专利名称：植物花色素苷代谢途径中关键酶-二氢黄酮醇-4-还原酶编码基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及与植物花色素苷形成相关的酶编码基因与应用。
技术背景花的颜色是决定花观赏价值的重要因素之一，花色主要由类黄酮(flavonoids)、类胡萝卜素 (carotenoids)、生物碱(alkaloid)三大类物质决定(Tanaka Y,S Tsuda,T Kusumi. Metabolic Engineering to modify flowers color.Plant Cell Physioloy, 1998(1 l):l 119-1126.)。花色素苷(anthocyanins)是类黄酮中一类主要色素，控制着花的粉红色、红色、砖红色、蓝色、紫 色等花色，植物中基本的花色素苷有3种，即花葵素、花青素、花翠素，以及这些花色素的甲基化衍 生物等(徐纪尊，王丽辉,潘庆玉.观赏植物花色基因转化的研究进展[J].中国农业科技导报，2006, 8 (5): 56 60.)。二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)是花色素苷代谢途径中二氢黄酮醇(如二氢斛皮素、二氢山萘酚、二氢 杨梅黄酮)向无色花色素苷转变这一过程中起作用的关键酶.研究表明，DFR参与3-deoxy途径，催化 生成3-脱氧花色素。此酶同F3H —样具有底物特异性。DFR蛋白的晶体结构表明它是由三个亚基组成 的复合物，具有专门的NADPH结合域。Oreilly等(985)采用转座子标签技术第一次从玉米分离出Z)尸W基因，该基因与Al位点对应。采用 同样的法从金鱼草克隆到了 Z)尸W基因(Oreilly C, Shepherd N.S., Pereira A. et al. Molecular cloning of the al locus in Zea mays using the transposable elements En and Mul. EMBO J. 1985, 4:877-882.)，对应于 Pallida(pal)位点 (Martin C .,Carpenter R., Sommer H. et al. Molecular analysis of instability in flower pigmentation of y4w">r/H.w, flowering isolation of the pallida locus by transposon tagging. EMBO J.1988，7:1625.)接着以金鱼草"FWcDNA为探针分离出了矮牵牛IVW基因(Beld M., Martin C., Huits H. et al. 1989. Flavonoid synthesis in尸e/廳.a /z;v6n'血Partial characterization of dihydroflavonol-4-reductase genes. Plant Mol. Biol. 1989,13: 49卜502)。 Zea该基因与玉米DFi 基因高度同源。采用同源克隆的方法， 以在拟南芥、非洲菊、玫瑰、康乃馨、百合等多种植物中分离了DFi 基因。对已有"W 基因结构分析表明，大多数植物Z)W 都由6个外显子和5个内含子组成，如裂叶牵 (&o附oefl m7)禾口圆叶牵牛(^7cw7oea / w pwre")的Z)F7 (Inagaki Y,Johzuka-Hisatomi Y,Mori T,et al. Genomic organization of the genes encoding dihydroflavonol 4-reductase for flower pigmentation in the Japanese and common morning glories.Ge"e,1999,226:181陽188.)以及金鱼草、矮牵牛(Huit HSM,Gerats AGM,Kreike MM et al.Genetic control of dihydroflavonol 4-reductase gene expression in i^ww/a /y^/血Plant J,1994， 6(3》 295-310.)拟南芥(Winkel-Shirley B,Hanley S,Goodman HM.Effects of ioning radition on a plant: genome analysis of two爿raZ)/^to;^/s transparent testa mutations.Plant Cell,1992，4:333陽347,)百B;]c根(Shimada S，Inoue Y.T.,SakutaM.Anthocyanidin synthase in non-anthocyanin-producing Caryophyllales species.Plant, J,200544:950-957.)。禾IJ金钟连翘(Rosati C., Cadic A.， Duron M. et al. Molecular cloning and expression analysis of dihydroflavonol 4-reductase gene in flower organs of Fo，f/w'aX/"tenwWa. Plant Mol. Biol. 1997. 35: 303 -311.)，并且它们内含子剪切位点相同。但在玉米(Schwartz-Sommer Z,Shepherd N,Tacke E,et al.Influence of transposable elements on the structure and function of the Algenes of Zea mays.EMBO J, 1987， 6: 287— 294.)、大麦(Kristiansen K N, Rohde W.Structure of the Hordeum vulgare gene encoding dihydroflavonol 4-reductase and molecular analysis of antl8 mutants blocked in flavonoid synthesis.Mol Genet, 1991,230:49-59)。禾U高粱(Chen M,SanMiguel P,and Bennetzen J L.Sequence organization and conservation in sh2/al homologous regions of sorghum and rice.Genetics，1998，148(l):435-443.)中，DFi 基因结构则由4个外显于 和3个内含子组成，并且玉米和大麦的内含子剪切位点相同，与金鱼草和矮牵牛的D尸W基因的前3 个内含子相对应。Z)FW基因在大多数植物中都以单拷贝或小基因家族形成存在，如在大麦、拟南芥、西红柿 (Bongue-Bartelsman M,O'Neill SD,Tong Y,Yoder JI,Characterization of the gene encoding dihydroflavonol 4-reductase in tomato.Gene,1994,138:153-157.)、葡萄(Sparvoli F,Martin C，Scienza A,Gavazzi G,Tonelli C.Cloning and molecular analysis of structure genes involved in flavonoid and stibene biosynthesis in grape (FMs v/"z/era丄.).Plant Mol Biol, 1994，24:743-755.)、金鱼草和水稻中只含有一个基因，而在牵牛矮 牵牛中有三个拷贝，包括3个同源基因Z)FW-丄￡ Fi -5、 Z)^7 -C，只有基因编码有活性的DFR。 在豆科百脉根中有五个拷贝。颜华等从矮牵牛花瓣的cDNA文库中成功克隆了高度同源的OT^d基丙。 研究发现，在矮牵牛花中，花色素苷生物合成的调节起S Z)FW基因，花瓣中Z)FW基丙与C/K、 C/// 基因的表达协调(颜华，李毅，宋云等.二羟基黄酮醇还原酶基因的克隆、全序列分析及在大肠杆菌中的 表达。应用基础与工程科学学报.1997,5(2):172-180.)。不同物种的DFR氨基酸序列在多个区域有较高的同源性。Johoson等发现，结合区中的134位与 145位的氨基酸可直接影响酶的底物特异性，大多数物种在134位含有D或N，而蔓越橘(J^ccz'm、w /Twcrocarpo" A.)在此位点则是V，因而其DFR酶作用底物仅限于DHQ(Johnson E.T., Ryu S.， Yi H. et al. Alteration of a single amino acid changes the substrate specificity of dihydroflavonol 4-reductase.The Plant Joumal,2001,25:325-333.)。在除矮牵牛外的所有以DHK为底物的双子叶植物中，145位的E(谷氨酸) 都是高度保守的，矮牵牛DFRA最佳底物为DHM，对DHQ的还原效率很低，不能还原DHK(ForkmannZ.Narturforsch, 1987，42C: 1146- 1148.)，因此不能产生天葵素类花色素。 发明内容本发明的目的是提供一种与植物花色素苷形成相关的酶编码基因与.本发明所提供的与植物花色素苷形成相关的酶，名称为DFR，来源于苹果属王族海棠(^fa/w 及o少a/iy)，是如下l)或2)的蛋白质1 )由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物花色素苷形成相关的由l)衍生的酶。上述与植物花色素苷形成相关的酶的cDNA基因也属于本发明的保护范围。 与植物花色素苷形成相关的酶的cDNA基因具体可为如下l) -4)中任一所述的基因1) 其编码序列是序列表中序列1的自5'末端第1-1265位脱氧核糖核苷酸；2) 其核苷酸序列是序列表中的序列l;3) 在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码上述与植物花色素苷形成相关的 酶的DNA分子；4) 与l)的基因具有95%以上的同源性，且编码上述与植物花色素苷形成相关的酶的DNA分子。 序列表中的序列1由1265个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5'末端第1-1265位碱基，编码氨基酸序列是序列表中序歹U2的DFR。扩增上述￡>^ 基因全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物合成及测序工作均由上海生工生物 技术服务有限公司完成。限制性内切酶EcoRl、 HindIII和T叫酶，T4DNA连接酶均购自大连宝生物 工程有限公司，pUC18-T Vector购自宝生物工程公司，BD SMART RACE cDNA Amplification Kit 购自Clontech公司。Amp抗生素、Tris饱和酚、水饱和酚、DEPC、 DL2000 DNA Marker、琼脂糖、酵母提取物、胰蛋 白胨均购自北京鼎国生物技术有限公司。 一、MrZ)/W基因3'端序列的获得以王族海棠(^fa/M i 砂a/(y)(北京农学院海棠种质资源圃)为实验材料，提取其叶的总RNA， 将提取得到的总RNA用5(^1的DEPC水溶解，电泳检测。经甲醛变性凝胶电泳分析，结果如图1所 示。从图中可以清晰地看到28SrRNA和18SrRNA两条带，且28SrRNA和18SrRNA含量之比大约为 1:1-2:1。结果表明，提取得到的RNA是完整的，染色结果显示，提取得到的总RNA可以用来进行反 转录。以上述提取得到的叶总RNA为模板，将其反转录为cDNA。再以此cDNA为模板，跟据近缘物种植 物DFR基因保守区段序列，设计3'race上游引物DFR3F扩增A^DW 基因的3'端序列。MasterMix预混物 体系如下预混物_体积(^L)ddH20 25.8 10 PCR缓冲液 4 dNTP Mixture(2.5 mM) 3.25Taq酶(5U/ 1) 1总体积34nL，将上述Master Mix预混物平均分成2管，每管，按照下表加入引物:双引物对照 样品 3i (序列表中序列3)~~^ DFR3F (序列表中序列4) lpl模板 一 lplPCR反应条件先95'C预变性3min;然后95。C变性15S; 64'C退火6min，共30个循环；最后 72。C延伸10min。取lCnLPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，其中，M为MARKER II的DNA 分子量标准，1为样品组的PCR扩增结果，2为DFR3F和3R双引物对照。结果表明，双引物对照组 没有扩增出特异条带，只有样品组扩增得到850bp左右的片段。切下目的条带，纯化回收后按照pBS-T-Vector Kit载体试剂盒(天为时代生物公司)说明书将PCR 产物连接到pBS-T载体上，进行测序。经同源性比较分析后确定获得的835bp片段即是7!^Z)FW基肉 的3'端序列。二、 DF/ 基因5'端序列的获得以步骤一获得的保守序列为模板，在其5'端设计引物，进行PCR反应，扩增M^F/ 基因的5'端序列。 Master Mix预混物体系如下预混物体积(nL)ddH2025.810 PCR缓冲液4dNTP Mixtoe(2.5 mM)3.2T叫酶(5U/ 1)1总体积34pL，将上述Master Mix预混物平均分成2管，每管，按照下表加入引物:双引物对照 样品65F (序列表中序列3) lpl lplDFR5R1 (序列表中序列5) 1 pl lpl模板 _ 1^1PCR反应条件先95'C预变性3min;然后95'C变性15S; 68'C退火6min，共30个循环；最后 72。C延伸7min。将第一轮PCR产物稀释1000倍，取lpL作为模板，以DFR5R1和DFR5R2 (序列表中序列5和 6)为引物，进行巢式PCR反应，PCR反应条件与第一轮相同。取10nL第二轮PCR产物进行琼脂糖 凝胶电泳检测，结果如图2所示，其中，M为MARKER II的DNA分子量标准，1为样品组的PCR扩 增结果，2为DFR5R2和5F双引物对照。结果表明，双引物对照组没有扩增出特异条带，只有样品组 扩增得到670bp左右的片段。切下目的条带，纯化回收后按照pBS-T-Vector Kit载体试剂盒(天为时代生物公司)说明书将PCR 产物连接到pBS-T载体上，进行测序。经同源性比较分析后确定获得的675bp片段即是A^Z)/7 基因 的5'端序列。三、MrD尸i 基因全长cDNA序列的获得将上述PCR扩增获得的WrZ)Fi 基因5'端序列以及3'端序列进行同源性比较，利用DNAMAN等 生物软件进行拼接校正，拼接出MrZV7 基闪全长cDNA序列。根据拼接的MrD^7 基因全长cDNA序 列设计引物DFRF和DFRR (序列表中序列7和序列8)，提取王族海棠叶的总RNA，反转录为cDNA， 利用RT-PCR方法扩增全长MrZ)FW基因，用高保真Pfu酶替换7b《酶，PCR反应混合物如F:10xPCR缓冲液2.5nldNTP Mixture(2.5 mM )2単引物DFRF (100ng/|al)0.5nl引物DFRR (100ng/(il)0，模板(反转录的cDNA)1.5plPfU酶(5，)0.3nlddH2017，Total25plPCR反应条件先94'C预变性3min;然后94。C50S， 60°C lmin, 72°C 2min，共35个循环；再 72。C延伸7min， 4'C保存。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示，其中，M为1Kb的DNA分子量标准， 1为基因全长cDNA序列的PCR产物。结果表明获得约1000bp的条带。切下该目的条带，纯化回收后按照pBS-T-Vector Kit载体试剂盒(天为时代生物公司)说明书将PCR产物连接到pBS-T载 体上。对扩增得到的MrZ)f7 基因全长cDNA序列进行测序，测序结果表明，获得1047bp的条带,'该 1047bp的核苷酸片段即为Mr￡>/W。 A/rZ)f7 序列如序列表中序列1所示，其编码的氨基酸序列如序列 表中序列2所示。
'图1为王族海棠叶总RNA的PCR扩增结果图2为AM)F/ 基因的5'RACE PCR扩增结果图3为A^DKR基因的3'RACE PCR扩增结果图4为MrDF/ 基因全长cDNA序列的PCR扩增结果序列表序列一 DNA苹果属王族海棠(A/a/w Wo>'a/<y) 1257 1CTTCGGTAAG 61GGGCGTCCGG 121TCCGCGCCAC 181CGAAGGCGGA 241ATGAAGCCAT 301CCAAGGACCC 361AGGCATGCCA 421TGAATGTGGA 481TTTGCCGCTC 541AAGCTGCATG 601TGGTGATTGG 661CGATCTTAAG721 AAATGAATCA CATTATGGCA TCATCAAGCA GGGCCAGTAT GTTCACTTGG ACGACCTCTG781TTTGTTCGTC841 ACACGATGCT ACAATTCACG AACTTGTAAA AATGCTCAGA GAAAAATACC CCGAGTACAA901 TATACCCACA AAGTTCAAGG GCATTGACGA CAACTTAGAA CCTGTTCATTTTTCTTCAAA 961TTGTGGGGGC 1021AGAAAACTGA - '1081 GGCTGCTGAG GAG入GCAACC TCGTTGATGT CAAAGTAGGT TAAAATATTG AAGAGTGATT1141 AATGTTTGCA TTTTATGTCG AGGCTTACCT CTCTATTGTT TTACATTTAC CAGCTTGGAT 1201AAAAAAAAAA 1261 AAAAA序列二PRT苹果属王族海棠(Ma/i i o;yfl/(v) 1591 RASRMLRPPW RPREFDSSVS21 TYTQDMGSES ESVCVTGASG41 FIGSWLVMRL LEHGYTVRAT61 VRDPTNQKKV KHLLDLPKAE81 THLTLWKADL ADEGSFDEAI101 QGCSGVFHVA TPMDFESKDP121 ENEVIKPTIN GLLDILKACQ141 KAKTVRKLVF TSSAGTVNV序列三DNA人工序列3R和5F: Long (0.4 nM):5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCACGCAGAGT-3' Short (2 nM):5'~CTAATACGACTCACTATAGGGC-3'序列四DNA人工序列DFR3F: 5'- CACATCCTCAGCAGGAACTG -3'。序列五 DNA人工序列DFR5R1: 5'- GCTTGATGATGCCATAATGTG -3'。序列六 DNA人工序列 ， DFR5R2:5'~CATTTCTTAAGATCGGCGAAAGTC-3'序列七 DNA人工序列DFRF: 5,-ATGGGATCCGAGTCCGAATC-3'序列八 DNA人工序列DFRR: 5'- TTAACCTACTTTGACATCAACGAGGT -3，
权利要求
1、一种蛋白，是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物花色素苷形成相关的由1)衍生的蛋白质。
2、 权利要求l所述蛋白的编码基因。
3、 根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述蛋白的cDNA基因为 如下l) -4)中任一所述的基因1 )其编码序列是序列表中序列1的自5'末端第1 - 1265位脱氧核糖核苷酸；2) 其核苷酸序列是序列表中的序列l;3) 在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码权利要求1 所述蛋白的DNA分子；4 )与1 )的基因具有95 %以上的同源性且编码编码权利要求l所述蛋白的DNA分子。
4、 扩增权利要求2或3所述基因的全长或任一片段的引物对。
全文摘要
本发明公开了一种植物花色素苷代谢途径中关键酶的编码基因与应用。该蛋白，是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且能改变植物花色或叶色的由1)衍生的蛋白质。
文档编号C12N9/02GK101580820SQ200810225588
公开日2009年11月18日 申请日期2008年11月6日 优先权日2008年11月6日
发明者姚允聪, 宋婷婷, 沈红香, 佶 田 申请人:北京农学院;姚允聪