专利名称：：苹果s基因型快速鉴定方法及其专用试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种苹果s基因型的快速鉴定方法及其专用试剂盒与其在筛选苹果授粉品种中的应用。
背景技术：
：苹果属于配子体型自交不亲和性类型,受单一位点的复等位基因控制，这一位点又称为S位点，位于苹果基因组的第17对染色体上，在一个S位点上苹果种群内含有多个S等位基因。S位点包括花柱S基因(S-RNase基因)和花粉S基因(F-box基因)，自花或者异花授粉时，花粉的S等位基因与花柱中两个S等位基因之一相同时，花粉管在花柱中的生长会受到抑制，从而无法完成受精而表现出自交不亲和性(KaoTH，TsukamotoT.ThemolecularandgeneticbasesofS-RNase-basedself-incompatibility.PlantCell,2004，16:S72陽S83)。苹果品种的S基因型即为自交不亲和基因型，表示各个苹果品种体内的包含的S基因信息。绝大多数苹果品种表现自交不亲和性，但并不是所有的苹果品种之间授粉都是亲和的，S基因型相同的两个品种之间相互授粉表现不亲和性，称异交不亲和性。因此，提早预知苹果品种的s基因型,对于生产上合理配置授粉树,减少因授粉品种选择不利造成的损失，以及在选配育种亲本，鉴定同名异物和异物同名的苹果品种等方面具有重要的意义。Lewis(1952)利用血清免疫学方法从配子体自交不亲和的月见草(Oe""&erawg朋M^)中发现了与S特定位点等位基因相关的蛋白质。此后，从茄科等植物中发现含量丰富并与S位点遗传连锁的花柱糖蛋白。目前为止，已从茄科、蔷薇科、玄参科等多种植物中分离出大量S-RNase基因。根据DNA序列的分析比较，发现其编码的蛋白产物与真菌的RNaseRH和RNaseT2具有同源性，含相同的活性部位，并具有核酸酶活性，故称为S-核酸酶(S-RNase)。目前已有的证据有力证明了S-RNase就是S-基因在花柱中的产物，即花柱S-决定子。S-RNase为一类分泌型糖蛋白，它在雌蕊中特异表达，活体情况下S-RNase在自交后表现酶的活性。一般认为自交不亲和是由于自交后花柱中的S-RNase进入花粉管，作为细胞毒素使自己的花粉管RNA降解，细胞溶解，导致花粉管生长抑制，表现自交不亲和。近年来越来越多的苹果的S-RNase基因被鉴定和克隆，苹果花柱的S-RNase核苷酸结构具有明显的5个保守区(Cl、C2、C3、RC4禾卩C5)和2个高变区(HVa禾BHVb)，其位于高变区(HVa)内的内含子长度具有多态性，可以根据它的这些特点利用PCR来鉴定苹果品种的S基因型。苹果作为配子体型自交不亲和性果树,有众多学者开展其自交不亲和性机理的研究,就品种自交不亲和性基因型的鉴定而言,迄今已鉴定出了30多个S等位基因，但是它们存在命名混乱及重复现象，有关学者经过对这些s等位基因进行测序比对,重新整理和总结和命名了23个苹果S基因(S!、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S1()、Sll、S!5、Si6、Si8、S19、S20、S21、S22、S23、S24、S26、S31禾口S32)。大多数苹果品种为二倍体，含有两个s等位基因，也有部分品种为三倍体含有三个s等位基因，也有个别单倍体苹果品种，只含有一个s等位基因。人们最早是利用田间杂交和自交座果率高低的方法来判断苹果品种的s基因型的。该方法的优点是直观而且易操作，但其也明显存在工作量大、鉴定周期长(必须苹果品种开花之后)、效率低等不足之处，特别是当双亲或一个亲本的s基因型未知或没有适当的测试品种时，就无法确定品种的s基因型。之后的研究发现，苹果的s基因在花柱中编码产物是糖蛋白，具有RNase活性，可以根据花柱S糖蛋白电泳分析法来确定S基因型，但由于其操作过程较复杂，特别是等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术要求较高，而且试验条件不太一致，各S-RNase的PI值可能会有偏差，另外，所用试材是成龄树的花柱，使取材受限制，而且需要试材量大，尤其研究杂种群体时，需要等待杂种个体渡过童期。
发明内容本发明的目的是提供一种苹果S基因型的快速鉴定方法及其专用试剂盒与它们的应用。本发明所提供的鉴定苹果S基因型的专用试剂盒，包括下述(1)-(16)所示的引物对(1)扩增S!基因的引物对序列为序列表中序列1的核苷酸片段和序列为序列表中序列2的核苷酸片段组成的引物对；(2)扩增S2基因的引物对序列为序列表中序列3的核苷酸片段和序列为序列表中序列4的核苷酸片段组成的引物对；(3)扩增S3基因的引物对序列为序列表中序列5的核苷酸片段和序列为序列表中序列6的核苷酸片段组成的引物对；(4)扩增S4基因的引物对序列为序列表中序列7的核苷酸片段和序列为序列表中序列8的核苷酸片段组成的引物对；(5)扩增S5基因的引物对序列为序列表中序列9的核苷酸片段和序列为序列表中序列10的核苷酸片段组成的引物对；(6)扩增S7基因的引物对序列为序列表中序列11的核苷酸片段和序列为序列表中序列12的核苷酸片段组成的引物对；(7)扩增S9基因的引物对序列为序列表中序列13的核苷酸片段和序列为序列表中序列14的核苷酸片段组成的引物对；(8)扩增Sh)基因的引物対序列为序列表中序列15的核苷酸片段和序列为序列表中序列16的核苷酸片段组成的引物对；(9)扩增Sn基因的引物对序列为序列表中序列17的核苷酸片段和序列为序列表中序列18的核苷酸片段组成的引物对；(10)扩增S^基因的引物对序列为序列表中序列19的核苷酸片段和序列为序列表中序列20的核苷酸片段组成的引物对；(11)扩增S2o基因的引物对序列为序列表中序列21的核苷酸片段和序列为序列表中序列22的核苷酸片段组成的引物对；(12)扩增S2i基因的引物对序列为序列表中序列23的核苷酸片段和序列为序列表中序列24的核苷酸片段组成的引物对；(13)扩增S23基因的引物对序列为序列表中序列25的核苷酸片段和序列为序列表中序列26的核苷酸片段组成的引物对；(14)扩增S24基因的引物对序列为序列表中序列27的核苷酸片段和序列为序列表中序列28的核苷酸片段组成的引物对；(15)扩增S26基因的引物对序列为序列表中序列29的核苷酸片段和序列为序列表中序列30的核苷酸片段组成的引物对；(16)扩增S^基因的引物对序列为序列表中序列31的核苷酸片段和序列为序列表中序列32的核苷酸片段组成的引物对。上述引物分别以溶液形式保存，浓度为10pM—100pM;优选为10pM;为了确保PCR反应不受盐等杂质的干扰，引物溶剂采用灭菌的超纯水。各引物分别保存于一个离心管中，共32管，将这些离心管集中放置于一个试剂盒中，方便随时取用。上述(1)-(16)所示每个S基因的一对引物优选为分别以上下游引物相同的浓度混合置于同一试剂容器中，以便PCR反应过程中，上下游引物可以于一次取用，节省PCR体系配制的程序。上述试剂盒中配有灭菌的超纯水、dNTP(10mM)、10xTaqBuffer、Taq酶溶液(5U/pL)，以方便PCR体系的配制。本发明所提供的鉴定苹果S基因型的方法，是以待检测苹果品种的基因组DNA为模板，用上述试剂盒的引物对分别进行PCR扩增，根据扩增产物确定基因型。上述根据扩增产物确定基因型的方法是检测上述试剂盒的引物对是否以待检测苹果品种的基因组DNA为模板扩增得到DNA片段；如果所述扩增Si基因的引物对扩增得到DNA片段，则所述待测苹果品种含有Si基因，如果所述扩增S2基因的引物对扩增得到DNA片段，则所述待测苹果品种含有S2基因，如果所述扩增S3基因的.引物对扩增得到DNA片段，则所述待测苹果品种含有S3基因，如果所述扩增S4基因的引物对扩增得到DNA片段，则所述待测苹果品种含有S4基因，如果所述扩增Ss基因的引物对扩增得到DNA片段，则所述待测苹果品种含有S5基因，如果所述扩增S7基因的引物对扩增得到DNA片段，则所述待测苹果品种含有S7基因，如果所述扩增S9基因的引物对扩增得到DNA片段，则所述待测苹果品种含有S9基因，如果所述扩增Si。基因的引物对扩增得到DNA片段，则所述待测苹果品种含有SH)基因，如果所述扩增Sn基因的引物对扩增得到DNA片段，则所述待测苹果品种含有Su基因，如果所述扩增Si9基因的引物对扩增得到DNA片段，则所述待测苹果品种含有Si9基因，如果所述扩增S2。基因的引物对扩增得到DNA片段，则所述待测苹果品种含有S2o基因，如果所述扩增S"基因的引物对扩增得到DNA片段，则所述待测苹果品种含有S2,基因，如果所述扩增S23基因的引物对扩增得到DNA片段，则所述待测苹果品种含有S23基因，如果所述扩增S24基因的引物对扩增得到DNA片段，则所述待测苹果品种含有S24基因，如果所述扩增S26基因的引物对扩增得到DNA片段，则所述待测苹果品种含有S26基因，如果所述扩增S31基因的引物对扩增得到DNA片段，则所述待测苹果品种含有S3,基因，该待测苹果品种含有的所有S基因的组合即为该苹果品种的S基因型。为了确保精确判断，上述方法还应检测各引物对扩增产物片段的大小，如果所述扩增S,基因的引物对扩增得到DNA片段，并且大小是为733bp，则所述待测苹果品种含有St基因；如果所述扩增S2基因的引物对扩增得到DNA片段，并且大小是为498bp，则所述待测苹果品种含有S2基因；如果所述扩增S3基因的引物对扩增得到DNA片段，并且大小是为291bp，则所述待测苹果品种含有S3基因；如果所述扩增S4基因的引物对扩增得到DNA片段，并且大小是为532bp，则所述待测苹果品种含有S4基因；如果所述扩增S5基因的引物对扩增得到DNA片段，并且大小是为1446bp，则所述待测苹果品种含有S5基因；如果所述扩增S7基因的引物对扩增得到DNA片段，并且大小是为396bp，则所述待测苹果品种含有S7基因；如果所述扩增S9基因的引物对扩增得到DNA片段，并且大小是为521bp，则所述待测苹果品种含有S9基因；如果所述扩增Su)基因的引物对扩增得到DNA片段，并且大小是为202bp,则所述待测苹果品种含有Su)基因；如果所述扩增Su基因的引物对扩增得到DNA片段，并且大小是为677bp，则所述待测苹果品种含有Sn基因；如果所述扩增S^基因的引物对扩增得到DNA片段，并且大小是为480bp，则所述待测苹果品种含有S,9基因；如果所述扩增S2o基因的引物对扩增得到DNA片段，并且大小是为881bp，则所述待测苹果品种含有S2o基因；如果所述扩增S2i基因的引物对扩增得到DNA片段，并且大小是为583bp，则所述待测苹果品种含有S2i基因；如果所述扩增S23基因的引物对扩增得到DNA片段，并且大小是为450bp，则所述待测苹果品种含有S23基因；如果所述扩增S24基因的引物对扩增得到DNA片段，并且大小是为420bp，则所述待测苹果品种含有S24基因；如果所述扩增S26基因的引物对扩增得到DNA片段，并且大小是为422bp，则所述待测苹果品种含有S26基因；如果所述扩增Sw基因的引物对扩增得到DNA片段，并且大小是为556bp，则所述待测苹果品种含有S3i基因。所述待检测苹果品种的基因组DNA是以待检测苹果品种幼叶为材料提取DNA得到的。本发明所提供的上述方法及其专用试剂盒应用于给自交不亲和苹果品种选配合适的授粉苹果品种。所述筛选用于给自交不亲和苹果品种授粉的苹果品种的方法是利用上述方法确定苹果品种的s基因型，选择与种植苹果品种具有不同S基因型的苹果品种作为用于授粉的苹果品种。本发明的方法经过对苹果各个S-RNase基因一级结构进行序列分析，在各基因序列特异区域设计特异性引物，建立稳定的PCR反应体系，用各苹果品种DNA为模板，对供试苹果品种基因组DNA特异扩增来确定其S基因型。该方法具有方便实验取材，简化实验操作，可快速鉴定苹果品种的S基因型。将使用的引物制成试剂盒，更方便使用，大大节省了鉴定时间。该方法可快速鉴定苹果自交不亲和品种S基因型，通过其S基因型筛选授粉树，对苹果种植及杂交研究具有重大的应用价值。图i是苹果S-RNase基因特异性引物PCR扩增结果凝胶电泳图。图2为苹果S-RNase基因特异性引物PCR扩增鉴定S基因型实例结果。具体实施例方式实施例1、苹果S基因型的鉴定1、苹果各S基因特异性片段的扩增经过对苹果各个S-RNase基因一级结构进行序列分析，在各基因序列特异区域设计各个S基因的特异性引物，弓l物序列和各引物预测扩增的特异性片段大小如表1所示。表1.苹果S基因特异性引物<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>分别利用上述引物，从已知s基因型的苹果品种中扩增各个s基因特异性片段，从苹果品种富士(Fuji)(SiS9)中扩增S,、S9基因特异性片段；从苹果品种金冠(GoldenDelicious)(S2S3)中扩增Sz和S3基因特异性片段，从苹果品种伏花皮(Gravenstein)(S4SS2())中扩增S4基因特异性片段，从苹果品种嘎拉(Gala)(S2S5)中扩增S5基因特异性片段，从苹果品种红玉(Jonathan)(S7S9)中扩增S7基因特异性片段，从苹果品种旭(Madntosh)(S1()S22)中扩增81()基因特异性片段，从苹果品种维琴尼(Virginiacrad)(SsSu)中扩增Sn基因特异性片段，从苹果品种元帅(Delicious)(S9S19)中扩增Sw基因特异性片段，从苹果品种印度(Indo)(S7S2())中扩增S2o基因特异性片段，从苹果品种楸子(M^^/^m/o/ZaBorkh)(S!Su)中扩增Su基因特异性片段，从苹果品种澳洲青苹(Gra皿ySm池)(S3S23)中扩增823基因特异性片段，从苹果品种英格兰(Ingram)(S^^)中扩增824基因特异性片段，从苹果品种光辉(Radiant)(S4S26)中扩增826基因特异性片段，从苹果品种昆玛斯(Appleofcommerce)(S23S31)中扩增S31基因特异性片段。其中，分别以苹果品种幼嫩叶片，CTAB法提取其基因组DNA作为模板；PCR反应体系如表2所示，各引物扩增的退火温度如表l所示。表2:S基因片段的特异性PCR扩增体系<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>扩增条件为先94"预变性3min;然后94°C变性30s;退火30s(根据不同引物选择退火温度，如表2所示)；72'C延伸1min;35个循环；最后72"延伸10min。将PCR扩增产物进行凝胶电泳，检测其大小，结果如图l所示，结果表明，上述每次扩增均得到一个预计的苹果品种基因型特异性片段，片段大小与表1所示的预测扩增片段大小一致。图1中泳道M为分子量Marker(M)，条带大小从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp，泳道St至S31是各个S基因特异性扩增片段电泳图。2、苹果S基因型鉴定本发明的方法鉴定苹果S基因型，是以待测苹果品种的基因组DNA为模板，用表1所述16种S基因(Si，S2，S3，S4，S5，S7,S9，Sui，Su，S19，S20，S21，S23，S24，S26，S31)的扩增引物对分别进行PCR扩增反应，然后进行凝胶电泳，检测是否可以扩增得到PCR产物片段，如果扩增得到一个片段，则该苹果品种的S-RNase基因含有该引物对扩增的相应S基因，该苹果品种的S基因位点由该S基因控制，所有控制该苹果品种S基因位点的S基因种类的组合，即为该苹果品种的基因型。如果为了精确，可以将电泳检测的PCR产物片段的大小与表1所示的预测片段大小进行比对，以确保扩增片段即为该基因特异性片段。如果表1所示的引物对若扩增得到特异性PCR产物片段，则该苹果品种的S-RNase基因含有该引物对扩增的相应S基因。上述PCR反应的体系如表2所示。为了方便批量检测，以及方便检测技术人员的操作，合成表l所述的引物，并将它们分别以溶液形式保存，浓度为10pM—100^iM;本实施例为10^M;为了确保PCR反应不受盐等杂质的干扰，引物溶剂采用灭菌的超纯水。各引物分别保存于一个离心管中，共32管，将这些离心管集中放置于一个试剂盒中，方便随时取用，即组成了本发明的苹果品种S基因型检测专用试剂盒。为了方便PCR体系的配置，将表l中鉴定每个S基因的一对引物溶于同一溶液中，得到检验表1中相应S基因的引物对溶液，表l中共有鉴定16种S基因的引物对，即试剂盒包括16种引物对溶液。将每个S基因检测的一对引物溶液保存于一个离心管中。本实施例中，还在上述试剂盒中配有灭菌的超纯水、dNTPUOmM)、10xTaqBuffer、Taq酶溶液(5U/(aL)，以方便PCR体系的配制。利用上述试剂盒，按照上述方法，进行PCR扩增时扩增条件为先94"C预变性3min;然后94t变性30s;退火30s(根据不同引物选择退火温度，如表2所示)；72。C延伸1min;35个循环；最后72。C延伸10min。本实施例以鉴定下述苹果品种为例，说明本发明的方法及其专用试剂盒的效果按照上述方法，分别鉴定苹果自交不亲和品种'红国光，、'昂林，、'岩木，、'静香，、'秦冠，、'奥州，、'澳洲青萍，、M犬花皮，、'长红，、'皇后桔苹，、'姬神，、'北之幸，、'瑞光，、'帝国，、'发现，、'楸子，、'光辉，和'昆玛斯'的S基因型。采取以上18个待检测苹果品种幼嫩叶片，CTAB法提取其基因组DNA，经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，于-2(TC贮存备用，作为模板。按照上述方法进行PCR扩增反应，PCR反应结束后，取5-10)aLPCR产物用1.5%琼脂糖电泳检测，表1所示的引物对是否扩增得到DNA片段，以此判断该苹果品种的S-RNase基因含有该引物对扩增的相应S等位基因。结果如图2所示，图中1-18分别为苹果品种'红国光，、<昂林，、'岩木，、'静香，、'秦冠，、'奥州，、'澳洲青萍，、M犬花皮，、'长红，、'皇后桔苹，、'姬神，、'北之幸，、'瑞光，、'帝国，、'发现，、'楸子，、'光辉，和'昆玛斯，。可以看出18个苹果品种中'红国光'、'昂林，禾P'楸子'在S,中有扩增条带，即用表l的S,的引物对扩增得到S,基因特异性片段；'红国光'、'岩木'、'静香'与'秦冠'在S2中有扩增条带，即用表l的S2的引物对扩增得到S2基因特异性片段；'岩木，、'静香'、'奥州'和"澳洲青萍'在S3中有扩增条带，即用表1的S3的引物对扩增得到S3基因特异性片段；'伏花皮'和'光辉'在S4中有扩增条带，即用表1的S4的引物对扩增得到S4基因特异性片段；'秦冠'、'长红'和'皇后桔苹'在S5中有扩增条带，即用表l的S5的引物对扩增得到S5基因特异性片段；'长红'、'姬神'与'北之幸'在S7中有扩增条带，即用表l的S7的引物对扩增得到S7基因特异性片段；'昂林，、'奥州，、'皇后桔苹，、'姬神，、'瑞光'在S9中有扩增条带，即用表l的S9的引物对扩增得到S9基因特异性片段；'帝国'与'发现'在Sw中有扩增条带，即用表1的S,。的引物对扩增得到Su)基因特异性片段；'伏花皮'在Su中有扩增条带，即用表1的S的引物对扩增得到Su基因特异性片段;'瑞光'与'帝国'在Sw中有扩增条带，即用表l的S,9的引物对扩增得到Sw基因特异性片段；'静香'、'伏花皮，禾卩'北之幸，在S2。中有扩增条带，即用表1的S2。的引物对扩增得到S2。基因特异性片段；'楸子'在S^中有扩增条带，即用表1的S21的引物对扩增得到Sa基因特异性片段；'澳洲青萍'与'昆玛斯'在S23中有扩增条带，即用表1的S23的引物对扩增得到S23基因特异性片段；'发现'在S24中有扩增条带，即用表l的S24的引物对扩增得到S24基因特异性片段；'光辉'在S26中有扩增条带，即用表1的S26的引物对扩增得到S26基因特异性片段；'昆玛斯'在S3冲有扩增条带，艮P用表1的S3,的引物对扩增得到Sw基因特异性片段。从而得出'红国光'的S基因型是SiS2、'昂林，的S基因型是S"9、'岩木'的S基因型是S2Ss、'静香，的S基因型是S2S3S2Q、'秦冠，的S基因型是S2Ss、'奥州，的S基因型是S3S9、'澳洲青萍'的S基因型是S3S23、M犬花皮，的S基因型是S4SnS2。、'长红'的S基因型是SsS7、'皇后桔苹，的S基因型是SsS9、'姬神，的S基因型是S7S9、'北之幸'的S基因型是S7S2。、'瑞光，的S基因型是S9Si9、'帝国'的S基因型是Su)Sw、'发现'的S基因型是Sk)S24、'楸子'的S基因型是SiS2,、'光辉'的S基因型是S4S26、'昆玛斯'的S基因型是S23S^上述结果确定了各个苹果品种的s基因型，如果具有不同s基因型的苹果品种所携带的s基因均不相同，他们之间可以互相作为授粉树，确保其坐果率。通过Kobel(1939)的方法(KobelF，SteineggerP，AnlikerJ.WeitereUntersuchungentiberdieBefruchtungsverhItnissederApfel-undBimsorten.LandwJbSchweiz,1939,53:160-191)对上述品种进行自交和相互间杂交试验，分析其坐果率，结果与上述基因型鉴定方法得到的结论相同。序列表〈160>32<210〉1<211〉23<212><213>人工序列<220〉<223〉〈400〉1tgtaaggcaccgccatatcatac23<210>2<211>25<212〉腿〈213〉人工序列<220>〈223〉<400>2caacctcaaccaattcagtcaatga25<210〉3<211>25<212>腿<213>人工序列〈220〉<223><400〉3<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula><210>4〈211>23<212〉DNA〈213>人工序列<220>〈223〉〈400>4ttgaggtttggttccttaccatg23〈210>5〈211>24〈212〉DNA<213>人工序列〈220〉〈223〉<400>5ggcgaaaattaaaccggagaagaa24〈210〉6〈211>26〈212>醒〈213〉人工序列〈220〉<223>〈400〉6cctctcgtcctatatatggaaatcac加〈210〉7<211〉25<212〉DNA〈213>人工序列〈220〉〈223><400>7attgcaagacaaggaatcgtcggaa<210>8<211>23〈212>腿<213>人工序列〈220><223>〈400〉8agaaatgtgctctgtttttatcg<210>9〈211>21<212〉腿<213〉人工序列<220〉，〈223〉〈400〉9ggtcaaacccacggcgtctca<210〉10<211>21<212>DNA<213〉人工序列<220〉<223><400>10attcagttatcccattcttcg21〈210>11〈211〉24<212>薩〈213>人工序列〈220>〈223〉〈400>11agtaaatcaaccgtggatgctcag24<210>12〈211>25<212〉腿<213>人工序列〈220>〈223>〈400>12ttacaatatctacctgtttcctggg25〈210>13〈211〉25〈212>薩<213>人工序列<220〉〈223〉〈400>13ccactttaatcctactccttgtaga25〈210>14<211〉25<212〉NDA<213〉人工序列<220><223〉〈400〉14tcaatttccttctgtgtcctgaatt25<210>15<211〉20<212>NDA<213〉人工序列〈220〉<223〉<400〉15ccaaacgtactcaatcgaag20<210〉16<211>20<212〉NDA<213〉人工序列<220>〈223〉<400>16tcccgtgtcctgaatctccc20<210>17<211>19<212>靈〈213>人工序列<220>〈223〉〈400>17aaatattgcaaggcgccgc19<210>18<211>24<212>DNA<213>人工序列<220〉<223〉<400>18tttcaatatctaccagtctccggc24<210>19<211>21<212>腿<213>人工序列〈220>〈223〉<400>19gccttcaaacaagaatggacc21<210>20<211>23<212>DNA<213>人工序列<220〉<223><400〉20tcaatatccaccaatga.cctgtt23<210>21<211〉19<212>DNA<213>人工序列<220><223〉〈400>21gttgtggccttcagactcg19<210>22<211>24<212〉DNA<213>人工序列<220><223>〈400>22ggccaactacttttatttttcatc24<210>23<211>25<212>DNA〈213>人工序列〈220><223>〈400>23aagtaattgcccgataaggaacata25〈210>24<211〉25<212>DNA<213>人工序列〈220>〈223><400〉24agtttatgaaatgttctccgctgta25<210>25<211>25〈212>DNA〈213〉人工序列<220>〈223〉<400>25aagaatacaaccattacgcctcagc25〈210>25<211>26<212>腿<213>人工序列<220〉<223><400>26attgttggtactaatgcttatggcg25<210〉27〈211>21〈212>墜<213〉人工序列<220>〈223><400>27atggctcctgtgcgtcttccc21<210〉28〈211>23〈212>薩〈213>人丁序列〈220><223>〈400>28cgtcatccgtgtatagggcaact23<210〉29<formula>formulaseeoriginaldocumentpage24</formula>〈211>24〈212>DNA〈213>人工序列<220〉<223><400〉32tttcaa/tatctaccagtctccggc2权利要求1、一种鉴定苹果S基因型的专用试剂盒，包括(1)-(16)所示的引物对(1)扩增S1基因的引物对序列为序列表中序列1的核苷酸片段和序列为序列表中序列2的核苷酸片段组成的引物对；(2)扩增S2基因的引物对序列为序列表中序列3的核苷酸片段和序列为序列表中序列4的核苷酸片段组成的引物对；(3)扩增S3基因的引物对序列为序列表中序列5的核苷酸片段和序列为序列表中序列6的核苷酸片段组成的引物对；(4)扩增S4基因的引物对序列为序列表中序列7的核苷酸片段和序列为序列表中序列8的核苷酸片段组成的引物对；(5)扩增S5基因的引物对序列为序列表中序列9的核苷酸片段和序列为序列表中序列10的核苷酸片段组成的引物对；(6)扩增S7基因的引物对序列为序列表中序列11的核苷酸片段和序列为序列表中序列12的核苷酸片段组成的引物对；(7)扩增S9基因的引物对序列为序列表中序列13的核苷酸片段和序列为序列表中序列14的核苷酸片段组成的引物对；(8)扩增S10基因的引物对序列为序列表中序列15的核苷酸片段和序列为序列表中序列16的核苷酸片段组成的引物对；(9)扩增S11基因的引物对序列为序列表中序列17的核苷酸片段和序列为序列表中序列18的核苷酸片段组成的引物对；(10)扩增S19基因的引物对序列为序列表中序列19的核苷酸片段和序列为序列表中序列20的核苷酸片段组成的引物对；(11)扩增S20基因的引物对序列为序列表中序列21的核苷酸片段和序列为序列表中序列22的核苷酸片段组成的引物对；(12)扩增S21基因的引物对序列为序列表中序列23的核苷酸片段和序列为序列表中序列24的核苷酸片段组成的引物对；(13)扩增S23基因的引物对序列为序列表中序列25的核苷酸片段和序列为序列表中序列26的核苷酸片段组成的引物对；(14)扩增S24基因的引物对序列为序列表中序列27的核苷酸片段和序列为序列表中序列28的核苷酸片段组成的引物对；(15)扩增S26基因的引物对序列为序列表中序列29的核苷酸片段和序列为序列表中序列30的核苷酸片段组成的引物对；(16)扩增S31基因的引物对序列为序列表中序列31的核苷酸片段和序列为序列表中序列32的核苷酸片段组成的引物对。2、一种鉴定苹果S基因型的方法，是以待检测苹果品种的基因组DNA为模板，用权利要求1所述的试剂盒的引物对分别进行PCR扩增，根据扩增产物确定待检测苹果品种的S基因型。3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述根据扩增产物确定基因型的方法是检测权利要求1所述的试剂盒的引物对是否以待检测苹果品种的基因组DNA为模板扩增得到DNA片段；如果所述扩增S！基因的引物对扩增得到DNA片段，则所述待测苹果品种含有Si基因，如果所述扩增S2基因的引物对扩增得到DNA片段，则所述待测苹果品种含有S2基因，如果所述扩增S3基因的引物对扩增得到DNA片段，则所述待测苹果品种含有S3基因，如果所述扩增S4基因的引物对扩增得到DNA片段，则所述待测苹果品种含有S4基因，如果所述扩增Ss基因的引物对扩增得到DNA片段，则所述待测苹果品种含有S5基因，如果所述扩增S7基因的引物对扩增得到DNA片段，则所述待测苹果品种含有S7基因，如果所述扩增S9基因的引物对扩增得到DNA片段，则所述待测苹果品种含有S9基因，如果所述扩增Su)基因的引物对扩增得到DNA片段，则所述待测苹果品种含有Su)基因，如果所述扩增Su基因的引物对扩增得到DNA片段，则所述待测苹果品种含有Su基因，如果所述扩增S^基因的引物对扩增得到DNA片段，则所述待测苹果品种含有Sw基因，如果所述扩增S2Q基因的引物对扩增得到DNA片段，则所述待测苹果品种含有S2。基因，如果所述扩增S2i基因的引物对扩增得到DNA片段，则所述待测苹果品种含有S2r基因，如果所述扩增S23基因的引物对扩增得到DNA片段，则所述待测苹果品种含有S23基因，如果所述扩增S24基因的引物对扩增得到DNA片段，则所述待测苹果品种含有S24基因，如果所述扩增S26基因的引物对扩增得到DNA片段，则所述待测苹果品种含有S26基因，如果所述扩增S"基因的引物对扩增得到DNA片段，则所述待测苹果品种含有S^基因，该待测苹果品种含有的所有S基因的组合即为该苹果品种的S基因型。4、根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述待检测苹果品种的基因组DNA是以待检测苹果品种幼叶为材料提取得到的。5、权利要求2-4中任意一项所述的方法在给自交不亲和苹果品种选配授粉苹果品种中的应用。6、根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述给自交不亲和苹果品种选配授粉苹果品种的方法是利用权利要求2-4中任意一项所述的方法确定苹果品种的S基因型，具有不同S基因型且所含有的S基因均不相同的苹果品种可相互作为授粉苹果品种。全文摘要本发明公开了一种苹果S基因型的鉴定方法及其专用试剂盒。该方法，是以待检测苹果品种的基因组DNA为模板，用鉴定苹果品种S基因型的引物对扩增，根据扩增结果确定该待测苹果品种的S基因型。该方法可快速鉴定苹果自交不亲和品种S基因型，通过其S基因型筛选授粉树，对苹果种植及杂交研究具有重大的应用价值。文档编号C12Q1/68GK101392296SQ20081022571公开日2009年3月25日申请日期2008年11月7日优先权日2008年11月7日发明者李天忠,韩振海,龙慎山申请人:中国农业大学