专利名称：重组仙台病毒载体的纯化方法
技术领域：
本发明属生物医药技术领域，涉及重组病毒载体的纯化方法，更具体是应用于重
组仙台病毒纯化。
背景技术：
基因治疗是当今最具发展前景和发展最快的前沿生物技术之一。研究结果表明很 多疾病都是由于直接或间接原因基因自身出现异常及功能障碍导致的。随着人类基因组的 解析，有关疾病与基因关系的信息越来越多。基因治疗就是把与疾病有关的基因制成药剂 导入患者体内，达到治疗疾病的目的。这是一种尖端信息快速转为实用化的最新医疗技术。
—般的基因治疗载体，进入到细胞核内作为DNA来表达目的基因所编码的蛋白。 在细胞核内有整合到靶细胞的染色体上，或者与染色体DNA发生基因重组的危险。有报告 表明，虽然发生频率极低，但逆转录病毒载体有诱发白血病的可能。另外，已知腺相关病毒 载体在被整合的染色体附近，可引起局部的不可逆性的染色体结构变化。因此，在使用这些 载体时必须慎重考虑利弊问题。仙台病毒载体是细胞质型RNA载体，对各种动物细胞有较 高的感染效率；它本身不进入细胞核内，在细胞质中进行基因表达，在理论上不存在改变细 胞核内染色体的危险性，与其他载体相比具有更高的安全性。从根本上解决以往载体存在 的生物安全隐患的不足之处。 在临床前研究中，重组仙台病毒载体在重度下肢缺血基因治疗制剂、阿耳茨海默 病(早老性痴呆症)疫苗、艾滋病疫苗都表现出了极好的治疗效果。由于仙台病毒载体的 基因表达水平很高，可望获得以往载体所不能实现的更好的治疗效果。此外，该载体即使是 较少剂量也可发挥相应的治疗效果，相比其他载体需要几十分钟以上的细胞接触才能获得 较满意的基因导入效果，重组仙台病毒载体仅在几分钟之内便可完成，在临床上可以减轻
患者及医生的負担，是一种非常快捷实用的载体。因此仙台病毒载体有比较广阔的应用前
旦 豕。 重组病毒在对于所有应用之前，都要在宿主细胞中增殖之后从宿主细胞中进行纯 化这一过程。 一般的方法包括细胞培养、感染宿主细胞、收获裂解宿主细胞、浓縮粗制裂解 物、核酶消化处理、以及进一步层析纯化。大多数改良的方法都集中在选用不同性质的层析 介质和超速离心。本发明是利用了仙台病毒蛋白的特点创造性的提出了新的纯化途径，其 过程是将收集的病毒初始液与来源于动物的红细胞在低温下混合一定的时间，然后在低温 条件下低速离心，收集沉淀；沉淀再用洗液洗涤，洗涤后的沉淀在37t:温浴一定的时间，然 后在室温条件下低速离心，收集上清液即为病毒纯品。收集的病毒纯品也可以选用相应的 层析介质做进一步的精纯化。 为更好的说明本发明的内容，对仙台病毒的结构做简单的介绍。
仙台病毒(Sendai virus, SeV)属于副粘病毒科副粘病毒亚科、呼吸道病毒属病 毒，为单股负链RNA病毒。RNA分子量4. 76X 106D，病毒粒子多是呈圆形，直径130 250nm。 病毒内部由直径约18nm的螺旋状对称结构的核蛋白组成，外包有脂蛋白囊膜，其上有放射状排列的纤突，纤突长8 15nm，宽2 4nm。 仙台病毒的基因结构特点野生型SeV为嗜肺的单股负链RNA病毒，基因组 全长15384个核苷酸，编码核蛋(皿cleoprotein， NP)、磷蛋白(phosphoprotein， P)、 基质蛋白(matrix protein, M)、融合蛋白(fusion protein, F)、血凝素神经氨酸酶 (hemagglutinin—neuraminidase, HN)禾口大分子蛋白(large protein, L) 6禾中结构蛋白禾口 C、 V、W等一些非结构蛋白。基因排列次序为3 '-leader-NP-P/C-M-F-HN-L-leader-5'。其中HN、 F蛋白为跨膜糖蛋白，位于 病毒表面，形成剌突，又称为剌突蛋白(spiker protein). M蛋白排列在包膜内表面.NP 蛋白与病毒基因组RNA结合，形成螺旋状的核衣壳，再结合P蛋白、L蛋白形成核蛋白 (ribo皿cleo-protein， RNP)复合体，构成病毒的核心结构.P/C基因区还包含一个病毒特 有的非结构蛋白C的编码区，除非结构蛋白C外，每个基因上、下游各有一个非编码序列R1、 R2，对基因表达有特殊的调控功能。SeV RNA3 '端和5'端各有1个51nt和54nt的前导 (leader)序列，它们与病毒在宿主内复制及致病有关.
SeV编码蛋白的结构与功能 HN蛋白HN蛋白为同源四聚体的II型跨膜糖蛋白，其基因在进化中高度保守，编码 区有1728bp，可编码575个氨基酸残基，其中1 35aa残基位于包膜内，36 60aa为疏水 氨基酸组成的跨膜区，61 575aa残基位于包膜外.HN蛋白有4个潜在的N-糖基化位点，分 别位于N77、N499禾P N511 ，成熟的HN蛋白只有N77、N499和N511被糖基化。N499禾P N511糖 基化对于细胞内转运和促进融合至关重要。254 259aa残基组成的六肽链N-R-K-S-C-S, 是神经氨酸酶的唾液酸结合位点，与病毒吸附穿入有关。 目前已知HN有3种功能1)吸附宿主细胞表面受体。病毒借助HN与细胞表面含 唾液酸的受体结合，使病毒吸附于宿主细胞表面。2)具有神经氨酸酶活性，可裂解宿主细胞 膜寡糖链末端唾液酸，促进子代病毒颗粒从感染的细胞表面释放.3)与F蛋白协同作用促 进细胞融合.HN的这3种功能相对独立，定位于HN蛋白的不同区域，如C端的444个氨基 酸残基主要负责受体识别和神经氨酸酶活性，而与F蛋白相互作用促进细胞融合的功能与 和跨膜区比邻的膜外区82个氨基酸残基有密切关系。 研究表明HN膜内区可与其他病毒蛋白特异性的相互作用，在子代病毒组装中起 重要作用.进一步比较各株SeV及I型人副流感病毒HN膜内区氨基酸序列，发现短肽 S-Y-W-S-T高度保守，暗示它有重要的生物学作用。 F蛋白病毒包膜与细胞膜融合是包膜病毒穿入宿主细胞的主要方式。SeV F蛋白 具有膜融合活性，与病毒致病性有关。 M蛋白M蛋白是非糖基化的内膜蛋白，位于病毒包膜内表面，1173个核苷酸编码
348个氨基酸。M蛋白富含碱性氨基酸。即使病毒包膜被去污剂破坏的情况下，也能维持紧
凑的病毒结构。M蛋白含有5个半胱氨酸残基，分别位于83、 106、 158、251 、295位，即使在副
粘病毒亚科这些半胱氨酸残基也是很保守的，说明它们有重要的生物学功能。 P/C蛋白P/C基因编码区1821-3550bp。根据目前文献报道，由于RNA转录后加工
和多个0RF的重叠，P/C基因共可编码8种蛋白C'、C、Y1、Y2、P、V、W和X蛋白。8种蛋白
中最大的是P蛋白，共568个氨基酸。P、 V和W蛋白N端317个氨基酸相同。L蛋白L基因编码序列为8556 15242nt。编码2228个氨基酸，分子质量单位为
4245kd左右，是SeV编码的最大蛋白。只有L蛋白与P蛋白形成复合物，才具有RNA多聚酶 的活性，在病毒RNA复制、转录、mRNA5 '帽结构甲基化等发挥作用。 NP蛋白NP基因编码区1575bp，编码524个氨基酸。NP蛋白自身相互作用，同时包 裹病毒RNA形成左手螺旋的核衣壳。 基于以上SeV编码蛋白的功能，特别是仙台病毒外膜表面存在的HN蛋白可与红细 胞表面唾液酸残基结合，同时兼具唾液酸酶活性，可裂解细胞表面糖蛋白上的唾液酸残基， 但在低温下HN主要表现出的是唾液酸的结合活性，仙台病毒可以与红细胞结合；在适当的 升高温度的条件下表现的是神经氨酸酶活性，仙台病毒可以与红细胞分开。利用该特点我 们创造性的提出 一种纯化仙台病毒的方法。
实施例l鸡红细胞液的制备 1).采鸡血用注射器吸取阿氏液约lml，取3日龄 10日龄SPF鸡(最少两只)， 从胸骨尖下方约1. 3cm处将注射器针头剌入心脏。吸取心血约2ml 4ml 。与阿氏液轻轻 混合，放入装有10ml阿氏液的离心管中， 2)洗涤鸡红胞将离心管中的血液经1500r/min 1800r/min离心8min，弃上清 液，沉淀 物加入阿氏液，轻轻混合后，再经1500r/min 1800r/min离心8min，用吸管移去 上清液及沉淀红细胞上层的白细胞薄膜，再重复以上过程后，加入阿氏液20ml，轻轻混合成 红细胞悬液，4度保存5天备用。 3)鸡红细胞悬液取阿氏液保存不超过5天的红细胞液，在锥形刻度离心管中离 心1500r/Min-1500r/min离心8min，弃去上清液，加人PBS，用吸管反复吹吸使PBS与红细 胞均匀混合，制成红细胞液。
实施例2重组病毒的纯化 1)病毒初始液与实施例1制备的红细胞液在低温(优先4°C 8°C )下混合一定 的时间，优先选择0. 5小时 2小时； 2)然后在低温(优先4°C 8°C )条件下低速(优先选择1000rpm/m 4000rpm/ m)离心，收集沉淀； 3)沉淀再用洗液(PBS，含一定浓度的BSA)洗涤；
4)洗涤后的沉淀在32°C 38t:温浴5分钟 30分钟； 5)然后在室温条件下低速(优先选择1000rpm/m 3000rpm/m)离心，收集上清液
即为病毒纯品。纯化的病毒电镜照片，见附图1。 实施例3.重组病毒的纯度鉴定(SDS-PAGE电泳) 方法参考分子克隆3，采用10% SDS-PAGE法进行，加样量为4. 0 X 108CIU， SDS-PAGE电泳，凝胶用考马斯亮蓝染色，脱色，照相，与仙台病毒对照品梯度SDS-PAGE图谱 比较，判断是否含仙台病毒的7条特征带。见附图2。
实施例4 SDS-PAGE电泳纯度检查 采用10%梯度SDS-PAGE法进行，加样量为4. OX 108CIU，电泳，凝胶用考马斯亮蓝 染色，脱色后用扫描仪扫描，用图片分析软件alpha-Image对电泳条带进行分析，计算仙台 病毒特征带蛋白总量占总蛋白量的百分比。参考附图3
实施例5 病毒滴度测定
1.将病毒从-80 °C冰箱中取出，立即放于37 °C水浴锅中摇5秒钟，待融化后取出，
放于4t:冰箱中待用。 2.取U型底96孔板放在生物安全柜中，向各孔加入PBS，50u1/孔，共16个孔。
3.取病毒50ul加在第一孔，用加样器反复混匀10次，取50ul加到下一孔中，如此 依次稀释到第15 L在第15孔中取出50ul弃掉；第16孔设为阴性对照，只加50ul PBS。
4.向各孔中加入新鲜配制的鸡红细胞，8Xl(fcells/ml，50ul/孔。顺序为先加阴 性孔(第16孔)，再依从稀到浓的顺序加入鸡红细胞，盖上盖子，轻轻拍打板子侧面，使之混 匀。 5. 4"放置1小时，观察结果，照相，记录。 6结果判定血球完全凝集者判为阳性，凝集终点为最后一个完全凝集的孔(示例
中第11个孔)，病毒滴度按以下公式计算 病毒滴度=凝集终点孔的病毒稀释度 病毒粒子密度=8X107XA A为病毒滴度 示例中的病毒样品滴度为1 : 2， 048 病毒粒子密度为8 X 107X 2048 = 1. 64X 10"VP/ml 。 实施例6 —种重组仙台病毒纯化系统，或者一种重组仙台病毒纯化试剂盒，其组 成包括来源于动物的红细胞、含BSA的细胞洗液。
附图1本发明方法纯化的病毒电镜照片。 附图2本发明方法纯化的病毒SDS-PAGE电泳图谱，判断是否含仙台病毒的7条特 征带。左边为低分子量Marker,中间为本发明方法纯化的样品，右边为次高分子量Marker。
1 :L，2 :P，3 :HN，4 :NP，5 :P'，6 :&，7 :M 附图3本发明方法纯化的病毒SDS-PAGE电泳图谱纯度鉴定，对7条特征带的含量 用分析软件alpha-Imag做出分析。L， P， HN， NP， P， Fn M比例依次为4. 7 % ， 6. 6 % ， 22. 0 % ， 34. 0%，6. 3%，4. 4%，22. 1%。 附图4 :血球完全凝集者判为阳性，凝集终点为最后一个完全凝集的孔(示例中第
11个孔)，病毒滴度按以下公式计算 病毒滴度=凝集终点孔的病毒稀释度 病毒粒子密度=8X107XA A为病毒滴度 示例中的病毒样品滴度为1 : 2， 048 病毒粒子密度为8 X 107X 2048 = 1. 64X 10"VP/ml 。
权利要求
一种重组仙台病毒的纯化方法，其特征是过程包括以下步骤(1)收集来源于动物的红细胞；(2)病毒初始液与红细胞在低温下混合一定的时间；(3)然后在低温条件下低速离心，收集沉淀；(4)沉淀再用洗液洗涤；(5)洗涤后的沉淀在37℃温浴一定的时间；(6)然后在室温条件下低速离心，收集上清液即为病毒纯品。
2. 根据权利要求l，所述的动物红细胞优先来源于鸡红细胞。
3 根据权利要求l，所述的病毒初始液与红细胞混合的条件为2°C 8°C。
4. 根据权利要求l，所述的病毒初始液与红细胞混合的时间为0. 5 2小时。
5. 根据权利要求l，所述的病毒初始液与红细胞低温低速离心条件为2000rpm/m，时间 为10 30分钟。
6. 根据权利要求l，所述上清液洗液优先为含BSA的PBS。
7. 根据权利要求l，所述病毒纯品可以用层析法进一步纯化。
8. —种重组仙台病毒纯化系统，其组成包括来源于动物的红细胞、洗液。
全文摘要
本发明提供了一种重组仙台病毒的纯化方法，其过程是将收集的病毒初始液与来源于动物的红细胞在低温下混合一定的时间，然后在低温条件下低速离心，收集沉淀；沉淀再用洗液洗涤，洗涤后的沉淀在37℃温浴一定的时间，然后在室温条件下低速离心，收集上清液即为病毒纯品。
文档编号C12N7/02GK101735990SQ200810225790
公开日2010年6月16日 申请日期2008年11月13日 优先权日2008年11月13日
发明者许允立 申请人:本元正阳基因技术有限公司