专利名称：：植物花色素苷形成的关键酶-查尔酮合成酶编码基因的制作方法
技术领域：
：本发明涉及与植物花色素苷形成相关的酶编码基因与应用。
背景技术：
：植物花中主要含有三大类色素，即类黄酮、类胡萝卜素及生物碱类色素，其中类黄酮是主要色素。参与花色形成的类黄酮主要有两大类一类是花色素苷，这是一类水溶性色素，产生的颜色范围是从红色到紫色；另一类是黄色2-苯甲川基苯呋喃酮。花色素苷所占的比例在很大程度上能决定花的最终颜色。第一个类黄酮分子是由查尔酮合成酶(Chalconesythase，CHS)，催化类黄酮和花色素合成途径的第一步反应，是类黄酮类物质生物合成途径的限速酶。催化一分子4—香豆酰COA与三分子丙二酸单酰辅酶A縮合形成査尔酮分子的形式形成的(孟繁静.植物花发育的分子生物学.中国农业出版社[M],2000,12:225-256.)，查尔酮分子的异构化和功能基团的进一步取代都能导致黄酮、异黄酮和花色素苷的合成，这些化合物为自然界提供了颜色，并且参与了多禾中生理过程(LiJ,OuLeeT,RabaR，etal.ArabidopsisflavonoidmutantsarehypersensitivetoUVBirradiation.PlantCelU993,5:171-179.)。査尔酮提供了类黄酮的基本碳骨架，CHS表达量的增加或减少都可能导致植物花色的变异(邵莉,杨美珠，陈章良等.查尔酮合酶基因对转基因植物花色和育性的影响.植物学报[J].1996，38(7):517-524.)。CHS体外酶活性最早是1972年德国科学家Kreuzaler等从欧芹悬浮细胞培养液抽提物中检测到的。CHS催化1分子4-香豆酰-CoA与3分子丙二酰-CoA縮合形成4，5，7-三羟基黄烷酮(naringeninechalcone)。4，5,7-三羟基黄垸酮为类黄酮化合物的前体。研究表明，CHS是由两个亚基组成，酶功能的实现是在两个亚基合作下完成的。也有报道显示，两个亚基可以单独催化反应(TropfS,KarcherB，SchroderQSchroderJ,Reactionmechanismsofhomodimericplantpolyketidesynthases(stilbeneandchalconesynthase):Asingleactivesiteforthecondensingreactionissufficientforsynthesisofstilbenes,chalcones,and6'-deoxychalcones.JBiolChem,1995,270:7922-7928.)。CHS具有多个酶活性位点，对于苜蓿蛋白晶体的分析表明其活性位点为Cysl64、Phe215、His303、Asn336(FewerJL,JezJM,BowmanME,etal.Structureofchalconesynthaseandthemolecularbasisofplantpolyketidebiosynthesis,NatureStructuraland.MolecularBiology,1999，6(8):775-784.)。在掌叶大黄的研究中，Gly256决定底物选择性的起始，1111"197位于隐藏的催化袋的入口处以控制聚酮化合物的长度，56^38的作用类似€乂5164-引导线性聚酮化合物中间产物进入催化袋进行下一步合成(AbeI,WatanabeT,MoritaH,etal.Engineeredbiosynthesisofplantpolyketides:manipulationofchalconesynthase.OrgLett,2006,8(3):499-502.)。这些位点中认为Cys是4-香豆酰-CoA的结合位点，是酶活性所必需的(JezJM，NoelJRMechanismofchalconesynthase:pKaofthecatalyticcysteineandtheroleoftheconservedhistidineinaplantpolyketidesynthaseJBiolChem,2000，275:396—411.)。以上这些酶活性位点都位于第二亚基上。其蛋白序列长约400个氨基酸，相对分子质量4.2><104，以同源二聚体形式行使催化功能。CHS富含亮氨酸，可能用于形成亮氨酸拉链，参与CHS同源二聚体的形成。CHS的C端有一保守区域GFGFLVGW，被称为CHS标签，只有极少数序列的W突变为L、V或者Y。1985年用欧fC/K基因为探针，克隆了矮牵牛的CHS探针。目前约2000余条CHS相关的DNA序列在Genebank上做了登录，观赏植物中主要有:矮牵牛、牵牛、菊花(GuttersonNC,NapoliC,LemieuxC,etal.Modificationofflowercolorinflorist'schrysanthemum:ProductionofawhitegeneticsBio/technolog1994，12:268—271.)、翠菊、蝴蝶兰、金鱼草、夏蓳等等。C/K基因的ORF约1200bp左右，编码400左右的氨基酸序列，其中第一外显子编码3060个氨基酸，第二外显于编码340个左右f的氨基酸。目前，双子叶植物中的査尔酮合成酶己经成为研究的焦点，菜豆中己发现8个CHS基因，矮牵牛中鉴定出8个甚至更多CHS基因(KoesRE,SpeltCE,MolJNM,GeratsAGM.ThechalconesynthasemultigenfamilyofPetuniahybrida:sequencehomology,chromosomallocationandevolutionaspects.Plant.Mol.Biol,1987，10:159-169,;KoesRE，SpdtCE,vandenElzenPJM,MolJNM.CloningandmolecularcharacterizationofthechalconesynthasemultigenefamilyofPetuniahybrida.Gene,1989,81:245-257.;RyderTB,CramerCL,BellJN,RobbinsMP，DixonRA，LambCJElicitorrapidlyinduceschalconesynthasemRNAinPhaseolusvulgariscellsattheonsetofthephytoalexindefenseresponse—ProceedingsNationalAcademyofScienceUSA,1984,81:5724-5728.;DurbinML,McCaigB,CleggMT.Molecularevolutionofchalconesynthasemultigenefamilyinthemorningglorygenome.PlantMol.Biol,2000,42:79-92.)。尽管Lo禾口Nicholson在两色蜀黍(Sorphumbicolor)中己经分离得到7个查尔酮合成酶基因，(gi(5305906)，gi(5305908),gi(5305910)，gi(5305912)，gi(5305914),gi(5305916)'gi(5305918))'但研究表明，在单子叶禾本科植物中的大部分属(例如，玉米、稻、大麦、黑麦)只含有2个CHS基因(WienandU，WeydemannU,Nielsbach-KloesgenU,PetersonPAl,SaedlerH.MolecularcloningoftheC2locusofZeamays,thegenecodingforchalconesynthase.Mol,Gen.Genet,1986,203:202-207,;FrankenP，Niesbach-KlosgenU,WeydemannU,Marechal-DrouardL,SaedlerH,WienandU.TheduplicatedchalconesynthasegenesC2andWhp(whitepollen)ofZeamaysareindependentlyregulated;evidencefortranslationalcontrolofWhpexpressionbytheanthocyaninintensifyinggene.EMBOJ,1991，10:2605-2612.;RhodeW，DorrS,SalaminiF,BeckerD.StructureofachalconesynthasegenefromHordeumwulgare.PlantMol.Biol,1991,16:1103-1106.)。CHS是一个较大的基因家族，其编码区比较保守，外显子2的保守性高于外显子1，种属间氨基酸序列的同源性一般在75%99%,裸子植物与被子植物之间氨基酸序列同源性一般在60%。CHS是一个多基因家族，多数种内的Ci/S基因同源性较高，个别种的C/7S基因分属于其它的家族。CHS基因的拷贝数在不同的物种之间差异较大。矮牵牛中有12个CiK同源基因，大豆中至少有8个C/K基因，水生三叶草至少有9个，黑麦有4个，玉米中有2个，而金鱼草和拟南芥只有一个拷贝。菊属植物如菊花脑、甘菊、毛华菊等，目前至少分离了24个拷贝。菊花和非洲菊的拷贝数为3个。基因家族的成员表达部位也不同，如矮牵牛中只有和C/iS/在花中表达(戴思兰.菊花查尔酮合成酶基因的克隆与序列分析:[博士学位论文],北京:北京林业大学,2006.)。基因一般只含有一个内含子，而且这个内含子的位置在已发现的序列中均相同，即位于第65位(以欧洲赤松Pinussylvestri的PSCHS为标准)的半胱氨酸密码子内第1和2位碱基之间长度从几十碱基对到儿千碱基不等。金鱼草是目前发现的仅有的具有两个内含子的CHS同源基因。
发明内容本发明的目的是提供一种与植物花色素苷形成相关的蛋白及其编码基因本发明所提供的与植物花色素苷形成相关的酶，名称为7WK7//5，来源于苹果属王族海棠(Matoio戸/zy),是如下l)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物花色素苷形成相关的由l)衍生的酶。上述与植物花色素苷形成相关的酶的cDNA基因也属于本发明的保护范围。与植物花色素苷形成相关的酶的cDNA基因具体可为如下l)-4)中任一所述的基因1)其编码序列是序列表中序列l的自5'末端第1-1536位脱氧核糖核苷酸；2)其核苷酸序列是序列表中的序列l;3)在严格条件下可与序列表中序列l限定的DNA序列杂交且编码上述与植物花色素苷形成相关的酶的DNA分子；4)与l)的基因具有95%以上的同源性，且编码上述与植物花色素苷形成相关的酶的DNA分子。序列表中的序列1由1536个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5'末端第1-1536位碱基，编码氨基酸序列是序列表中序列2的CHS。扩增上述C/ZS基因全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物合成及测序工作均由上海生工生物技术服务有限公司完成。限制性内切酶EcoRl、Hindin和T叫酶，T4DNA连接酶均购自大连宝生物工程有限公司，pUC18-TVector购自宝生物工程公司，BDSMARTRACEcDNAAmplificationKit购自Clontech公司。Amp抗生素、Tris饱和酚、水饱和酚、DEPC、DL2000DNAMarker、琼脂糖、酵母提取物、胰蛋白胨均购自北京鼎国生物技术有限公司。一、MrC/ZS保守序列的获得以王族海棠(A^/^Wqy"/zy)(北京农学院海棠种质资源圃)为实验材料，提取其叶的总RNA，将提取得到的总RNA用50pl的DEPC水溶解，电泳检测。经甲醛变性凝胶电泳分析，结果如图1所示。从图中可以清晰地看到28SrRNA和18SrRNA两条带，且28SrRNA和18SrRNA含量之比大约为1:1-2:1。结果表明，提取得到的RNA是完整的，染色结果显示，提取得到的总RNA可以用来进行反转录。以上述提取得到的叶总RNA为模板，将其反转录为cDNA。再以此cDNA为模板，跟据苹果属植物査尔酮合成酶基因保守区段的上游和下游序列，设计一对MrCHS兼并性引物(序列表中序列3、4)用于CHS保守序列的扩增反应混合物_体积dd腦10取10xPCRBuffer2|xL2.5mMdNTPMix1.6|iL模板(反转录的单链cDNA)lnLprimer1(12.5pM)2pLprimer2(12.5(jM)2pL650xAdvantage2PolymeraseMix0.5^LPCR反应条件先94。C预变性4min;然后94'C变性lmin;58'C退火lmin，共30个循环；最后72'C延伸10min。1%琼脂糖凝胶电泳检测。二、MrC/ffi基因3'端序列的获得以步骤一获得的保守序列为模板，在其3'端设计引物，进行PCR反应，扩增A^C7/S基因的3'端序列。MasterMix预混物体系如下预混物_体积(nL)ddH2010PCR缓冲液dNTPMixture(2.5mM)Taq酶(5U/1)总体积34pL，将上述MasterMix预混物平均分成2管，每管，按照下表加入引物:_双引物对照_样品3R(序列表中序列5)1nL1nL3PF1(序列表中序列6)1nL1nL模板一1pLPCR反应条件先95'C预变性3min;然后95'C变性15S;68。C退火6min，共30个循环；最后72'C延伸7min。将第一轮PCR产物稀释100倍，取lpL作为模板，以3R和3PF2(序列表中序列7)为引物，进行巢式PCR反应，PCR反应条件与第一轮相同。取10nL第二轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示，其中，M为2000bp的DNA分子量标准，1为样品组的PCR扩增结果，2为两个单引物对照组的PCR扩增结果。结果表明，两个单引物对照组都没有扩增出特异条带，只有样品组扩增得到760bp的片段。切下目的条带，纯化回收后按照pUC18-TVector(宝生物工程公司)说明书将PCR产物连接到pUC18-T载体上，进行测序。经同源性比较分析后确定获得的758bp片段即是M"C/^基因的3'端序列。25.843.21三、MC/fS基因5'端序列的获得以步骤一获得的保守序列为模板，在其5'端设计引物，进行PCR反应，扩增A/K7/^基因的5'端序列。MasterMix预混物体系如下预混物_体积(pL)ddH2025.810PCR缓冲液4dNTPMixture(2,5mM)3.2Taq酶(5U/1)1总体积34^L，将上述MasterMix预混物平均分成2管，按照下表加入引物:_双引物对照_样品5F(序列表中序列5)11HL5PR1(序列表中序列8)1pL1HL模板一1|iLPCR反应条件945'C预变性4min—30个扩增循环(94'C变性lmin—65'C退火lmin—72'C延伸lmin)—15个扩增循环(94。C变性lmin—55。C退火lmin—72。C延伸lmin)—72。C继续延伸10min。将第一轮PCR产物稀释100倍，取1^L作为模板，以5F和5PR2(序列表中序列9)为引物，进行巢式PCR反应，PCR反应条件与第一轮相同。取10pL第二轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，其中，M为200bp的DNA分子量标准，1为样品组的PCR扩增结果，2为两个单引物对照组的PCR扩增结果。结果表明，两个单引物对照组没有扩增出特异条带，只有样品组扩增得到1OOObp的片段。切下目的条带，纯化回收后按照pUC18-TVector(宝生物工程公司)说明书将PCR产物连接到pUC18-T载体上，进行测序。经同源性比较分析后确定获得的1000bp片段即是JW一C/ff基因的5'端序列。四、MrCHS基因全长cDNA序列的获得将上述PCR扩增获得的7WK7/ffi基因5，端序列以及3'端序列进行同源性比较，利用DNAMAN等生物软件进行拼接校正，拼接出MrC/K基因全长cDNA序列。根据拼接的MrCi/S基因全长cDNA序列设计引物MCF和MCR(序列表中序列10和序列11)，提取王族海棠叶的8总RNA，反转录为cDNA,利用RT-PCR方法扩增全长MCi/S基因，用高保真Pfo酶替换rag酶，PCR反应混合物如下<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>PCR反应条件945。C预变性4min—30个扩增循环(94'C变性lmin—68'C退火lmin—72'C延伸lmin)—15个扩增循环(94。C变性lmin—55。C退火lmin—72'C延伸lmin)—72'C继续延伸10min。PCR产物进行P/。琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示，其中，M为2000bp的DNA分子量标准，l为il/rC/^基因全长cDNA序列的PCR产物。结果表明获得约1000bp的条带。切下该目的条带，纯化回收后按照pUC18-TVector(宝生物工程公司)说明书将PCR产物连接到pUC18-T载体上。对扩增得到的JWK://S基因全长cDNA序列进行测序，测序结果表明，获得1000bp的条带，该1000bp的核苷酸片段即为AfrC7/S的CDS序列，71/rCi/S序列全长如序列表中序列1所示，其编码的氨基酸序列如序列表中序列2所示。图1为王族海棠叶总RNA的提取结果图2为M"C/K基因的3'RACEPCR扩增结果图3为M"CflS基因的5'RACEPCR扩增结果图4为M"C/^基因全长cDNA序列的PCR扩增结果序列表序列一DNA苹果属王族海棠(Ma/w57q^/;y)1CGGGAAGAATGGTTGTGCTGCTGACACCCTTTACCTCCTCTCTTACTTACCCTTGCAACG61TCCTCTAACTCCTCCTCTCTTCGATCTTTCTTGACGACCCGATCAAAATGGTGACCGTCG121AAGAAGTTCGCAAGGCTCAACGGGCTGAGGGTCCGGCCACTGTTTTGGCCATTGGGACAG181CAACTCCTCCCAACTGTGTGGATCAAGCCACATACCCCGACTATTACTTTCGTATCACCA241ACAGTGAGCACAAGACTGAGCTCAAAGAAAAATTCCAGCGCATGTGTGACAAATCTATGA301TCAAGACGCGTTACATGTACTTGACTGAAGAAATTCTGAAAGAGAACCCAACCGTGTGCG361AGTACATGGCTCCCTCACTCGATGCTCGGCAGGACATGGTGGTTGTTGAAGTCCCAAGGC421TTGGCAAAGAGGCTGCCACCAAGGCCATTAAGGAATGGGGACAGCCCAAGTCCAAAATCA481CCCACTTGGTCTTTTGCACTACCAGCGGTGTCGACATGCCCGGCGCCGACTACCAACTCA541CCAAGCTCTTGGGCCTCCGCCCCTCCGTCAAGCGCCTCATGATGTACCAACAAGGGTGCT601TCGCCGGCGGGACGGTCCTCCGTTTGGCCAAGGACTTGGCCGAGAACAACAAGGGTGCAC661GTGTTCTTGTTGTGTGCTCTGAGATCACCGCAGTCACCTTCCGCGGGCCTAGTGACACCC721ACCTTGACAGTCTTGTGGGTCAAGCCTTGTTTGGTGACGGTGCAGCGGCCGTCATCATTG781GTTCGGATCCAGTGCCCGAAGTCGAGAAGCCCTTGTTTGAATTGGTGTCAGCAGCACAAA841CCATTCTTCCCGACAGTGATGGGGCTATTGACGGCCATCTCCGTGAAGTAGGGCTTACAT901TTCACCTTCrCAAGGACGTTCCCGGGCTTATTTCCAAGAATATCGAAAAGAGCCTTAACG961AGGCCTTCAAGCCTATAGGCATTTCAGACTGGAACTCGCTCTTCTGGATTGCACACCCAG1021GTGGCCCTGCTATTCTGGACCAAGTAGAGTCCAAGTTGGCCCTTAAGCCGGAGAAACTAG1081AAGCTACAAGGCAAGTGCTGTCTGATTACGGCAACATGTCGAGTGCGTGTGTCTTGTTTA1141TTTTGGACGAAGTGAGGAGGAAGTCTGCTGAGAAAGGACTCAAAACAACTGGAGAAGGAC1201TGGAGTGGGGCGTACTCTTCGGATTTGGGCCTGGCCTCACTGTTGAGACCGTTGTGCTTC1261ACAGTGTGGGTGCTTGATGACATGAAAATCGGTGTTGATTTATCTATCTG10CTTCGTTTAT1321GTATTGTTTCCGCCTTTTCTGGTTAGAATTTGGCTTTTGGGACATTGTGTGTGGGCGTCA1381TGGGGTTAACTTGGTGCAAGGAAGGACCCTTACTTTCATGTTGTTTACTGCAATATTGAT1441GAAAAAAGGGCCCTGATTGGGCAATGTACTGATGAGTAGAATATGGATTGACGAATAATA1501CTACTCTTTGATTTTCATGAAAAAAAAAAA序列二PRT苹果属王族海棠(Ma/W5ioya/O01MVTVEEVRKAQRAEGPATVLAIGTATPPNCVDQATYPDYYFRITNSEHKTELKEKFQRMC61DKSMIKTRYMYLTEEILKENPTVCEYMAPSLDARQDMVWEVPRLGKEAATKAIKEWGQP121KSKITHLVFCTTSGVDMPGADYQLTKLLGLRPSVKRLMMYQQGCFAGGTVLRLAKDLAEN181NKGARVLVVCSEITAVTFRGPSDTHLDSLVGQALFGDGAAAVIIGSDPVPEVEKPLFELV241SAAQTILPDSDGAIDGHLREVGLTFHLLKDVPGLIS腿EKSLNEAFKPIGISD丽SLFW301IAHPGGPAILDQVESKLALKPEKLEATRQVLSDYGNMSSACVLFILDEVRRKSAEKGUCT361TGEGLEWGVLFGFGPGLTVETVVLHSVGA序列三DNA人工序列CHS1:5，-CACTYgACATgTgCgTAATC-3，。序列四DNA人工序列CHS2:5，-gggCCYAgYgAYACCCAYCTTg-3，。序列五DNA人工序列3R和5F:Long(0.4nM):5'~CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCACGCAGAGT—3'Short(2nM):5'~CTAATACGACTCACTATAGGGC—3'序列六DNA人工序列3PFR1:5，-GGACATCTCCGTGAAGTAGGG-3，序列七DNA人工序列3PF2:5，-CAAgCCTATTgggATTTCgg-3'序列八DNA人工序列5PR1:5，-CGGGAAGAATGGTTTGTGCTGCT-3'序列九DNA人工序列5PR2:5，-GGCGGAAACAATACATAAACGAAGC-3，序列十DNA人工序列MCF:5'-GCGCTACTAGTAGGTGACCGTCGAAGAAGTTC-3'12序列十一DNA人工序列MCR:5，-GTATGGTACCTCAAGCACCCACACTGTG-3，权利要求1、一种蛋白，是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物花色素苷形成相关的由1)衍生的蛋白质。2、权利要求l所述蛋白的编码基因。3、根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述蛋白的cDNA基因为如下l)-4)中任一所述的基因1)其编码序列是序列表中序列l的自5'末端第l-1536位脱氧核糖核苷酸；2)其核苷酸序列是序列表中的序列l;3)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码权利要求1所述蛋白的DM分子；4)与l)的基因具有95%以上的同源性且编码编码权利要求1所述蛋白的DM分子。4、扩增权利要求2或3所述基因的全长或任一片段的引物对。全文摘要本发明公开了一种植物花色素苷形成关键酶的编码基因。该蛋白，是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且能改变植物花色或叶色的由1)衍生的蛋白质。文档编号C12N15/52GK101580819SQ20081022558公开日2009年11月18日申请日期2008年11月6日优先权日2008年11月6日发明者姚允聪,宋婷婷,沈红香,佶田申请人:北京农学院;姚允聪