专利名称：：一种检测成人早衰老综合症的基因诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种检测成人早衰老综合症的基因诊断试剂盒，更具体地说是一种利用WRN基因2806insA突变检测的试剂盒，该试剂盒及方法可用于该疾病的辅助诊断和新药丌发，属于生物
技术领域：
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背景技术：
：沐erner纟宗合症(沐ernersyndrome,WS)，又禾尔成人早老症(Adultprogeria),成人早衰老综合症(Adultprematureagingsyndrome)，是一种罕见的常染色体隐性遗传性疾病。WS的临床表现主要发生在结缔组织，内分泌系统，免疫系统，神经系统等。包括身材矮小，早生华发，皮肤纤维化、硬皮样改变，白内障，皮下组织钙化，糖尿病，甲状腺功能低下，高脂血症，系统性红斑狼疮，痴呆，精神分裂症等。ws患者在童年发育基本正常，到18岁后开始出现各种症状，由于皮下脂肪菲薄，以及皮肤纤维化，形成了特殊的面部特征，包括假性突眼，喙状鼻，口周放射状沟纹，牙齿突出，下颌后縮，被称为"鸟样面容"。WS患者可伴发各种肿瘤，包括软组织肉瘤，骨肉瘤，黑素瘤，甲状腺癌，脑(脊)膜瘤等。由于WS患者早期出现多系统老化表现，其寿命大大縮短，平均寿命仅47岁。WS发病机制的研究对阐明人类衰老的发生机制以及老龄化相关疾病具有重要的借鉴作用，因此WS被称为"人类老化的天然基因模型"。1992年GOTO等将WRN基因(WRN)定位于8pll.1-21.1，WRN全长5.2kb，包含35个外显子，编码1432个氨基酸。WRN蛋白是RecQ家族成员DNA解螺旋酶，它包含了7个解螺旋酶的基序，其中2个是ATP结合蛋白。DNA解螺旋酶的重要作用是在DNA复制过程中形成解链复合物，参与DNA解链和DM损伤修复。结构分析显示WRN蛋白包括蛋白中部的RecQ型解螺旋结构域和N端的核酸酶结构域。WRN蛋白既有3'-5'解螺旋酶活性，又有核酸外切酶活性。在DNA代谢过程中产生的各种DNA结构均是WRN蛋白的底物。WRN蛋白C端1369-1402个氨基酸残基具有核酸定位作用。另外，在RecQ解螺旋酶结构域中949-1092个氨基酸残基也具有核酸定位作用。WRN蛋白主要定位在细胞核仁中，当DNA损伤时WRN蛋白在细胞核DNA损伤部位聚集。在WRN蛋白C端有两个结构域RecQ解螺旋酶保守结构域(helicaseconservedregion，RQC)和解螺旋酶，核糖核酸酶，C端保守结构(helicase，RNaseD，C-terminalconservedRegion,HRDC)。研究证实WRN蛋白通过这两个结构域与底物DNA或蛋白相互作用。在WS患者中均发现WRN基因突变，到2006年共发现50个突变点，这些突变包括错义突变、框移突变、无义突变等，分布于各个外显子。WRN基因具有明显的异质性，不同种族突变形式完全不同。目前对于中国人群中Werner综合症的报道均为个案报道，也缺少基因诊断的研究，对于中国人群WRN基因突变热点研究尚属空白。经过现有国内外文献检索，未见有Werner综合症WRN基因2806insA突变的相关报道，中国人群中WRN基因的发现，不仅会促进该病发病机理等基础研究的发展，还将大大促进Werner综合症的基因诊断和治疗的开展。通过产前筛查及新生儿WRN基因突变筛查，可以降低Werner综合症患儿的出生率，指导携带致病基因的患者生活行为，预防疾病发生，大大缓解社会压力。另外WRN基因研究对长寿与衰老的研究都会起到重要作用。体外检测Werner综合症相关基因WRN的2806insA突变的试剂盒对于这些学科研究与发展都是不可或缺的。
发明内容本发明要解决的第一个技术问题是，提供一种诊断成人早衰老综合症(Werner综合征)的方法，通过检测疑似患者的待测样本是否存在具有本发明所述的2806msA突变而确认患者是否Werner综合征，为临床诊断和治疗提供参考。本发明要解决的第二个技术问题是，提供一种成人早衰老综合症(Werner综合征)2806insA突变的试剂盒。本发明要解决的第三个技术问题是，提供成人早衰老综合症(Werner综合征)2806insA突变在诊断Werner综合征相关疾病中的应用。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种诊断成人早衰老综合症的方法，包括如下步骤(1)采集待测个体的血液、体液或组织标本，提取DNA;(2)以该DNA为模板，以针对WRN基因所述突变位点设计的PCR引物进行PCR反应，得到PCR反应产物；(3)将得到的PCR产物进行测序分析，将所得标本序列与正常基因序列进行比较，确认是否有突变；(4)根据以上结果判断待测个体是否为WRN基因突变导致的Werner综合症。在本发明中，可采用本领域的检测点突变的常规方法来检测WRN基因的突变位点，如PCR测序法。在本发明中使用的PCR引物可以依据已知的核苷酸序列，利用PrimerPremier5.()进行设计，通常为15-30个碱基，GC含量为45-50%左右，在适当的温度下与木端特异性结合。在本发明中，WRN基因的序列参考GenbankGeneID:NM—000553。所述针对WRN基因所述突变位点设计的PCR引物为WRN2806-F:5'-CCCACGGAGGGTTTCTATCT-3'(SEQIDNo.1)WRN2806-R:5'-GAACCATTGGCAGTGCTGTC-3'(SEQIDNo.2)一种检测成人早衰老综合症2806insA突变的试剂盒，试剂盒的成分和含量如下，于一20。C保存20ul10XPCR缓冲液(Phamiacia)，4ul10mMdNTP混合液(Pharmacia)，2ul(5unit/ul)TaqDNA聚合酶(Takara)，各10ul(10pmol/ul)Fl(SEQIDNO.1)和Rl(SEQIDNO.2)引物，1.5ml纯7K。例如，本发明的一个实施方案中提供一个检测WRN基因突变的试剂盒，本容器内装有用以检测WRN基因2806突变的成分，与之同时提供可以是经政府药物管理机构审核的、有关药品或生物制品的制造、使用及销售信息。例如，采用PCR扩增后，直接检测样品中WRN基因突变位点的试剂盒，可含有扩增引物、dNTP、用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液、测序反应所需试剂等的一种或多种。本领域技术人员已知，以上组分仅是示意性的，例如，所述引物可以采用上述的一对WRN2806-F和WRN2806-R引物，所述的用于PCR反应的DNA聚合酶是能够用于PCR扩增的酶。本发明通过神经外科门诊收集脑膜瘤患者，在患者及家属自愿的前提下，签署知情同意书后，留取5-10ml血样，建立住院病历资料库，详细记录患者病情、家系中发病情况以及联系方式。然后应用酚氯仿抽提方法提取基因组DNA，定量后入库，-20°C保存，每份DNA均准确对应登记的患者临床资料。根据PrimerPremier5.0进行设计引物，包含WRN基因2806位点及两侧序列，进行PCR扩增。对PCR产物进行直接测序测序引物与PCR扩增引物相同，应用ABI公司3730DNA测序仪进行正反向测序。将得到的序列与Genbank中的标准序列比对，确定2806突变位点。按正常阅读框进行翻译以确定WRN基因突变位点。以岩斜脑膜瘤病人作为研究对象，通过对3例该病家系成员及20例正常对照的WRN基因编码区外显子的筛査，发现一名患者在外显子8上具有WRN基因新的突变。该患者为一复合杂合子。这个突变在20例对照组中均未被发现，说明这一变位点与WRN基因相关。插入碱基后导致移码突变，使得插入点下游的DNA编码框架全部改变，终止密码子过早出现，造成多肽链合成的提前终止，肽链长度縮短，成为无活性的多肽片段。由于WRN蛋白是RecQ家族成员DNA解螺旋酶，插入碱基后导致的移码突变最终影响了DNA解链和DNA损伤修复。本发明还提供了WS突变基因在诊断和或治疗WS中的应用，通过检测來自患者的待测样本中是否存在WRN基因所述突变而判断患者系统疾病的原因及类型，进而为临床诊断和治疗提供参考。此外在进一步的临床治疗中，在检测结果为发生了WRN基因的所述突变之后，可以将正常的基因导入携带突变基因的细胞并在其中表达，它可与内源性突变基因发生重组，从而可以进行基因治疗。本发明的优点是本发明通过对3例WS的家系成员及20名正常的对照成员WRN基因进行筛查，发现WS患者具有2806insA突变位点。20名正常人的筛査未检测到该突变，说明该突变位点与WRN基因密切相关。本发明首次提供了中国人群中存在WRN基因的--种突变，并且说明了该突变基因与WS症的相关。同时，本发明提出了通过检测患者中是否存在WRN基因突变而判断WS综合症发生的原因和检测方法，该方法简单、成本低，检测结果直接、可靠，适用于对Werner综合症WRN基因2806insA突变的大规模的筛査和诊断。下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一歩叙述，以使公众对
发明内容有更深入的了解，并非对本发明的限制，凡依照本发明公开内容所进行的任何本领域等同替换，均属于本发明的保护范围。图1为为本发明方法WRN基因外显子18的部分测序结果，上方为突变序列，下方位正常对照序列，箭头所指为突变位点。具体实施方式实施例l:WRN基因2806杂合突变的检测方法一.研究对象通过神经外科门诊收集脑膜瘤患者，在患者及家属自愿的前提下，签署知情同意书后，留取5-10ml血样，建立住院病历资料库，详细记录患者病情、家系中发病情况以及联系方式。本研究己得到了本单位伦理委员会批准。二.制备基因组DNA第一天1.在抗凝剂EDTA存在下，将收集的5-10ml人外周血在2500rpm，离心分离30分钟除去血清；2.加入0.2%NaCl溶液，使总体积为50ml。轻轻振荡溶液5-6次，并使其放置于冰上15分钟；3.在2500rpm离心分离30分钟，借此收集沉淀物；4.用0.2%的NaCl溶液，以类似于前面的方式再进行洗涤；5.在如此获得的沉淀物中，加入lOmMTris-HCl(pH8.O)和10mMEDTA(4ml)，以悬浮该沉淀物；6.将10%SDS，25mg/ml的蛋白酶K禾tllOmg/ml的RNaseA加入悬液中，其加入量分别为4ml、16ul和20ul，接着上下颠倒悬液轻轻混合；7.在37'C过夜温育悬液。弟一天1.加入4ml酚/Tris溶液，上下颠倒混合物混合所得的混合物；2.以3000rpm进行离心分离IO分钟除去水层；3.将水层和4ml酚/氯仿溶液混合，接着逆混合并以3000rpm离心分离10分钟；4.除去水层，用氯仿提取两次，以获得水相，往其中加1/10，3MNaAC(pH5.2)，两倍量的冷无水乙醇，使DNA沉淀；5.用70%的乙醇洗涤以获得基因组DNA;6.使这样获得的DNA，基因组DNA溶解于TE中，然后定量测定混合物在260nm的吸收率；7.DNA工作液浓度校正至50ng/ul，置-2(TC冰箱保存。三.WRN基因2806的PCR扩增1.引物序列上游引物:WRN2806-F:5'-CCCACGGAGGGTTTCTATCT-3'下游引物WRN2806-R:5'-GAACCATTGGCAGTGCTGTC-3'2.PCR反应体系表1:PCR反应体系<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表2:WRN基因2806片段PCR反应过程<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>三.测序PCR结束后，产物直接进行测序，委托美国英杰生命技术有限公司(Invitrogen)完成。四.突变分析应用DNAStat5.0(LasergeneInc.)软件包终的SeqmanTM软件进行序列对比分析。将测序得到的序列与NCBI检索到的标准序列进行比对，找到突变序列，发现突变位点。结果如图l所示，插入碱基后导致移码突变，使得插入点下游的DNA编码框架全部改变，终止密码子过早出现，造成多肽链合成的提前终止，肽链长度縮短，成为无活性的多肽片段。i于WRN蛋白是RecQ家族成员DNA解螺旋酶，插入碱基后导致的移码突变最终影响了DNA解链和DNA损伤修复。实施例2:WRN基因2806杂合突变的检测的试剂盒一.成分包含有可扩增出WRN基因2806杂合突变位点的引物对，及其测序相应试剂，成分和含量如下，于一20。C保存20ul10XPCR缓冲液(Pharmacia)，4ul10mMdNTP混合液(Pharmacia)，2ul(5unit/ul)TaqDNA聚合酶(Takara)，各10ul(10pmol/ul)Fl(SEQIDNO.1)和Rl(SEQIDNO.2)引物(自制)，1.5ml纯水(自制)。二.所述试剂盒的使用方法主要包括如下步骤(1)提取待测血样的DNA，利用序列表SEQIDNo.1、SEQIDNo.2所示的一对WRN2806-F和WRN2806-R引物，进行PCR扩增反应；(2)PCR反应产物纯化后直接测序，将得到的序列与Genebank中的标准序列确定突变位点的存在。(3)按照正常阅读框进行翻译以确定数否存在所述氨基酸突变位点。具体方法参见前面实施例中的详细描述。本试剂盒可以简便快捷地检测WRN基因所述突变位点，从而应用于WS病例的突变检测及诊断治疗。序列表<110>北京市神经外科研究所首都医科大学附属北京天坛医院<120〉一种检测成人早衰老综合症的基因诊断试剂盒<130〉<160〉2〈170>Patent.Inversion3.5<210〉1〈211〉20〈212〉DNA<213〉人工合成，引物1<400>1cccacggagggtttctatct〈210〉2〈211〉20<212〉DNA〈213>人工合成，引物2〈400〉2g肌CCElttggCElgtgCtgtC权利要求1.一种诊断成人早衰老综合症的方法，包括如下步骤(1)采集待测个体的血液、体液或组织标本，提取DNA；(2)以该DNA为模板，以针对WRN基因所述突变位点设计的PCR引物进行PCR反应，得到PCR反应产物；(3)将得到的PCR产物进行测序分析，将所得标本序列与正常基因序列进行比较，确认是否有突变；(4)根据以上结果判断待测个体是否为WRN基因突变导致的成人早衰老综合症。2.成人早衰老综合症2806insA突变在诊断Werner综合征相关疾病中的应用。3.—种检测成人早衰老综合症的试剂盒，其特征在于所述试剂盒的成分和含量如下，于一20'C保存20ul10XPCR缓冲液(Pharmacia)，4ul10mMdNTP混合液(Pharmacia)，2ul(5unit/ul)TaqDNA聚合酶(Takara)，各10ul(10pmol/ul)Fl(SEQIDNO.1)和Rl(SEQIDNO,2)引物，1.5ml纯水。全文摘要本发明公开了一种检测成人早衰老综合症的基因诊断试剂盒，属于生物
技术领域：
。一种诊断成人早衰老综合症的方法，包括(1)采集待测个体的血液、体液或组织标本，提取DNA；(2)以该DNA为模板，以针对WRN基因所述突变位点设计的PCR引物进行PCR反应，得到PCR反应产物；(3)将得到的PCR产物进行测序分析，将所得标本序列与正常基因序列进行比较，确认是否有突变；(4)根据以上结果判断待测个体是否为WRN基因突变导致的成人早衰老综合症。本发明的优点是首次提供了在中国人群中存在WRN基因的一种突变，并且说明了该突变基因与WS症的相关。本发明检测方法简单、成本低，检测结果直接、可靠，适用于对Werner综合症WRN基因2806insA突变的大规模的筛查和诊断。文档编号C12Q1/68GK101403008SQ200810225968公开日2009年4月8日申请日期2008年11月7日优先权日2008年11月7日发明者震吴,张俊廷,张力伟,王忠诚,郝淑煜申请人:北京市神经外科研究所;首都医科大学附属北京天坛医院