专利名称：：一种能够对真核细胞进行基因输运的多肽类载体及衍生物的制作方法
技术领域：
：本发明属于基因输运领域。它是一种可以将外源DNA输运到真核细胞中的多肽类载体。真核细胞包括细胞系和原代培养的细胞。基因输运包括将DNA，SiRNA和ODN输运到真核细胞中。
背景技术：
：基因输运作为基因治疗的基本技术之一，其高效的运输能力和低的生物毒性对基因治疗的成功起了关键的作用。目前，基因输运的载体主要包括两类，即病毒类载体和非病毒类载体。病毒类载体主要包括逆转录病毒类载体(CN1871356，CN1159210,CN1302334)，慢病毒类载体(CN1688323，CN1487841，CN1668751,CN1633495,CN101186915),腺病毒类载体(CN1857738，C画50021，CN1570122,CN101072879,CN1147837,CN1113390,CN1218512,CN1314948)等，尽管病毒类载体具有很高的基因输运的效率，但是生物兼容性和潜在生物毒性极大程度的制约了其在临床治疗中的应用。非病毒类载体主要包括阳离子脂质体核心的载体(如Lipofectamine2000),脂质体核心的载体(FuGene6)，阳离子聚合物核心的载体(CN101016550)，多胺类载体，肽类载体(CN1821399)，复合类载体(CN101016549)及其他生物材料类载体(CN1786163，CN1375334)等，虽然该类载体的运输能力相对病毒类载体低，但良好的生物兼容性和较高的安全性为其在研究和临床中的应用提供了基础，其中尤其以多肽类载体的安全性更高，所以多肽类载体是目前基因输运载体研究中的一大热点。多肽类药物和药物载体的研究是很广泛的，包括靶向多肽药物的研究(CN101143895，CN101130063，CN101130062,CN101130061，CN101224306)，多肽类药物研究(CN101121018，C画1134780，CN101214369，CN1488641)，多肽类药物载体的研究(CN101053660，CN101024087，CN101113457，CN101262890，CN1800403)等。针对不同的生物用途，功能性多肽序列的研究也引起了大家的广泛关注。早在1965年我国科学家就完成了牛结晶胰岛素的合成，这是世界上第一次人工合成多肽类生物活性物质。近年来譬如MaeshimaY等人发现具有肿瘤抑制功能的活性肽段(MaeshimaY;ColoradoPC;TorreA，e/aJ.DistinctantitumorpropertiesofatypeIVcollagendomainderivedfrombasementmembrane[J].J5/o/C/zew,2000.275(28):21340-8.);KobayashiN.等人发现了一段具有细胞核定位功能的肽段(KobayashiN.;YamadaY.;YoshidaT.爿w"w/cro6爿gew"Cte附W/^，2006，50，1118-9.);HoffinanJ.A.等人研究出具有肿瘤耙向功能的肽段(HoffmanJ.A.;GiraudoE.;SinghM.;ZhangL.;InoueM.;PorkkaK.;HanahanD.;RuoslahtiE.CawcerCe〃，2003，4，383-91.)EnbackJ.等人筛选出具有肿瘤导向功能的肽段(EnbackJ.;LaakkonenP.所oc/zewSocrrara，2007，35，780-3.)等。本发明首次将若干不同功能的多肽结构域通过适当的方法连接起来，设计出一种新型多肽，不仅可以作为真核细胞基因输运的载体，而且具有高度的生物安全性，尤其对于原代真核细胞具有较高的基因输运能力。
发明内容本发明的一个目的是合理的利用核定位序列和肿瘤识别序列，并采用了适当的链接序列，设计了一类多肽类载体；本发明涉及的多肽类载体可以通过分子间相互作用结合DNA，并将外源DNA带入真核细胞中表达，尤其对于原代细胞具有较好的作用，同时该类载体具有较低的毒性，为基因输运的研究和基因治疗提供了新的思路。本发明的另一个目的是提供了该多肽载体及衍生物的应用。技术方案，本发明提供了用于真核细胞基因运输的多肽载体，是一段氨基酸组成的双功能多肽及其衍生物，命名为RPC，RPC的序列为SEQIDNO.l。该多肽是由一段位于碳端的核定位信号结构域、一段位于氮端的肿瘤靶向结构域和一段位于这两个结构域之间的接头所组成。其中，核定位信号结构域采用的是SV40大T抗原蛋白分子的核定位信号肽(nuclearlocationsignal,NLS)，它是一段由7个氨基酸组成的肽段，序列为PKKKRKV。因为其带有正电荷，而DNA带有负电荷，所以它可以引导蛋白或多肽从胞质转运到核内，并通过电荷相互作用力和DNA结合。肿瘤靶向结构域是Hoffman等人发现的一段由5个氨基酸组成的肽段，序列为CGKRK，它可以被多种靶细胞特异性识别并进入靶细胞的核内。接头肽段是根据Deshayes等人的研究成果设计出的一段由3个氨基酸组成的肽段，序列为WSQ，我们将它作为一段连接结构域，将核定位信号结构域和肿瘤靶向结构域连接起来。同时我们通过对该双功能肽段的碳末端和氮末端分别进行了化学修饰、替换或增加RPC序列中的部分氨基酸，设计出了RPC的一系列衍生物，并验证了RPC及衍生物的序列特异性。所述的衍生物RPC1为将RPC碳末端用巯基乙胺修饰，在其氮末端连接上乙酰基，巯基乙胺具有保持多肽稳定性的功能，而乙酰基是最常用的一种小分子化学修饰基团。所述的衍生物RPC2为将RPC1碳末端修饰的巯基乙胺替换成氨基，巯基乙胺具有保持多肽稳定性的功能，用氨基替换可以减弱这种功能，说明巯基乙胺作为碳末端修饰的重要性。所述的衍生物RPC3为将RPC1氮末端的乙酰基替换成9-荷甲氧羰基,9-苑甲氧羰基是一种高分子量的修饰基团，具有较大的空间结构，它可以增加多肽的空间位阻效应，影响多肽的折叠，说明乙酰基作为氮末端修饰的重要性。所述的衍生物RPC4为将RPC1碳端的缬氨酸替换成赖氨酸;缬氨酸是一种中性氨基酸，侧链不带电荷，赖氨酸属于碱性氨基酸，侧链存在氨基带正电荷。用赖氨酸取代缬氨酸可以改变多肽的电荷比例，增加其正电荷的数量，提高多肽和DNA结合的能力，从而多肽能够携带更多的DNA进入细胞，提高输运的能力。所述的衍生物RPC5为在RPC1序列中间插入一个赖氨酸；多肽的核定位结构域中富含赖氨酸和精氨酸，它们都属于碱性氨基酸，侧链带正电荷，可以和带负电的DNA相互结合。在该结构域中再插入一个赖氨酸，可以增加多肽正电荷的数量，提高其与DNA结合的能力。以上几种类似物的基因输运效果说明，通过合理的修饰可以进一步提高该类多肽类载体基因输运的能力。所述的能够对真核细胞进行基因输运的多肽类载体及衍生物在运输外源DNA到真核细胞中的应用。RPC肽段及其衍生物是由GelBiochem公司(上海)合成。RPC及其衍生物的序列为SEQIDNO.1RPC:CGKRKWSQPKKKRKVRPC1:Ac-CGKRKWSQPKKKRKV-CysteamideRPC2:Ac-CGKRKWSQPKKKRKV-NH2RPC3:Fmoc-CGKRKWSQPKKKRKV陽CysteamideRPC4:Ac-CGKRKWSQPKKKRKK-CysteamideRPC5:Ac-CGKRKWSQPKKKKRKV-Cysteamide。肽段的碳末端和氮末端的修饰基团优选为巯基乙胺(Cysteamide)和乙酰基(Ac)时，基因输运能力最高。此外，本发明在RPC1序列的基础上，将RPC1碳末端的缬氨酸(V)替换成赖氨酸(K)构建的RPC4，进一步提高了基因输运的能力。有益效果本发明作为多肽类的基因输运载体，具有很好的结合外源DNA并将其输运到真核细胞进行表达的能力，尤其针对于难转染的原代细胞，该发明具有良好的转染效果，同时展示出了高度的生物安全性。图hRPC1和DNA复合物的形成(第2-5道是DNA和不同浓度的RPCl孵育)；图2:RPC1和RPC1-DNA复合物对原代成骨细胞活力的影响(通过MTT方法检测细胞的活力，t表示p值小于0.05);图3:RPC1对原代成骨细胞的转染(以GFP作为报告基因)；其中A是单独DNA转染原代成骨细胞24小时后的荧光图片；C是RPC1-DNA复合物转染原代成骨细胞24小时后的荧光图片；B、D分别是A、C图的显微镜明场图片；图4:RPC1对原代成骨细胞的转染(以iem7/aluciferase作为报告基因)；图5:RPC1转染原代成骨细胞的时间效应(以ie"/〃flluciferase作为报告基因)；图6:Lipofectamine2000对RPC1转染的影响(以iem7/aluciferase作为报告基因，***表示p值小于0.001)。具体实施例方式实施例一RPC的序列结构设计本发明提供的用于真核细胞基因运输的多肽载体，是一段由15个氨基酸组成的双功能多肽，命名为RPC，其序列为CGKRKWSQPKKKRKV。该多肽是由一段位于碳端的核定位信号结构域、一段位于氮端的肿瘤靶向结构域和一段位于这两个结构域之间的接头所组成。其中，核定位信号结构域采用的是SV40大T抗原蛋白分子的核定位信号肽(nuclearlocationsignal,NLS)，它是一段由7个氨基酸组成的肽段，序列为PKKKRKV。因为其带有正电荷，DNA带有负电荷，所以它可以引导蛋白或多肽从胞质转运到核内，并通过电荷间相互作用力和DNA结合。肿瘤耙向结构域是Hoffman等人发现的一段由5个氨基酸组成的肽段，序列为CGKRK，它可以被多种靶细胞特异性识别并进入靶细胞的核内。接头肽段是根据Deshayes等人的研究成果设计出的一段由3个氨基酸组成的肽段，序列为WSQ，我们将它作为一段连接结构域，将核定位信号结构域和肿瘤靶向结构域连接起来。同时我们还对该双功能肽段的碳末端和氮末端分别进行了化学修饰，在碳末端连接上巯基乙胺以提高多肽的稳定性，在氮末端连接上乙酰基，设计出RPC1序列。RPC系列肽段是由GelBiochem公司(上海)合成。实施例二RPC1与DNA的结合能力RPC1和DNA复合物的形成将不同浓度的PRC1肽段溶液和恒定浓度的质粒DNA溶液混合，在漩涡振荡仪上振荡1分钟，置于室温下孵育30分钟。将不同浓度比的RPC1和DNA复合物进行1%的琼脂糖电泳，电泳结果经凝胶成像仪(Tanonl600)成像。结果显示，随着RPC1浓度的提高，与之结合的DNA含量也不断增加。RPC1/DNA的最佳结合比率是10:1(w/w)(见图l)。实施例三RPC1对原代成骨细胞的毒性作用原代成骨细胞的分离和培养方法分离出新生Wistar大鼠的颅骨，将颅骨上附着的软组织剥离干净。将颅骨剪碎后用无菌的PBS清洗2遍，再置于DMEM(含lmg/mL的II型胶原蛋白酶)培养基中，于37。C下孵育100分钟。孵育结束后在250g转速下离心3分钟，再将细胞用DMEM(含10%小牛血清，50lig/mL青霉素和50ug/mL链霉素)培养基重悬，置于二氧化碳培养箱(37°C，5%C02)中培养。一周后收获细胞用于实验。将原代成骨细胞接种在96孔细胞培养板中，密度约5-6X10"L，用含10%小牛血清的DMEM培养基培养。将RPC1和RPC1-DNA复合物分别加入细胞培养板中，在37'C下培养48-72小时。然后向每孔中加入的MTT(噻唑蓝)溶液使终浓度为5yg/mL。继续培养4小时，吸去培养基，再向每孔中加入150iiLDMSO(二甲基亚砜)，用酶标仪(ELX800)在570nm处测吸光度。结果显示，RPC1以及RPC1-DNA复合物在工作浓度上对细胞的活力基本上无影响，说明RPC1以及RPC1-DNA复合物基本上没有细胞毒性。只是RPC1-DNA复合物在处理细胞72小时后，对细胞活力有轻微的减少(见图2)。实施例四RPC1对原代成骨细胞的转染(以GFP作为报告基因)细胞接种在24孔细胞培养板中，密度约3-5X10"孔，过夜培养，待用。配置转染复合物方法如下将最佳结合比率的RPC1和DNA溶解在DMEM(含血清无抗生素)培养基中，每孔200uL体积，充分振荡混合，在室温下孵育30分钟。转染过程方法如下过夜培养的细胞用DMEM(含血清无抗生素)培养基洗涤2次后加入孵育过的混合物，在37'C，5%(:02培养条件下培养30分钟，补充DMEM完全培养基300"。检测方法如下细胞培养48小时后用PBS清洗3遍，在荧光显微镜(OlympusIX-70)下观察。结果显示，在RPC1瞬时转染的原代成骨细胞中，可以看见明亮的绿色荧光，而未被转染的细胞则看不见荧光。说明RPC1可以介导外源基因转入原代成骨细胞中，并保证外源基因得到有效表达(见图3)。实施例五RPC1对原代成骨细胞的转染(以Renillaluciferase作为报告基因)细胞接种在24孔细胞培养板中，密度约3-5X10"孔，过夜培养，待用(同实施例四)。转染复合物的配制，转染过程同实施例四。检测方法如下培养48小时候后收集细胞，用Luciferase检测试剂盒(Promega公司)中细胞裂解液进行裂解，用Luciferase检测试剂盒(Promega公司)进行细胞裂解液中Luciferase活力检测，同时用蛋白浓度试剂盒(碧云天生物公司)测定细胞裂解液的蛋白浓度。用蛋白浓度将Luciferase酶活进行标准化。数据分析方法如下studentVTtest进行数据分析并用Origin做图。结果显示，经RPC1转染的原代成骨细胞，Luciferase的活性达到14.71RLU/吗protein,而未转染的细胞(阴性对照)基本检测不到Luciferase的活性(见图4)。实施例六RPCl转染原代成骨细胞的时间效应(以Renillaluciferase作为报告基因)细胞接种在24孔细胞培养板中，密度约3-5X10"孔，过夜培养，待用(同实施例四)。转染复合物的配制，转染过程同实施例四。转染后7天内，每天检测一次Luciferase的活性，检测方法同实施例五。数据分析方法同实施例五。结果显示，转染后的前两天内，Luciferase的活性呈上升趋势，并在第48小时达到峰值(14.7lRLU/ngprotein),此后呈下降趋势，在第7天后下降到0.02RLU/pgprotein(见图5)。实施例七Lipofectamine2000对RPCl转染的影响(以iem'〃aluciferase作为报告基因)细胞接种在24孔细胞培养板中，密度约3-5X10"孔，过夜培养，待用(同实施例四)。转染复合物的配制同实施例四，再在RPC1-DNA复合物中加入合适体积的Lipofectamine2000。转染过程，数据分析方法同实施例四。结果显示，RPCl/Lipofectamine2000共转的原代成骨细胞与RPCl单独转染的细胞相比，前者的Luciferase活性明显高于后者(p<0.001)，说明Lipofectamine2000可以促进RPCl的基因输运(见图6)。实施例八RPCl的序列特异性我们在RPCl序列的基础上，设计了4种RPCl的类似物，由GelBiochem公司(上海)合成，它们分别是RPC2(Ac-CGKRKWSQPKKKRKV-NH2)，将RPCl碳末端的巯基乙胺(Cysteamide)替换成氨基(NH2)。巯基乙胺具有保持多肽稳定性的功能，用氨基替换可以减弱这种功能。RPC3(Fmoc-CGKRKWSQPKKKRKV-Cysteamide)，将RPCl氮末端的乙酰基(Ac)替换成9-芴甲氧羰基'(Fmoc)。9-芴甲氧羰基是一种高分子量的修饰基团，具有较大的空间结构，它可以增加多肽的空间位阻效应，影响多肽的折叠。RPC4(Ac-CGKRKWSQPKKKRKK-Cysteamide)，将RPC1碳末端的缬氨酸(V)替换成赖氨酸(K)。缬氨酸是一种中性氨基酸，侧链不带电荷，赖氨酸属于碱性氨基酸，侧链存在氨基带正电荷。用赖氨酸取代缬氨酸可以改变多肽的电荷比例，增加其正电荷的数量，提高多肽和DNA结合的能力。RPC5(Ac-CGKRKWSQPKKKKRKV-Cysteamide)，在RPC1序列中间插入一个赖氨酸(K)。多肽的核定位结构域中富含赖氨酸和精氨酸，它们都属于碱性氨基酸，侧链带正电荷，可以和带负电的DNA相互结合。在该结构域中再插入一个赖氨酸，可以增加多肽正电荷的数量，提高其与DNA结合的能力。分别检测它们对原代成骨细胞的转染效率(以iem7/aluciferase作为报告基因)。细胞的准备，转染复合物的配制，转染过程，数据分析方法同实施例四。结果显示，与RPC1相比，RPC2禾卩RPC3的转染效率大大降低了，分别为(11.12±0.96%)和(15.54±1.18%)，说明RPC1的末端修饰是具有特异性的。而RPC4和RPC5的转染效率分别为(130.33±3.94%)和(83.58±2.21°/。)，则与RPC1相当，甚至其中RPC4的转染效率比RPC1高(见表1)，说明可以通过对RPC1序列的合理修饰进一步提高其基因输运的能力。表l:RPC1类似物的转染效率<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>权利要求1、一种能够对真核细胞进行基因输运的多肽类载体及其衍生物，其特征在于其碳端是由7个氨基酸组成的核定位信号结构域PKKKRKV，它可以通过电荷相互作用力和DNA结合；氮端是由5个氨基酸组成的肿瘤靶向结构域CGKRK，它可以被多种靶细胞识别并进入靶细胞的核内，中间是一段由3个氨基酸组成的接头WSQ，用来连接核定位信号结构域和肿瘤靶向结构域，命名为RPC，其序列为SEQIDNO.1。2、如权利要求1所述的能够对真核细胞进行基因输运的多肽类载体，其特征在于所述的衍生物为将RPC碳末端用巯基乙胺修饰，在其氮末端连接上乙酰基得到RPC1。3、如权利要求1所述的能够对真核细胞进行基因输运的多肽类载体，其特征在于所述的衍生物为将RPC1碳末端修饰的巯基乙胺替换成氨基得到RPC2。4、如权利要求1所述的能够对真核细胞进行基因输运的多肽类载体，其特征在于所述的衍生物为将RPC1氮末端的乙酰基替换成9-芴甲氧羰基得到RPC3。5、如权利要求1所述的能够对真核细胞进行基因输运的多肽类载体，其特征在于所述的衍生物为将RPC1碳端的缬氨酸替换成赖氨酸得到RPC4。6、如权利要求1所述的能够对真核细胞进行基因输运的多肽类载体，其特征在于所述的衍生物为在RPC1序列中间插入一个赖氨酸得到RPC5。7、权利要求1-6所述的能够对真核细胞进行基因输运的多肽类载体及衍生物在运输外源DNA到真核细胞中的应用。全文摘要本发明涉及一种能够对真核细胞进行基因输运的多肽类载体及其衍生物，其碳端是由7个氨基酸组成的核定位信号结构域PKKKRKV，它可以通过电荷相互作用力和DNA结合；氮端是由5个氨基酸组成的肿瘤靶向结构域CGKRK，它可以被多种靶细胞识别并进入靶细胞的核内，中间是一段由3个氨基酸组成的接头WSQ，用来连接核定位信号结构域和肿瘤靶向结构域，本发明首次将不同功能的肽段结构域通过适当的方法连接起来，设计出一种新型多肽，不仅可以作为真核细胞基因输运的载体，而且具有高度的生物安全性，尤其对于原代真核细胞具有较高的基因输运能力。文档编号C12N15/79GK101381741SQ200810225469公开日2009年3月11日申请日期2008年10月31日优先权日2008年10月31日发明者乐于,温龙平,娜满申请人:中国科学技术大学