多脂磷伞Pa－I·H菌株及培育多脂磷伞的方法和以其活性成分制成的药物的制作方法

专利名称：多脂磷伞Pa－I·H菌株及培育多脂磷伞的方法和以其活性成分制成的药物的制作方法
技术领域：
本发明提供一种新的多脂磷伞Pa-I·H菌株及以该菌种人工培育多脂磷伞菌的方法，同时公开了其药用用途和以其活性成分的药物组合物，属于涉及真菌人工培育及药用技术领域
背景技术：
多脂磷伞Pholiota adiposa(Fr.)Que俗称刺儿蘑、黄蘑、黄伞，在分类学上属担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、球盖菇科、磷伞菌属。其子实体于吉林省秋季生于杨柳及桦等的树干上。本发明所提供的新菌株(以下称Pa-I·H菌株)和应用本菌株经过栽培实验长出多脂磷伞子实体，经过鉴定验证无误后确认分离得到的该菌株确实属于磷伞属、多脂磷伞种。经检索未见文献报道。

发明内容
本发明提供一种新的多脂磷伞Pa-I·H菌株。
本发明还提供了及以该菌种人工培育多脂磷伞菌的方法，适应于工业化生产。
本发明同时公开了其药用用途。
本发明进一步提供了以该菌提取的多脂磷伞多糖及多脂磷伞核酸组分为主要药物和与其它药物组方用于预防和肿瘤的治疗以及镇痛、抗炎作用，提高机体免疫力等。
多脂磷伞种Pa-I·H菌株于2003年5月23日在中国典型培养物保藏中心(武汉大学)保藏，并收到保藏登记号CCTCC NOM203043。
具有以下表征菌落外观菌丝棉绒状、较短、气生菌丝不发达、初期白色、后期淡黄色。
1、镜检(1)菌丝粗壮，分枝多。
(2)美蓝单染色着色深、均匀。
(3)可见大量生长点无空泡。
(4)有锁状联合，且较发达。
(5)无杂菌污染。
2、生理生化特征(1)生长最佳温度24～26℃。
(2)生长最佳PH值6.0～6.5。
(3)对氧的需求，好气性。
(4)培养基生长最佳水分60％。
(5)生长最佳湿度60～65％。
3、培养基成分PDA综合培养基。
根据文献及上述复栽的实验结果表明该多脂磷伞菌(即Pa-I·H菌株)属于磷伞属、多脂磷伞种。
本发明的多脂磷伞为种传代18次以上不退化，属于抗老化能力、稳定性代谢能力强的菌株。一种菌种的性能如何不仅要求它的生活能力强、生长发育速度快、生产成本低、产品质量好，又要考虑它的代谢能力能否稳定、有效成分含量高低、产量和得率多寡，是确定菌种性能重要考核条件，本菌株保证了上述要求条件。
以该菌种人工培育多脂磷伞菌的方法如下利用分离后的多脂磷伞菌Pa-I·H菌株进行人工栽培多脂磷伞子实体采用固态—液态—固态的工艺路线，包括如下步骤斜面培养、液体深层发酵、种子培养、菌丝体培养和子实体培养。
所述的斜面培养，所用的培养基为PDA综合培养基，PH6～6.5，培养温度24～26℃，培养时间10～12天。
所述的摇瓶种子培养，所用培养基成分包括蛋白胨1.5％、酵母膏0.1％、麦芽糖1％、葡萄糖1％、麦麸5％、KH2PO40.15％、MgSO4·7H2O0.075％、维生素B10.001％，PH6～6.5，接种量为斜面与摇瓶之比1∶6，培养温度24～26℃，培养时间7～10天，旋转式摇床的转速为170～200转/分钟。
所涉及的菌丝体培养，所选择的培养基为硬杂木屑、黄豆秆粉、玉米芯粉、玉米面、麦麸、石膏、白灰等混合物，优选的重量百分比含量为木屑30％、黄豆秆粉20％、玉米芯20％、玉米面20％、麦麸7％、白糖1％、石膏1％、白灰1％。培养温度24～26℃，培养时间25～35天，PH6～6.5。
所述的出菇管理，包括适时脱袋处理，温度13～34℃，湿度85～90％，加大通风，给予散射光，直至长出多脂磷伞子实体。
在人工培养过程中为扩大产量，增加菌种数量，还可在摇瓶种子培养之后增加种子罐培养，培养基与摇瓶种子培养所用的培养基相同。PH消前为6.5，消后为6.2～6.3，接种量为10％，温度24～26℃，空气流量0.5V/V，罐压0.5kg/cm2，培养时间为3～4天。
多脂磷伞多糖是通过以下提取方法获得的方法1以多脂磷伞子实体为原料，用水煎1～3次，每次时间为1～3小时，滤过，合并滤液，浓缩，加入蛋白酶，调温45～60℃，PH值5～7，水解除去蛋白；精滤后加乙醇进行醇沉，最终浓度为70％，过滤收集沉淀，水溶，离心除渣，取上清液醇沉至醇浓度为70％，收集沉淀的多脂磷伞多糖。
方法2以多脂磷伞子实体为原料，用20％乙醇回流提取3次，每次时间为3小时，合并提取液，减压浓缩，浓缩液加乙醇至含醇量为80％，静置24小时，抽滤，沉淀物以无水乙醇适量洗涤，干燥，粉碎成细粉，得以多脂磷伞多糖。
多脂磷伞核酸是通过以下提取方法获得的取多脂磷伞加入氯仿(重量比1∶8～12)后研磨，然后加入等体积的核酸提取液(100mM Tris-Hcl，50mM EDTA，50mM Nacl，1.5％SDS)，混均后于10000转/分离心20分钟，取上清液加入无水乙醇溶液，振荡2次，12000转/分离心10分钟，倒掉上清液，加70％乙醇洗涤，所得到的沉淀干燥后即可。
本发明的所述方法可用于产业化大量制备具有抗肿瘤提高免疫力等活性的多糖组分和核酸组分。
按药剂学方法，可以将本发明的多脂磷伞多糖(或核酸)制备成多种临床药物剂型作为治疗肿瘤疾病，提高免疫力和镇痛抗炎的药物，所说的药剂是任何一种药剂学上所说的剂型。其中，口服制剂选自于片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸、口服液体制剂中的任何一种。
本发明的药物优选含有1％-99％的多脂磷伞多糖(或核酸)和99％-1％的赋形剂(包括其它配伍的药物)，优选含有30％-80％的多脂磷伞多糖(或核酸)和70％-20％的药用赋形剂(包括其它配伍用的药物)，最好含有60％-70％的多脂磷伞多糖(或核酸)和40％-30％的赋形剂(包括其它配伍用的药物)。
本发明的药物中的辅料是指常规的赋形剂，如溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂、粘合剂等。本发明药物中的其它配伍用的药物，指的是以有效剂量的多脂磷伞多糖为一定的药物原料，再配伍其它可允许合用的中药或化学药品。
本发明的积极效果在于提供的多脂磷伞菌种为一个新菌种，安全性高，在规范实施过程中，不危及人类健康或动、植物病原或污染环境。经系统考核传代18代以上不退化，属于抗老化能力稳定性和代谢能力较强，产量和得率较高的菌株，本发明公开的人工培养的方法，其工艺路线合理，长出子实体的时间比按常规的人工培养方法提前1个月以上，具有生长快、产量高、代谢产物稳定的特点，为珍稀食用菌发展开辟了一条新的途径，具有较高的实际应用价值。另外，利用该菌种培养的多脂磷伞子实体和深层发酵技术制成的菌丝体可用于药用途。本发明提取的多脂磷伞多糖及多脂磷伞核酸可用于制备成治疗肿瘤疾病，提高免疫力和镇痛抗炎的药物。
下述的药理实验证实了多脂磷伞多糖药物制剂具有治疗肿瘤疾病，提高免疫力和镇痛抗炎的药物的药理活性摘要 以荷S180瘤小鼠及艾氏腹水型小鼠为模型，研究了多脂磷伞多糖的体内抗肿瘤作用。结果表明多脂磷伞多糖不仅能抑制体内肿瘤生长，还能提高机体的免疫能力。另外，多脂磷伞多糖对金葡菌与大肠杆菌有较好的抑菌作用，还具有明显的强壮作用(抗疲劳作用)1 材料1.1 药物多脂磷伞多糖为多脂磷伞中提取的多糖物质。环磷酰胺上海华联制药有限公司产品，批号20010304。
1.2 S180及艾氏腹水瘤株中国医学科学院肿瘤医院定期传代瘤株。
1.3 细菌菌种为金葡菌、大肠杆菌、志贺痢疾杆菌、白色念株菌、杂曲霉菌，皆由白求恩医大微生物教研室提供。
1.4 动物昆明种小鼠，雌雄兼用，体重(22±2)g，购自中国人民解放军农牧大学实验动物中心。
2 方法
2.1 小鼠荷瘤取接种6d的S180及艾氏腹水型小鼠腹水，用灭菌生理盐水(1∶3)稀释，经右上肢靠右肩甲骨处皮下注射(sc)或腹腔注射(ip)0.2mL(4×106～6×106个瘤细胞，活细胞率＞95％)，制成实体瘤型或腹水型荷瘤小鼠模型。
2.2 药物剂量与给药途径按实验设计剂量ip(实体瘤型)或肌肉注射im(腹水瘤型)给药，阴性对照组用生理盐水ip或肌肉注射(im)，阳性对照组用环磷酰胺ip或im，每只小鼠每天用药1次。
2.3 抑瘤率、脾指数和胸腺指数的计算荷S180实体瘤型小鼠于接种后24h随机分组，连续给药8d，8d后称重、处死，分别取瘤、脾和胸腺，体重，计算抑瘤率、脾指数和胸腺指数并进行统计学处理。
2.4 存活率的计算艾氏腹水型小鼠于接种后24h随机分组，连续给药8d，停药后继续观察，直到自然死亡，计算其存活延长率。
3 结果3.1 对荷S180瘤小鼠的抑瘤作用见表1。
表1 对荷S180小鼠肿瘤的抑制作用(x±s)

与对照组相比*P＜0.05**P＜0.
3.2 对艾氏腹水型小鼠存活期的影响见表2。
表2 对艾氏腹水型小鼠存活期的影响(x±s)

与对照组相比*P＜0.05**P＜0.01与环磷酰胺组相比□P＜0.05
3.3 对荷S180瘤小鼠免疫指标的影响见表3。
表3 对荷S180瘤小鼠免疫指标的影响(x±s)剂量动物数 比率#比率##组别 脾指数 胸腺指数(mg/kg·d) (只) (％) (％)正常组- 12 6.76±0.58 2.32±0.43对照 - 18 13.39±0.45 198.1 1.31±0.57 56.5多脂磷伞多糖 100012 8.63±0.62*127.8 1.70±0.95 73.3500 12 9.86±0.52 145.9 1.92±0.24□*78.6250 12 10.23±1.36 151.3 1.55±0.37 66.8环磷酰胺 0.0112 9.32±0.87 137.9 1.61±0.69 69.4#空白对照组、各用药组与正常组脾指数比率；##空白对照组、各用药组与正常组胸腺指数比率。
与对照组相比*P＜0.01；与环磷酰胺组相比□P＜0.01表1～3结果表明，多脂磷伞多糖PWAE 100m g/kg·d有明显抑瘤作用(63.2％)，且能明显延长艾氏腹水型小鼠的存活期(48.0％)，随着剂量减小，抑瘤率和存活期也减小。多脂磷伞多糖PWAE 100mg/kg·d与阳性对照组环磷酰胺组相比，抑瘤率与后者(58.3％)相近(P＞0.05)，存活期延长率比后者(29.7％)高(P＜0.05＝。小鼠荷瘤后，引起免疫指标不正常，表现为脾指数升高，为正常鼠的198.1％，胸腺指数下降，为正常鼠的56.5％，多脂磷伞多糖PWAE不同剂量组均能使荷瘤小鼠脾指数降低，胸腺指数升高，向正常值靠拢。多脂磷伞多糖PWAE 100m g/kg·d剂量组降低脾指数最显著(127.8％)，与对照组相比有显著差异(P＜0.01，与环磷酰胺组相比无显著差异(P＞0.05)。500m g/kg·d剂量组上升胸腺指数最显著，与对照组相比有显著差异(P＜0.01，与环磷酰胺组(69.4％)相比有显著差异(P＜0.01，说明其效果比后者强。综上所述，多脂磷伞多糖不仅能抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长，延长小鼠生命，而且有改善荷瘤小鼠免疫机能的作用。
3.4 体外抑菌实验取上述实验菌种5种，每种2株，共12株。采用试管二倍递减稀释法，将系列稀释的受试药液与菌液混合，置37℃温箱培养18～24h，观察试管内细菌生长状况，管内清亮者为细菌生长受抑。白色念株细菌与杂曲霉菌接种在含药液的沙保氏固体培养基上，白色念珠菌置37℃温箱培养24～48h观察生长情况，杂曲霉菌置22℃温箱培养48～72h观察生长情况。另设空白管作细菌生长对照。实验结果见表4。
表4 多脂磷伞多糖的抑菌作用mg/ml菌株株数 MIC金黄色葡萄球菌 2 9.75大肠杆菌2 4.875志贺痢疾杆菌2 ＞78白色念珠菌 2 ＞78
杂曲霉菌 2 ＞78实验显示，多脂磷伞多糖对2株G+金黄色葡萄球菌MIC(最低抑菌浓度)为9.75mg/ml，对大肠杆菌MIC为4.875mg/ml，表明湖北海棠叶水煎液对金葡菌与大肠杆菌有较好的抑菌作用。这一结果揭示多脂磷伞多糖大肠杆菌及金葡菌具有较好的抑制其生长的药理作用。
3.5 强壮作用(抗疲劳作用)按表5分组给药，于7天内，每天灌胃一次，对照组灌胃等体积蒸馏水，末次给药2h后，将小鼠投入温度为23～25℃的水中，记录小鼠游泳时间，结果见表5。多脂磷伞多糖可明显延长小鼠游泳时间，表明多脂磷伞多糖具有明显的强壮作用(抗疲劳作用)表5 多脂磷伞多糖的强壮作用(抗疲劳作用)(x±s，n＝10)组别 剂量(mg/kg)游泳时间(min)对照 - 192±31.04多脂磷伞多糖 1000 274±54.12***500252±69.82***250 201±60.12**与对照比较，*P＜0.05，***P＜0.0014 讨论以荷S180瘤小鼠及艾氏腹水型小鼠为模型，研究了多脂磷伞多糖的体内抗肿瘤作用。多脂磷伞多糖有明显的抗体内移植瘤和延长荷瘤小鼠存活期作用，并且多脂磷伞多糖还能降低荷瘤小鼠脾指数，升高胸腺指数，使之趋向正常值。提示多脂磷伞多糖不仅能抑制体内肿瘤生长，还能提高机体的免疫能力。体内实验结果说明多脂磷伞多糖能通过提高机体免疫力来达到抗肿瘤作用。另外，多脂磷伞多糖还对金葡菌与大肠杆菌有较好的抑菌作用，并具有明显的强壮作用(抗疲劳作用)。
下述的药理实验还证实了多脂磷伞核酸药物制剂具有治疗肿瘤疾病，提高免疫力和镇痛抗炎的药物的药理活性摘要研究结果表明，多脂磷伞核酸成分具有提高机体免疫能力和增强体力能力。其作用机理是多脂磷伞核酸成分能增加机体的蛋白质合成作用。
1 材料1.1 药物多脂磷伞核酸成分为多脂磷伞中提取的核酸物质。
1.2 动物昆明种小鼠，雌雄兼用，体重(22±2)g，购自中国人民解放军农牧大学实验动物中心。
2 方法与结果2.1 对小鼠免疫器官重量的影响将小鼠分别每天灌胃药物或同体积蒸馏水0.2ml/10g体重，每日1次，连续7天。模型组和药物组分别于实验第1，3，5，6天腹腔注射环磷酰胺10mg/kg，于第7日，末次给药后1h，所有小鼠脱颈椎处死。取脾和胸腺，剥离干净，称重，以mg/10g体重计算脾指数及胸腺指数，结果见表1。
表1 多脂磷伞核酸对小鼠免疫器官重量的影响(x±s)组别 剂量动物数 脾指数 胸腺指数(mg/kg) (只) (mg/10g) (mg/10g)对照1064.61±16.82**35.73±9.40**模型1044.56±14.23 19.88±7.95多脂磷伞核酸 1000 1054.68±12.46*29.69±7.36*500 1053.12±12.57*28.36±7.98*250 1052.67±15.88*28.45±8.58*与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
结果表明，多脂磷伞核酸成分能明显提高免疫抑制小鼠的脾和胸腺重量。提示其具有提高小鼠免疫功能的作用。
2.2 对小鼠单核巨噬细胞系统吞噬功能的影响小鼠分别灌胃药物或同体积蒸馏水，每日一次，连续7天，于末次给药后1h尾静脉注射印度墨汁0.1ml/10g，于注射后2及20min分别从眼眶静脉丛取血20μl，加到2ml 0.1％Na2CO3溶液中摇匀，在680nm处测定光密度，计算吞噬指数K和吞噬活性α。结果见表2表2 多脂磷伞核酸成分对小鼠单核巨噬细胞系统吞噬功能的影响(x±s)组别 剂量动物数 吞噬指数 吞噬活性(mg/kg) (只) K α对照 100.028±0.017 5.28±1.03左旋咪唑 25 100.047±0.020*6.68±1.02*多脂磷伞核酸 1000 100.047±0.017*6.67±0.95*500 100.046±0.014*6.66±0.88*250 100.045±0.015*6.47±0.98*
与对照组比较*P＜0.05结果表明，多脂磷伞核酸成分具有提高正常小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的作用。提示其具有提高小鼠细胞免疫功能的作用。
2.3 对小鼠溶血素抗体生成的影响小鼠分别每天灌胃药物或同体积蒸馏水0.2ml/10g体重，每日1次，连续7天。模型组和药物组分别于实验第1，3，5，6天腹腔注射环磷酰胺10mg/kg，在给药第1天，每只小鼠用5％鸡红细胞0.2ml腹腔注射进行免疫，给药第7天眼眶静脉丛取血20μl，加入1ml生理盐水中摇匀，再加入5％鸡红细胞0.5ml，在冰浴中加入0.5ml补体(1∶10新鲜豚鼠血清)，在37℃恒温水浴中温育30min，在冰浴中终止反应3min，2000rpm离心10min，取上清1ml，加入3ml都氏液，室温静置10min后，在540nm处测光密度值，结果见表3。
表3 多脂磷伞核酸成分小鼠溶血素抗体生成的影响(x±s)组别剂量 动物数溶血素抗体(mg/kg) (只) (OD)对照 100.028±0.011*模型 100.017±0.009多脂磷伞核酸1000 100.036±0.012**500 100.025±0.008*250 100.027±0.009*与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
结果表明，多脂磷伞核酸成分能明显提高免疫抑制小鼠溶血素抗体的生成，提示其具有提高小鼠体液免疫功能的作用。
2.4 耐缺氧能力将成年小鼠50只按表分组给药，于7天内，每天灌胃一次，对照组灌胃等体积蒸馏水，末次给药24h后，将小鼠放入容积为250ml含5g钠石灰的广口瓶中，塞紧，1只/瓶，记录小鼠存活时间，结果见表。多脂磷伞核酸成分可明显延长小鼠常压缺氧下的存活时间。具有耐缺氧作用。
多脂磷伞核酸对小鼠常压耐缺氧能力的影响(x±s，n＝10)组别剂量(mg/kg)存活时间(min)对照- 34±8.9多脂磷伞核酸1000 47±13*50043±11*25042±13*与对照比较，*P＜0.052.5 增强机体体力作用(抗疲劳作用)对小鼠游泳时间的影响将成年小鼠50只按表分组给药，于7天内，每天灌胃一次，对照组灌胃等体积蒸馏水，末次给药24h后，将小鼠投入温度为23～25℃的水中，记录小鼠游泳时间，结果见表。多脂磷伞核酸成分能明显延长小鼠游泳时间。具有增强机体体力作用。
多脂磷伞核酸成分对小鼠游泳时间的影响(x±s，n＝10)组别剂量(mg/kg)游泳时间(min)对照- 201±36多脂磷伞核酸1000 296±58***500275±53*250262±48*与对照比较，*P＜0.05，***P＜0.0012.6 促进蛋白质合成作用将成年小鼠50只按表分组给药，于7天内，每天灌胃一次，对照组灌胃等体积蒸馏水，末次给药1h后，将小鼠处死，取肝组织，测蛋白质含量，结果见表。多脂磷伞核酸成分能明显增加小鼠肝组织蛋白质含量。具有促进蛋白质合成作用。
多脂磷伞核酸成分对小鼠肝蛋白质含量的影响(x±s，n＝10)组别剂量(mg/kg)蛋白质(mg/g)对照 274±28多脂磷伞核酸1000 301±25*500295±19*250286±16*与对照比较*P＜0.053.讨论多脂磷伞核酸成分能明显提高免疫抑制小鼠的脾和胸腺重量，具有提高正常小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的作用，能明显提高免疫抑制小鼠溶血素抗体的生成，提示其具有提高小鼠免疫功能的作用。多脂磷伞核酸成分可明显延长小鼠常压缺氧下的存活时间，具有耐缺氧作用；能明显延长小鼠游泳时间，具有增强机体体力作用；能明显增加小鼠肝组织蛋白质含量，具有促进蛋白质合成作用。
上述结果表明，多脂磷伞核酸成分具有提高机体免疫能力和增强体力能力。其作用机理是多脂磷伞核酸成分能增加机体的蛋白质合成作用。
多脂磷伞营养液的功能学研究利用多脂磷伞子实体和深层发酵技术制成的菌丝体，配制成多脂磷伞营养液，既保留了菌液的固有的色泽和鲜香味，又能调节动物免疫功能。本发明报道了该饮品依据保健食品功能学评价程序和检验方法，在细胞免疫和体液免疫中各选择一个项目，进行试验的结果。经口给予小鼠不同剂量的该饮品20天后能明显提高小白鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力，且随着剂量增加，这种影响愈加显著，同时饮品的高剂量组能明显提高小鼠的体液免疫功能，与蒸馏水组对照有显著差异。二硝基氟苯诱导小鼠迟发性变态反应(DTH)和血清溶血素测定实验表明，对小鼠半数溶血值及迟发性变态反应有明显的剂量效应关系，饮品的有效成分分析显示多糖含量较高，因而能呈现较好的免疫促进作用，毒性试验无任何毒副作用，是一种口感新颖，色泽明亮的保健饮品。
利用多脂磷伞子实体或菌丝体制成的饮品，有关试验结果如下1、多脂磷伞营养液对小鼠巨噬细胞能力的影响。由表1可见经口给予小鼠3倍、10倍、20倍不同剂量的多脂磷伞饮液20天后，高、中、低剂量组，小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬率高于对照组，经统计学处理，中、低剂量组与对照组有显著性差异，高剂量组与对照组比较差异极显著。
表1、多脂磷伞营养液对巨噬细胞的影响(X±SD)

2、多脂磷伞营养液对小鼠体液免疫的影响，由表2可见，经口给予小鼠20天后，高剂量与对照组比较有显著性差异。(P＜0.05)，中、低剂量，两个剂量组半数溶血值，虽比对照组有所提高，并有剂量反应关系，但与对照组比较无显著性差异。
表2、多脂磷伞营养液对小鼠HC50。测定结果(X±SD)

多脂磷伞食用和药用研究1、多脂磷伞的营养成份研究结果表明，多脂磷伞子实体含有蛋白质，蛋白质含量介于动物和植物之间是一种高蛋白、低脂肪的食品，粗蛋白包括水溶性蛋白占23.65％、粗脂肪0.32％、碳水化合物占65.83％、灰分占10.1％，蛋白质中含有种类齐全的18种氨基酸，特别是人体不能合成的必须从外界摄取的全部8种必需氨基酸占总氨基酸量的42.2％。子实体碳水化合物中含有各种糖类，并含有一定量的维生素，维生素中的硫胺素、烟酸、抗坏血酸和核黄素，可参与肌体的氧化还原反应，调节机体的代谢功能的作用。灰分中矿元素以Ca、Mg含量较高，还含有一定量的锌、铁。多脂磷伞营养丰富，经常食用，能增加人的体质，可作为保健食品。
2、多脂磷伞的抗炎性抗致病性细菌试验结果表明，多脂磷伞子实体除去多糖水提取液具有抑制绿脓杆菌、痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等病原菌生长的物质。多脂磷伞抑菌物质属于不含多糖的小分子物质。
3、多脂磷伞抗癌活性和免疫功能
用多脂磷伞子实体水浸提液和多脂磷伞多糖进行了抗癌活性免疫功能的实验。实验结果表明多脂磷伞多糖(I号)对S180肉瘤的抑制率♂为7.98～17.6％，♀为16～24％，对艾氏腹水瘤生命延长率为10～21％。多脂膦伞浸提液(II号)均可能激活小鼠腹腔巨噬细胞，增强其吞噬功能，提高免疫功能，抑制小鼠IV碳粒廊清速率，表明多脂磷伞多糖，多脂磷伞子实体浸提液有增强小鼠单核巨噬细胞的功能，能增加小鼠免疫器官(胸腺和脾脏)的重量，可以认为多脂磷伞不论是水浸提液还是多糖均具有免疫增强作用。
具体实施例方式实施例1斜面菌种培养采用PDA综合培养基，PH6.5，培养温度24～26℃，该菌萌发快，菌种接后2～3天内形成以接种块为基点的明显菌落大约10～12天左右菌落长满管。菌丝初期白色、棉绒状、分枝多，后期呈淡黄色，通过镜检明显观察到菌丝粗壮、分枝多、锁状联合发达、美蓝单染色着色深，可见大量生长点，无空泡，无杂菌污染。
摇瓶种子培养，所用的培养基成分为蛋白胨1.5％、酵母膏0.1％、麦芽糖1％、葡萄糖1％、麦麸5％、KH2PO40.15％、MgSO4·7H2O0.075％、维生素B10.001％、PH6.5(消前)，高压灭菌压力1kg/cm230min，冷却后接种，接种量为斜面与摇瓶之比1∶6，即一个斜面接6个250ml的摇瓶(装量100ml)培养温度24～26℃，旋转式摇床170～200转/分钟，培养7～10天，菌球湿重达20％以上(湿重测定方法取100毫升培养液置于量筒中，静置15min，观察菌球沉降的刻度的百分数)味为水果香味，稍酸，镜检观察到菌丝着色深，粗壮，分枝多，生长点明显可见，有锁状联合，未污染杂菌，即可作为摇瓶种子备用。
种子罐培养，培养基同摇瓶种子培养，PH6.5(消前)PH6.2～6.3(消后)，温度24～26℃，空气流量0.5V/V，罐压0.5kg/cm2，接种量为种子罐的10～15％，培养3～4天左右，当外观形态检查到菌球湿重达30％以上，味感呈水果味，镜检观察到菌丝着色深、粗壮、分枝多、生长点明显可见有锁状联合未见杂菌污染即可进行发酵瓶(袋)培养。
发酵瓶(袋)培养所用培养基配方为硬杂木屑30％、黄豆秆粉20％、玉米芯20％、玉米面20％、麦麸7％、白糖1％、石膏1％、白灰1％、含水量60％，选用17×33cm聚丙烯袋或低压聚乙烯袋，装料高16～17cm，套颈圈、塞棉花，上包牛皮纸，高压灭菌1.5kg/cm2下2小时，或常压灭菌100℃保持10～12小时。冷却后无菌操作接入菌种，温度24～26℃，保持黑暗环境，空气相对湿度50～60％，培养25～35天。
外观检查，菌丝浓白，呈绒毛状，粗短、密齐，袋无米黄色积水，没有干涸收缩现象，无杂菌污染，生长后期菌丝呈淡黄色，并有部分菇蕾出现，镜检菌丝着色深、粗壮、分枝多、有锁状联合、生长点明显可见。
出菇管理菌袋培养25～35天，菌丝长满全袋，继续培养7～10天，打开袋口或脱袋处理。采用脱袋的，竖立排放在阳畦内，袋与袋之间相距1cm距离，中间空隙用营养防杂土填满(营养防杂土配方为每百斤土中加白灰2％、草木灰1％、尿素0.3％、KH2PO40.1％、MgSO40.2％)，袋上层覆1～2cm厚营养防杂土，搭上遮雨遮阳棚，并拉大温度刺激，使温度保持在13～34℃(较适合15～18℃)，同时增加空气相对湿度85～90％，加强通风，增加散射光，5～7天会形成子实体。子实体一般单生或丛生，一般中等大，菌盖直径3～12cm，初扁平球形，边缘稍内卷、后渐平展、很粘、谷黄色、污黄色至黄褐色，有褐色近平伏的鳞片，中央较空，菌肉白色至淡黄色，菌褶白色到锈褐色，直生或近弯生、稍密、不等长，菌柄长5cm，粗0.5～3cm，圆柱形与菌盖同生，有褐色反卷的鳞片，粘或稍粘，下部常弯曲，纤维质肉实，菌环淡黄色，膜质，生柄之上部，易脱落。孢子锈色，椭圆形或长椭圆形、平滑、7.5～9.5um×5～6.3um。囊状体无色或淡褐色，棒状不突破子实层，30～42um×6.3～7.5um。上述形态与野生多脂磷伞完全相同。
实施例2称取多脂磷伞子实体1Kg，加水20Kg，95℃反复提取3次，每次1小时。合并提取液，过滤，减压真空浓缩，热测比重1.04，精滤。加食用乙醇醇沉，最终浓度达70％。过滤，收集沉淀，水溶。离心除渣，取上清醇沉(醇浓度70％)2-3次，收集沉淀，得多伞磷脂多糖120g。
实施例3称取多脂磷伞菌丝体1Kg，加水20Kg，98℃提取三次，每次1小时。合并提取液，过滤，减压真空浓缩，热测比重1.04，精滤。加食用乙醇醇沉，最终浓度达80％。过滤，收集沉淀，水溶。离心除渣，取上清醇沉(醇浓度80％)2-3次，收集沉淀，得多伞磷脂多糖100g。
实施例4称取多脂磷伞子实体1Kg，加水20Kg，96℃反复提取3次，每次1小时。合并提取液，过滤，减压真空浓缩，热测比重1.06，精滤。加入木瓜蛋白酶2-5g，调温45-60℃，PH值5-7，水解除蛋白。精滤，加食用乙醇醇沉，最终浓度达60％。过滤，收集沉淀，水溶，醇沉反复2-3次，收集沉淀，得多伞磷脂多糖120g。
实施例5称取多脂磷伞菌丝体1Kg，加水20Kg，98℃反复提取3次，每次1小时。合并提取液，过滤，减压真空浓缩，热测比重1.02，精滤。加入木瓜蛋白酶1-3g，调温40-55℃，PH值3-5，水解除蛋白，精滤。加食用乙醇醇沉，最终浓度达70％。过滤，收集沉淀，水溶，醇沉反复2-3次，收集沉淀，得多伞磷脂多糖100g。
实施例6多脂磷伞核酸的提取取多脂磷伞1kg加入氯仿10kg后研磨，然后加入等体积的核酸提取液(100mM Tris-Hcl，50mM EDTA，50mM Nacl，1.5％SDS)，混均后于10000转/分离心20分钟，取上清液加入无水乙醇中，振荡2次，12000转/分离心10分钟，倒掉上清液，加70％乙醇洗涤，取沉淀干燥后即可得多脂磷伞核酸10g。
实施例7
多脂磷伞营养液称取多脂磷伞菌丝体(或子实体)1Kg粉碎后加水20Kg，煮沸30分钟，分瓶灌装，10ml/瓶，其它项目应符合中华人民共和国药典2000年版口服液项下。
权利要求
1.一种多脂磷伞种Pa-I·H菌株，具有以下表征菌落外观菌丝棉绒状、较短、气生菌丝不发达、初期白色、后期淡黄色。镜检(1)菌丝粗壮，分枝多。(2)美蓝单染色着色深、均匀。(3)可见大量生长点无空泡。(4)有锁状联合，且较发达。(5)无杂菌污染。生理生化特征(3)生长最佳温度24～26℃。(4)生长最佳PH值6.0～6.5。(5)对氧的需求，好气性。(6)培养基生长最佳水分60％。(7)生长最佳湿度60～65％。
2.权利要求1所述的多脂磷伞菌的方法，包括以下步骤完成斜面培养、液体深层发酵、种子培养、菌丝体培养和子实体培养；斜面培养，所用的培养基为PDA综合培养基，PH6～6.5，培养温度24～26℃，培养时间10～12天；摇瓶种子培养，接种量为斜面与摇瓶之比1∶6，培养温度24～26℃，培养时间7～10天，旋转式摇床的转速为170～200转/分钟；菌丝体培养，选择的培养基为硬杂木屑、黄豆秆粉、玉米芯粉、玉米面、麦麸、石膏、白灰等混合物，养温度24～26℃，培养时间25～35天，PH6～6.5；出菇管理，包括适时脱袋处理，温度13～34℃，湿度85～90％，加大通风，给予散射光，直至长出多脂磷伞子实体。
3.权利要求2方法的产品。
4.多脂磷伞多糖的提取方法包括以下步骤提取以多脂磷伞子实体为原料，用水煎1～3次，每次时间为1～3小时，滤过，合并滤液，浓缩，加入蛋白酶，调温45～60℃，PH值5～7，水解除去蛋白；精滤后加乙醇进行醇沉，最终浓度为70％，过滤收集沉淀，水溶，离心除渣，取上清液醇沉至醇浓度为70％，收集沉淀的多脂磷伞多糖。
5.多脂磷伞多糖的提取方法包括以下步骤提取以多脂磷伞子实体为原料，用20％乙醇回流提取3次，每次时间为3小时，合并提取液，减压浓缩，浓缩液加乙醇至含醇量为80％，静置24小时，抽滤，沉淀物以无水乙醇适量洗涤，干燥，粉碎成细粉，得以多脂磷伞多糖。
6.多脂磷伞核酸是通过以下提取方法获得的按重量比1∶8～12取多脂磷伞加入氯仿后研磨，然后加入等体积的核酸提取液，混均后于10000转/分离心20分钟，取上清液加入无水乙醇溶液，振荡2次，12000转/分离心10分钟，取沉淀物，加70％乙醇洗涤，所得到的沉淀干燥后即可。
7.权利要求4或5的多脂磷伞多糖在用于预防和治疗肿瘤、提高免疫力等疾病，并具有镇痛、抗炎作用的药物中的应用。
8.权利要求6的多脂磷伞核酸在用于预防和治疗肿瘤、提高免疫力等疾病，并具有镇痛、抗炎作用的药物中的应用。
9.用于预防和治疗抗肿瘤、提高免疫力，并具有镇痛、抗炎作用的药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求5或6的多脂磷伞多糖和药学上可接受的载体。
10.根据权利要求7至9所述的药物，其特征在于所说的药剂是任何一种药剂学上所说的剂型。
全文摘要
本发明公开一种多脂磷伞Pa－I·H菌株，以该菌种人工培育多脂磷伞的方法及其药用用途和以其活性成分的药物组合物，利用分离后的多脂磷伞菌Pa－I·H菌株进行人工栽培多脂磷伞子实体采用固态—液态—固态的工艺路线，包括如下步骤斜面培养、液体深层发酵、种子培养、菌丝体培养和子实体培养。本发明的多脂磷伞为种传代18次以上不退化，属于抗老化能力、稳定性代谢能力强的菌株。本发明还公开了多脂磷伞的提取物多脂磷伞多糖和多脂磷伞核酸及其在预防和治疗肿瘤、提高免疫力等疾病，并具有镇痛、抗炎作用的药物中的应用。
文档编号A61K31/715GK1513973SQ03127070
公开日2004年7月21日 申请日期2003年6月11日 优先权日2003年6月11日
发明者毛玉邦, 魏成松, 于春波 申请人:中国高科集团股份有限公司