专利名称：植物类黄酮代谢途径中的关键酶-查尔酮异构酶编码基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及与植物花色素苷形成相关的酶编码基因与应用。
技术背景花的颜色是决定花观赏价值的重要因素之一，花色主耍由类黄酮(flavonoids)、类胡萝卜素 (carotenoids)、生物碱(alkaloid)三大类物质7央定(Tanaka Y,S Tsuda，T Kusumi. Metabolic Engineering to modify flowers color.Plant Cell Physioloy, 1998(1 l):l 119-1126.)。花色素苷(anthocyanins)是类黄酮中一类主要色素，控制着花的粉红色、红色、砖红色、蓝色、紫 色等花色，植物中基本的花色素苷有3种，即花葵素、花青素、花翠素，以及这些花色素的甲基化衍 生物等。(徐纪尊，王丽辉,潘庆玉.观赏植物花色基因转化的研究进展[J].中国农业科技导报,2006, 8 (5): 56 60.)。CHI是类黄酮代谢途径中的第2个关键酶，催化分子内的环化反应，其底物为CHS催化合成的查 尔酮(4， 2，， 4，， 6，-四羟基查尔酮)或6，-脱氧査尔酮(4， 2，， 4'一三羟査尔酮)。在CHI的作用下，底物 的2'位羟基失氢与p位断裂的碳碳双键形成"-O-"键，从而分别形成分子内环化的(2S)-黄烷酮(5， 7， 4'， -三羟査尔酮)或(2S)-5-脱氧黄烷酮(7， 4'， -二羟查尔酮)，其环化反应都需耍底物具有2'位羟基基团(Jez J M，Bowman M E，Dixon R A,et al.Structure and mechanism of the evolutionarily unique plant enzyme chalcone isomerase.Nat Struct Biol, 2000,7:786-791.)。 CHI催化活性具有立体异构性，并且具有pH依赖 性，pH为7.5时，催化活性为90%,而在pH为6.0时的催化活性只有50%(Jez J M， Noel J P.Reaction mechanism of chalcone isomerase .J Biol Chem,2002,277:1361-1369)。 CHI —般被分成两种类型， 一类是 存在于豆科植物中，能催化6'-脱氧查尔酮和6'羟基査尔酮生成异黄酮类化合物和黄酮类化合物(类型 I);一类是存在于非豆科植物中，仅能催化6'脱氧査尔酮转变成5'羟基黄烷酮(类型II)(ShimadaN.Aoki T.Sato S.et al. A cluster of genes encodes the two types of chalcone isomerase involved in the biosynthesis of general flavonoids and legume-specific 5-deoxy(iso)flavonoids in Lotus japonicus.Plant Physiol. 2003, 131: 941-951.)。CHI蛋白具有三明治样的三维折叠形式，这种特殊的折叠形式在植物中是独特的，也被看成植物 特有的基因标记。虽然fi.ram"/^中的CHI蛋白具有异构化柚皮素、紫瑯因、异甘草素的活性，但植 物中的CHI蛋白末梢的a-螺旋区域包含几个可以使植物CHI发生二聚作用的氨基酸残基，在细菌等低 等生物钟不含有这些氨基酸残基，因此低等生物中虽然有CHI-like的蛋白，但不会形成相似的二聚体 (Gensheimer M,Mushegian A.Chalcone isomerase family and fold:No longer unique to plants.Protein Sci, 2004,13:540-544.)。1987年从法国豌豆(Frawc/z 6ea")中采用抗体技术分离出C77/基因(Mehdy M C,Lamb C J. Chalcone isomerase cDNA cloning and mRNA indiction by fungal elicitor.wounding and infection.EMBO丄6:1527-31533,)。 1988年，在矮牵牛(尸e&"/a /^6W&)中以相同的方法得到CW/(VanTunen A J.Koes R E.Spelt C E.et al.Cloning of the two chalcone flavanone isomerase genes from /Ww"'》外Zv7血'coordinate，light-regulated and differential expression of flavonoid genes. 1988.五M50 J.7:1257-1263,)。后来又用同源克隆的方式相继 在拟南芥(/^6油戸'"/!<3//""0!)、 菜旦(p/zoseo/iw vw/gan、)、 苜蓿(MWcago sa"ra)、 翠菊(Ca〃/We/ /7"s c/H力emW、橙(CVm^W"ms!; )、烟草(A7cor""a tateeww)和玉米(zea wa》w)等多种植物中克隆得到。CHI 也不全是植物的专利，最近在人类粪便厌氧细菌raw/w中也纯化到了 CHI蛋白，该蛋白 具有异构化柚皮素、紫柳因、异甘草素的活性，能将这些物质异构化，然后还原、脱水，最后降解成 间苯三酚和3-(4-羟基)-丙氨酸(Heeles C.Braune A.Blaut M.2004.First bacterial chalcone isomerase isolated from ^6a"eW腦raww/肌Arch Microbiol. 181:428-434.)。来源于不同物种的C/Z/基因在不同发育期和不同部位的时空表达特性有所不同，并具有损伤诱导 表达特性。在矮牵牛中，2个C/7/基因的表达方式不同，C///-A(AF233637)在花冠、导管、成熟的花粉 和经紫外线照射的幼苗中表达，而(^//-8(乂145卯)仅在未成熟的花粉中表达。在其花冠、球茎和花药 的发育过程中，C/ -A、 C/7S-J与CHI酶的积累和消失受光调控和紫外辐射诱导，并存在协同性，有 人认为，这种协同性积累效应是C/7/基因和基因mRNA协同表达的结果(van Tunen AJ,Hartman SA，Mur LA,Mol JN. Regulation of chalcone flavonone isomerase(CHI)gene expression in/y^r/iia: the use of alternative promoters in corolla, anthers and pollen .Plant Mol Biol, 1989， 12 :539 551 ,)。光叶百 脉根中，用还原型谷胱甘肽(glutathione， GSH)诱导幼苗后，在10h时C/f/基闲表达量达到最高，其各 成员间也存在表达差异。在另外儿种豆科植物中，细胞在诱导后3-4h其mRNA表达就可达到最大水平。 真菌病原体(Co〃eto的'cAww /Z"cfewW/z!'amOTO侵染胚轴和胚轴受到机械损伤后，细胞内C77/基因的mRNA 明显积累，在受伤后感染的田菁、苜蓿和豌豆根部和根瘤处也能检测到C/7/表达(Goormachtig S，Lievens S,Herman S,van Montagu M,Holsters M.Chalcone reductase-homologous transcripts accumulate during decelopment of stem-borne nodules on the tropical legume S&y6awz'a roWra a.Planta， 1999,209:45-52.; Kim HK,Jang YH,Baek IS,Lee JH，Park MJ，Chung YS,Chung JI，Kim JK. Polymorphism and expression of isoflavone synthase genes from soybean cultivars.Mol Cells'2005,19:67-73.)。在矮牵牛中C/Z/基因由Po编码，突变的花粉因杏尔酮的积累而变成黄色或绿色，而在矮牵牛花突变体中，花药中c/z/的启动子突变后使aw表达下降，并导致花粉颜色变成黄色或绿色。而由于转座子的插入失活造成CH/和DFW的突变同样导致康乃馨的花色变为黄色(Itoh Y,HigetaD，Suzuki A,Yoshida H,Ozeki Y.Excision of transposable elements from the chalcone isomerase and dihydroflavonol 4-reductase genes may contribute to the variegation of the yellow-flowered carnationcao^~//z^.Plant Cell Physiol,43:578-585.)CHI在大麦、洋葱的失活则导致黄酮含量急剧下降和査尔酮 含量增加，洋葱出现黄色球根(Reuber S, Jende-Strid B,Wray V,Weissenbock G.Accumulation of the chalcone isosalipurposide in primary leaves of barley flavonoid mutants indicates a defective chalcone isomerase.Physiol Plant, 1997,101:827-832.)上述C77/基因的表达特征清楚的表明，C77/广泛参与类黄酮 代谢过程，在植物花色和其他器官颜色的形成中起作用，它与异黄酮植保素的合成紧密相关，并涉及到豆科植物对外界的抗胁迫能力。 发明内容本发明的目的是提供一种与植物花色素苷形成相关的酶编码基因.本发明所提供的与植物花色素苷形成相关的酶，名称为CHI，来源于苹果属王族海棠(Afa/船 i o^a/0;)，是如下l)或2)的蛋白质1) 由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2) 将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物 花色素苷形成相关的由l)衍生的酶。上述与植物花色素苷形成相关的酶的cDNA基因也属于本发明的保护范围。 与植物花色素苷形成相关的酶的cDNA基因具体可为如下l) -4)中任一所述的基因 1)其编码序列是序列表中序列1的自5'末端第1-660位脱氧核糖核苷酸；2) 其核苷酸序列是序列表中的序列1;3) 在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码上述与植物花色素苷形成相关的 酶的DNA分子；4) 与l)的基因具有95%以上的同源性，且编码上述与植物花色素苷形成相关的酶的DNA分子。 序列表中的序列1由660个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5'末端第l-660位碱基，编码氨基酸序列是序列表中序列2的CHI。扩增上述C/Z堪因全长或任一片段的弓I物对也属于本发明的保护范围。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物合成及测序工作均由上海生工生物 技术服务有限公司完成。T叫酶，T4DNA连接酶均购自大连宝生物工程有限公司，pBS-T-Vector Kit 载体试剂盒购自天为时代生物公司，BD SMART RACE cDNA Amplification Kit购自Clontech公司。Amp抗生素、Tris饱和酚、水饱和酚、DEPC、 DNA Marker II、琼脂糖、酵母提取物、胰蛋白胨 均购自北京鼎国生物技术有限公司。一、MrC/Z/基因3'端序列的获得以王族海棠(Ma/^i ^a/zy)(北京农学院海棠种质资源圃)为实验材料，提取其叶的总RNA, 将提取得到的总RNA用5(^1的DEPC水溶解，电泳检测。经甲醛变性凝胶电泳分析，结果如图1所 示。从图中可以清晰地看到28SrRNA和18SrRNA两条带，且28SrRNA和18SrRNA含量之比大约为 1:1-2:1。结果表明，提取得到的RNA是完整的，染色结果显示，提取得到的总RNA可以用来进行反 转录。以上述提取得到的叶总RNA为模板，将其反转录为cDNA。再以此cDNA为模板，跟据近缘物种植 物查尔酮合成酶基因保守区段序列，设计3'race上游引物CHDF扩增A^C77/基因的3'端序列。Master Mix 预混物体系如下5预混物体积(HL)ddH2025.810 PCR缓冲液4證P Mixture(2.5 mM)3.2T叫酶(5U/ 1)1总体积34pl，将上述Master Mix预混物平均分成2管，按照下表加入引物:双引物对照 样品CHI3F (序列表中序列三)模板 一 1 ^PCR反应条件先95'C预变性3min;然后95'C变性15S; 68'C退火6min，共30个循环；最后 72'C延伸10min。取lOpL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，其中，M为MARKER II的DNA 分子量标准，1为样品组的PCR扩增结果，2为CHI3F和3R双引物对照。结果表明，双引物对照组 没有扩增出特异条带，只有样品组扩增得到600bp左右的片段。切下B的条带，纯化回收后按照pBS-T-Vector Kit载体试剂盒(大为时代生物公司)说明书将PCR 产物连接到pBS-T载体上，进行测序。经同源性比较分析后确定获得的618bp片段即是MrC/Z/基因的 3'端序列。二、 M"C/Z/基因5'端序列的获得以步骤一获得的保守序列为模板，在其5'端设计引物，进行PCR反应，扩增MrC7/堪因的5'端序列。 Master Mix预混物体系如下预混物体积ddH2025.810 PCR缓冲液4dNTP Mixture(2.5 mM)3.2T叫酶(5U/ 1)1总体积34 ^d，将上述Master Mix预混物平均分成2管，按照下表加入引物:双引物对照 样品5FCHI5R (序列表中序列三)l)al模板 一 1 ^PCR反应条件先95。C预变性3min;然后95。C变性15S; 64'C退火6min，共30个循环；最后 72。C延伸7min。将第一轮PCR产物稀释100倍，取lpL作为模板，以CHI5R1和CHI5R2 (序列表中序列5和6) 为引物，进行巢式PCR反应，PCR反应条件与第一轮相同。取l(VL第二轮PCR产物进行琼脂糖凝胶 电泳检测，结果如图2所示，其中，M为MARKER II的DNA分子量标准，1为样品组的PCR扩增结 果，2为CHI5R2和5F双引物对照。结果表明，双引物对照组没有扩增出特异条带，只有样品组扩增 得到680bp左右的片段。切下目的条带，纯化回收后按照pBS-T-VectorKit载体试剂盒(天为时代生物公司)说明书将PCR 产物连接到pBS-T载体上，进行测序。经同源性比较分析后确定获得的662bp片段即是MrC/Z/基因的 5'端序列。三、iWrC/7/基因全长cDNA序列的获得将上述PCR扩增获得的A^C///基因5'端序列以及3'端序列进行同源性比较，利ffl DNAMAN等 生物软件进行拼接校正，拼接出MrC/Z/基因全长cDNA序列。根据拼接的MrC/7/基因全长cDNA序 列设计引物CHIF和CHIR (序列表中序列7和序列8)，提取王族海棠叶的总RNA,反转录为cDNA, 利用RT-PCR方法扩增全长A^CH/基因，用高保真Pfo酶替换7bg酶，PCR反应混合物如下10xPCR缓冲液2.5nldNTP Mixture(2.5 mM )2牟引物CHIF (100ng/|al)0,5nl引物CHIR (100ng/|ul)模板(反转录的cDNA)1，Pfti酶(5卵)ddH2017，Total25^1PCR反应条件先94'C预变性3min;然后94。C50S， 55°C lmin， 72°C 2min，共35个循环；再772。C延伸7min, 4。C保存。PCR产物进行P/。琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示，其中，M为MARKER II的DNA分子 量标准，1为A^C/Z/基因全长cDNA序列的PCR产物。结果表明获得约662bp的条带。切下该目的条 带，纯化回收后按照pBS-T-Vector Kit载体试剂盒(天为时代生物公司)说明书将PCR产物连接到pBS-T 载体上。对扩增得到的iWK:///基因全长CDNA序列进行测序，测序结果表明，获得660bp的条带，该 660bp的核苷酸片段即为M"C///，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，其编码的氨基酸序列如序列 表中序列2所示。
图1为王族海棠叶总RNA的PCR扩增结果图2为MrOZ/基因的5'RACE PCR扩增结果图3为MK7/f/基因的3'RACE PCR扩增结果图4为MK7/f/基因全长cDNA序列的PCR扩增结果序列表序列二 PRT苹果属王族海棠2191MAPPPSLAGLQVGATAFPPS21VKPPGSSNTLFLGGAGMRGL41EIQGNFVKVTAIGVYLEDSA61VPLLAVKWKGKTAEELSESV81EFFRDIVTGPFEKFIQV腿101LPLTGQQYSEKVSENCVFFW121KSVGIYTDLEGKA正QFIDV141FKDQNFPPGASILFTQSPKG161SLTTSFSKDASMPEATNAVI181ENKLLSETVLESIVGKHGVS201PATKQSLAARLSQLLNGCK*序列三DNA人工序列3R和5F: Long (0.4幽5'~CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCACGCAGAGT-3' Short (2 nM):5'~CTAATACGACTCACTATAGGGC—3'序列四 DNA人工序列CHI3F: 5，- CACCGGGYGCCTCTATTCT -3，。序列五DNA人工序列CHI5R1: 5'-CATTTACACCCGTTCAATAGTTG -3'。序列六 DNA人工序列CHI5R2:5'-CCTCGCGGCCAAACTT-3'序列七 DNA人工序列CHIF: 5' - ATGGCTCCACCACCATCGCTC -3'序列八 DNA人工序列CHIR: 5，- TCATTTACACCCGTTCAATAGTTG -权利要求
1、一种蛋白，是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物花色素苷形成相关的由1)衍生的蛋白质。
2、 权利要求l所述蛋白的编码基因。
3、根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述蛋白的cDNA基因为 如下l) -4)中任一所述的基因1)其编码序列是序列表中序列l的自5'末端第l - 660位脱氧核糖核苷酸；2) 其核苦酸序列是序列表中的序列l;3) 在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码权利要求1 所述蛋白的DNA分子；4) 与1)的基因具有95%以上的同源性且编码编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。
全文摘要
本发明公开了一种与植物类黄酮代谢途径关键酶的编码基因。该蛋白，是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且能改变植物花色或叶色的由1)衍生的蛋白质。
文档编号C12N9/90GK101580827SQ200810225589
公开日2009年11月18日 申请日期2008年11月6日 优先权日2008年11月6日
发明者姚允聪, 宋婷婷, 沈红香, 佶 田 申请人:北京农学院;姚允聪