。Westernblot结果表明，rV270蛋白与兔抗V抗原IgG呈特异性反应，而不加一抗的阴性对照无特异性反应条带，表明本发明表达纯化的rV270蛋白具有良好的抗原性。2、rV270蛋白N-端测序将纯化的rV270蛋白送交军事医学科学院仪器分析中心测序，测定序列与序列表中序列1一致，其N端15个氨基酸测序结果为MIRAYEQNPQHFIED，证明经表达获得了序列正确的rV270蛋白。实施例3、本发明可激发机体对鼠疫产生免疫力的保护性抗原组合物免疫小鼠的抗体滴度测定和保护作用评价一、鼠疫耶尔森氏菌EV76疫苗株天然F1抗原提取、纯化以鼠疫耶尔森氏菌EV76疫苗株为例，用下述方法从鼠疫耶尔森氏菌EV76疫苗株中提取、纯化天然F1抗原，包括以下步骤1、鼠疫耶尔森氏菌EV76疫苗株的培养将鼠疫耶尔森氏菌EV76疫苗株(购自兰州生物制品研究所)接种到5mL添加0.2%(W/V，0，1-0.3%均可)木糖的心脑浸液培养基(购自BD公司，将37g培养基溶于1L纯水中)中，在37。C(35-4(TC均可)下培养24h，然后取300W菌液，再接种到2L添加0.2%(0.1-0.3%均可)木糖的心脑浸液培养基中，在37°C(35-4(TC均可)、150rpm(100-400rpm均可)下振荡培养72h。2、鼠疫耶尔森氏菌培养物的处理对步骤l得到的鼠疫耶尔森氏菌培养物进行离心(4000rpm，30min)，分离出上清和菌体沉淀。3、鼠疫耶尔森氏菌天然F1抗原粗蛋白的提取将步骤2分离出的上清用40X(W/V，30-50%均可)饱和硫酸铵沉淀，置4。C冰箱中盐析12h，再离心(8000rpm，30min)，分离出上清和沉淀，弃掉上清，得到A部分粗蛋白；将步骤2分离出的菌体沉淀用200mLPBS缓冲液(0.01M)重悬后，置于三角瓶中，加入高压灭菌后的玻璃珠，在37T:(35-40。C均可)、400rpm(100-400rpm均可)下振摇18h(12-24h均可)，再离心(12000rpm，30min)，分离出用于提取B部分和C部分粗蛋白的上清和用于提取D部分粗蛋白的菌体沉淀；将用于提取B部分和C部分粗蛋白的上清用40%(30-50%均可)饱和硫酸铵沉淀，置41:冰箱中盐析12h，再离心，弃掉上清，将沉淀用200mLPB缓冲液(0.01M)重新溶解后，再用25%(20-30%均可)饱和硫酸铵沉淀，置4"C冰箱中盐析12h，离心(8000rpm，30min)，分离出含B部分粗蛋白的上清和含C部分粗蛋白的沉淀；将用于提取D部分粗蛋白的菌体沉淀重悬于20mLPBS缓冲液(0.01M)中，超声(5秒间5秒，30min)，离心(12000rpm，30min)，弃掉沉淀，将上清用0.01M的PB缓冲液稀释至200mL后，用40%(30-50%均可)饱和硫酸铵沉淀，置4。C冰箱中盐析12h，再离心(8000rpm，30min)，分离出上清和沉淀，弃掉上清，得到D部分粗蛋白。4、第一部分天然F1抗原纯化蛋白的获得将步骤3获得的A部分粗蛋白溶于200mLPBS缓冲液(O.OIM)中后，用25%(20-30%均可)饱和硫酸铵沉淀，置4。C冰箱中盐析12h，离心(8000rpm，30min)，弃掉沉淀，将上清再用5%(1-10%均可)饱和硫酸铵沉淀，置4。C冰箱中盐析12h，离心(8000rpm，30min)，弃掉上清，将沉淀溶于15mL(10-20mL均可)PBS缓冲液(O.01M)中，过S印hacrylS-200HR凝胶柱(购自AmershamBiosciences公司)，以pH8.0、0.01M(pH7.5-8.5、0.005-0,015M均可)的Tris-HCl缓冲液为洗脱液洗柱，控制流速为1-2mL/min，收集蛋白溶液，将蛋白溶液装透析袋，置于2000mLPBS透析液(O.01M)中透析12h，每4h换一次液。将得到的纯化蛋白进行15%SDS-PAGE检测，检测结果如图2所示(泳道M为低分子量标准蛋白Marker,分子量范围为14.4-97.4kDa，泳道A为第一部分天然F1抗原纯化蛋白)，结果得到了纯度较高(98%)的17kDa的第一部分天然F1抗原蛋白。5、第二部分天然F1抗原纯化蛋白的获得将步骤3获得的含B部分粗蛋白的上清用5%(1-10%均可)饱和硫酸铵沉淀，置4。C冰箱中盐析12h，离心(8000rpm，30min)，弃掉上清，将沉淀重新溶于15raL(10-20mL均可)PB缓冲液(0.01M)中，过S印hacrylS-200HR凝胶柱，以pH8.0、0.01M(pH7.5-8.5、0.005-0.015M均可)的Tris-HCl缓冲液为洗脱液洗柱，控制流速为l-2raL/min，收集蛋白溶液，将蛋白溶液装透析袋，置于2000mLPBS透析液(0.01M)中透析12h，每4h换一次液。将得到的纯化蛋白进行15%SDS-PAGE检测，检测结果如图2所示(泳道M为低分子量标准蛋白Marker,分子量范围为14.4-97.4kDa，泳道B为第二部分天然F1抗原纯化蛋白)，结果得到了纯度较高(98%)的17kDa的第二部分天然F1抗原蛋白。6、第三部分天然F1抗原纯化蛋白的获得将步骤3获得的含C部分粗蛋白的沉淀溶于200mLPB缓冲液(0.01M)中，再用25%(20-30%均可)饱和硫酸铵沉淀，置4。C冰箱中盐析12h，离心(8000rpm，30min)，弃掉沉淀，将上清用5%(1-10%均可)饱和硫酸铵沉淀，置4'C冰箱中盐析12h，离心(8000rpm，30min)，弃掉上清，将沉淀重新溶于15mL(10-20mL均可)PB缓冲液(0.01M)中，过S印hacrylS-200HR凝胶柱，以pH8.0、0.01M(pH7.5-8.5、0.005-0.015M均可)的Tris-HC1缓冲液为洗脱液洗柱，控制流速为1-2mL/min，收集蛋白溶液，将蛋白溶液装透析袋，置于2000mLPBS透析液(0.01M)中透析12h，每4h换一次液。将得到的纯化蛋白进行15%SDS-PAGE检测，检测结果如图2所示(泳道M为低分子量标准蛋白Marker,分子量范围为14.4-97.4kDa，泳道C为第三部分天然F1抗原纯化蛋白)，结果得到了纯度较高(98%)的17kDa的第三部分天然F1抗原蛋白。7、第四部分天然F1抗原纯化蛋白的获得将步骤3获得的D部分粗蛋白溶于200raLPB缓冲液(0.01M)中，用25%(20-30。Z均可)饱和硫酸铵沉淀，置4"冰箱中盐析12h，离心(8000rpm，30min)，弃掉沉淀，将上清用5%(1-10%均可)饱和硫酸铵沉淀，置4'C冰箱中盐析12h，离心(8000rpm，30min)，弃掉上清，将沉淀重新溶于15mL(10-20mL均可)PB缓冲液(O.01M)中，过S印hacrylS-200HR凝胶柱，以pH8.0、0.01M(pH7.5-8.5、0.005-0.015M均可)的Tris-HCl缓冲液为洗脱液洗柱，控制流速为1-2mL/min，收集蛋白溶液，将蛋白溶液装透析袋，置于2000mLPBS透析液(0.01M)中透析12h，每4h换一次液。将得到的纯化蛋白进行15%SDS-PAGE检测，检测结果如图2所示(泳道M为低分子量标准蛋白Marker，分子量范围为14.4-97.4kDa，泳道D为第四部分天然Fl抗原纯化蛋白)，结果得到了纯度较高(98%)的17kDa的第四部分天然Fl抗原蛋白。步骤4至步骤7中得到的四部分天然Fl抗原纯化蛋白(成分相同)或是任意几部分的混合物(混合比例任意)均为本发明所要得到的鼠疫耶尔森氏菌天然F1抗原。二、动物免疫50只6-8周雌性BALB/c小鼠(购自军事医学科学院实验动物中心)随机分为5组，包括4个实验组，l个对照组，每组10只小鼠。将不同比例的天然F1抗原(为四部分按任意比例的混合物)和实施例1或实施例2表达的rV270抗原吸附到铝佐剂(Alum)中制成不同组合物，佐剂对照组免疫等量的铝佐剂(表l)。每个实验组小鼠分别免疫不同组合物，每只小鼠后退肌肉免疫100W，初次免疫后的第21天加强免疫一次，对照组小鼠则相应免疫等量的铝佐剂。表l组合物编号与配方<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>三、ELISA检测血清抗体滴度初次免疫后，分别于第6、8、10、12、14、16和18周尾静脉采血，用ELISA法(所用的ELISA法为常规方法，具体步骤可参见《ShortProtocolsinMolecularBiology》(FrederickM.Ausubeletal.，3rdedition,JohnWiley&Sons,Inc.，1995)。)测定抗体滴度。其主要过程为分别包被Fl抗原和rV270抗原，每孔50ng(100u1)，置4。C过夜(10-12小时)。然后用O.1%干酪素溶液封闭(200u1/孔)，置37。C孵箱2小时。以正常小鼠血清作阴性对照，加系列稀释的实验动物血清(100u1/孔)，置37。C孵箱内湿盒中30分钟。取出用洗液洗5遍后加入对应的二抗(羊抗鼠IgG，辣根过氧化物酶标记)，37i:置湿盒中20分钟。加显色液(50u1/孔)，置湿盒中37。C放10分钟，取出直接加入终止液(50nl/孔)，用光电比色测定抗体效价。结果如表2所示，免疫小鼠均产生较高的针对Fl抗原和rV270抗原的抗体滴度，表明本发明组合物能引起较高的体液免疫反应。表2组合物免疫小鼠产生的抗体滴度IgG效价(几何平均值iSD)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>四、免疫保护作用评价用下述实验检测步骤一免疫小鼠的免疫保护效力，检测方法为第一次免疫后第18周用鼠疫耶尔森氏菌141强毒株10tFU皮下注射攻毒，观察14天。结果如表3所示，铝佐剂对照组io只小鼠全部死亡，而实验组小鼠全部存活，而且健康状况良好，表明本发明的保护性抗原组合物具有良好的免疫保护作用，可用作鼠疫亚单位疫苗。表3组合物对小鼠的免疫保护结果动物免疫组合物编号攻毒剂量(CFU)存活数/总数I10610/10II10610/10小鼠III10610/10IV10610/10V1060/10实施例4、本发明可激发机体对鼠疫产生免疫力的保护性抗原组合物免疫豚鼠的抗体滴度测定和保护作用评价一、动物免疫将28只6-8周雌性豚鼠(购自军事医学科学院实验动物中心)随机分为2组，包括1个实验组和1个对照组，每组14只。实验组豚鼠免疫组合物III，对照组免疫V，初次免疫后的第21天加强免疫一次。二、ELISA检测血清抗体滴度初次免疫后，分别于第3、6、8、10、12和14周耳静脉采血，用ELISA法(所用的ELISA法为常规方法，具体步骤可参见《ShortProtocolsinMolecularBiology》(FrederickM.Ausubeletal.，3rdedition,JohnWiley&Sons,Inc.，1995)。)测定抗体滴度。其主要过程为分别包被Fl抗原和rV270抗原，每孔50ng(100!xl)，置4。C过夜(10-12小时)。然后用O.1%干酪素溶液封闭(200ul/孔)，置37。C孵箱2小时。以正常豚鼠血清作阴性对照，加系列稀释的实验动物血清(100ul/孔)，置37。C孵箱内湿盒中30分钟。取出用洗液洗5遍后加入对应的二抗(羊抗豚鼠IgG，辣根过氧化物酶标记)，37。C置湿盒中20分钟。加显色液(50ul/孔)，置湿盒中37X:放10分钟，取出直接加入终止液(50iil/孔)，用光电比色测定抗体效价。结果如表4所示，免疫豚鼠产生了针对Fl抗原和rV270抗原的抗体，但抗体滴度低于小鼠。表4组合物免疫豚鼠产生的抗体滴度Anti-Fl/rV270IgGtitres(Geometricmean±SD)Day21Day42Day56Day70Day84Day98280±7/5926±2/4703±2/2743±3/2743±3/2352±3/421±84454±71739±5394±122153±21950土2三、免疫保护作用评价第一次免疫后第14周用鼠疫耶尔森氏菌141强毒株106CFU皮下注射攻毒，观察14天。结果如表5所示，对照组14只小鼠全部死亡，而实验组小鼠存活12只，表明本发明提供的保护性抗原组合物对豚鼠也具有免疫保护作用。.表5组合物对豚鼠的免疫保护结果动物免疫组合物编号攻毒剂量(CFU)存活数/总数豚鼠IIIV10610612/140/14实施例5、本发明可激发机体对鼠疫产生免疫力的保护性抗原组合物免疫兔的抗体滴度测定和保护作用评价一、动物免疫将12只1.5-2kg体重新西兰兔(购自军事医学科学院实验动物中心)随机分为2组，包括l个实验组和l个对照组，每组6只。实验组兔免疫组合物III，对照组免疫V，初次免疫后的第21天加强免疫一次。二、ELISA检测血清抗体滴度初次免疫后，分别于第3、6、8、10、12和14周耳静脉采血，用ELISA法(所用的ELISA法为常规方法，具体步骤可参见《ShortProtocolsinMolecularBiology》(FrederickM.Ausubeletal.，3rdedition,JohnWiley&Sons,Inc.，1995)。)测定抗体滴度。其主要过程为分别包被Fl抗原和rV270抗原，每孔50ng(100ul)，置4匸过夜(10-12小时)。然后用O.1%干酪素溶液封闭(200ul/孔)，置37'C孵箱2小时。以正常兔血清作阴性对照，加系列稀释的实验动物血清(100ul/孔)，置37。C孵箱内湿盒中30分钟。取出用洗液洗5遍后加入对应的二抗(羊抗兔IgG，辣根过氧化物酶标记)，37t:置湿盒中20分钟。加显色液(50"1/孔)，置湿盒中37。C放10分钟，取出直接加入终止液(50"1/孔)，用光电比色测定抗体效价。结果如表6所示，免疫兔产生了针对Fl抗原和rV270抗原的抗体滴度，但产生的抗体滴度不如小鼠和豚鼠。表6组合物III免疫兔的抗体滴度<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>三、免疫保护作用评价第一次免疫后第14周用鼠疫耶尔森氏菌141强毒株106CFU皮下注射攻毒，观察14天。结果如表7所示，对照组6只兔全部死亡，而6只实验组兔存活5只，表明本发明提供的保护性抗原组合物对兔也有良好的免疫保护作用。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>序列表<160〉5<210〉1〈211〉270<212〉PRT<213>鼠疫耶尔森氏菌<400>1MetlieArgAlaTyrGluGinAsnProGinHisPhelieGluAspLeu151015GluLysValArgValGluGinLeuThrGlyHisGlySerSerValLeu202530GluGluLeuValGinLeuValLysAspLysAsnlieAsplieSerlie354045LysTyrAspProArgLysAspSerGluValPheAlaAsnArgVallie505560ThrAspAsplieGluLeuLeuLysLyslieLeuAlaTyrPheLeuPro65707580GluAspAlalieLeuLysGlyGlyHisTyrAspAsnGinLeuGinAsn859095GlylieLysArgValLysGluPheLeuGluSerSerProAsnThrGin100105110TrpGluLeuArgAlaPheMetAlaValMetHisPheSerLeuThrAla115120125AspArglieAspAspAsplieLeuLysVallieValAspSerMetAsn130135140HisHisGlyAspAlaArgSerLysLeuArgGluGluLeuAlaGluLeu145150155160ThrAlaGluLeuLyslieTyrSerVallieGinAlaGlulieAsnLys165170175HisLeuSerSerSer180LeuMetAspLysAsn195AlaSerAlaGluTyr210GinValAspGlySer225GlySerGluAsnLys245TyrSerTyrAsnLys260〈210〉2<211〉40<212〉DNA<213〉人工序列<220>〈223〉<400>2cgcggatccatcgaaggtcgtatgattagagcctacgaac40<210>3〈211〉33<212>廳〈213〉人工序列〈220>〈223〉20GlyThrlieAsnlie185TyrLeuTyrGly200LeuLysThrlie215LysGlu230ArgThrGlyAlaLysGlyHisAspLysSerlieAsn190AspGluGluliePheLys205GluLysMetProGinThrThrlie220lieValSerlieLysAspPhe235GlyAsnLeuLysAspAsnAsnGlu265Leu250LeuAsn255SerHisPheAla270Leu240Ser<400〉3ccggccaagcttttaggcaaagtgagataattc33〈210〉4<211〉43<212>DNA<213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉4cggggtaccgacgacga.cgacaagatgattaga.gccta.cgaac43〈210〉5〈211〉29<212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉5cggaattcttaggcaaagtgagataattc29权利要求1、可激发机体对鼠疫产生免疫力的保护性抗原组合物，是按重量份数比为1-22-1混合的天然F1抗原与rV270抗原的组合物。2、根据权利要求1所述的保护性抗原组合物，其特征在于所述rV270抗原为经发酵表达的重组rV270抗原，表达方法为先根据己知的V抗原基因的核苷酸序列，避开V抗原产生免疫抑制作用的区段设计带有裂解酶切割位点的引物，再在此引物的引导下扩增带有裂解酶切割位点的rV270抗原基因，然后将含有上述带有裂解酶切割位点的rV270抗原基因的重组表达载体导入宿主细胞进行表达，最后将表达产物进行柱纯化，并在纯化过程中用裂解酶切除His标签，得到重组rV270抗原。3、根据权利要求2所述的保护性抗原组合物，其特征在于所述扩增带有裂解酶切割位点的rV270抗原基因的引物对具有序列表中序列2和序列3的核苷酸序列或序列表中序列4和序列5的核苷酸序列。4、根据权利要求2所述的保护性抗原组合物，其特征在于用于构建所述含有rV270抗原基因的表达载体的出发载体为pET32a、pET28a、pET24a、pET-llc或pET-22b;以pET28a为出发载体，构建的含有带有裂解酶切割位点的rV270抗原基因的表达载体为pET28a-Xa/rV270或pET28a-Enterokinase/rV270。5、根据权利要求2所述的保护性抗原组合物，其特征在于发酵重组大肠杆菌时需加入IPTG诱导剂，所加入IPTG的浓度为0.8-1.2mM，诱导温度为30-37°C，诱导时间为3-4小时。6、根据权利要求2所述的保护性抗原组合物，其特征在于所述裂解酶为Xa或肠激酶。7、根据权利要求2所述的保护性抗原组合物，其特征在于所述纯化柱为Co2+亲和层析柱或Ni"亲和层析柱和S印hacrylS-200HR凝胶柱。8、一种鼠疫亚单位疫苗，其活性成份为权利要求1-7任一项所述的可激发机体对鼠疫产生免疫力的保护性抗原组合物。9、根据权利要求8所述的鼠疫亚单位疫苗，其特征在于所述疫苗中还包含CpG、MF59、A1(0H)3和CTB中的一种或多种作为免疫佐剂。10、根据以上权利要求所述的保护性抗原组合物或鼠疫亚单位疫苗，其特征在于:其中所述天然F1抗原是从鼠疫耶尔森氏菌EV76疫苗株中提取、纯化得到的多部分蛋白中的一部分或是任意几部分的混合物。全文摘要本发明公开了一种可激发机体对鼠疫产生免疫力的保护性抗原组合物及其在制备鼠疫疫苗中的应用。该保护性抗原组合物是按重量份数比为1-2∶2-1混合的天然F1抗原与rV270抗原的组合物。通过动物实验评价了该组合物的免疫保护作用，结果表明天然F1抗原与重组rV270抗原构成的保护性抗原组合物对鼠疫菌引起的小鼠、豚鼠和兔感染具有良好的免疫保护作用，且安全性较高，可用于制备鼠疫亚单位疫苗。文档编号C12N15/31GK101392021SQ20081022572公开日2009年3月25日申请日期2008年11月10日优先权日2008年11月10日公开号200810225727.发明者代瑞霞,任玲玲,吴本传,崔百忠,张青雯,杨永海,杨瑞馥,旺王,棠王,虎王,王效义,王祖陨,祁芝珍,郭兆彪申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所