专利名称：：植物花色素苷合成后期关键酶—花色素合成酶编码基因的制作方法
技术领域：
：本发明涉及与植物花色素苷形成相关的酶编码基因勾应用。賴駄花的颜色是决定花观赏价值的重要因素之一，花色主要由类黄酮(flavonoids)、类胡萝卜素(carotenoids)、生物碱(alkaloid)三大类物质决定(TanakaY,STsuda，TKusumi.MetabolicEngineeringtomodifyflowerscolor.PlantCellPhysioloy，1998(1l):l119-1126.)。花色素苷(anthocyanins)是类黄酮中一类主耍色素，控制着花的粉红色、红色、砖红色、蓝色、紫色等花色，植物中基本的花色素苷有3种，即花葵素、花青素、花翠素，以及这些花色素的甲基化衍生物等。(徐纪尊,王丽辉,潘庆玉.观赏植物花色基因转化的研究进展[J].中国农业科技导报,2006,8(5):5660.)。花色素合成酶是花色素苷生物合成途径中后期表达的第二个关键酶，催化无色的原花色素(leucoarthocyanidins)氧化产生有色的花色素(anthocyanidin)对植物的色彩形成至关重要。ANS在催化反应时会选择携带有一个"P-face"碳-3羟基基团的二氢黄酮醇为底物，并通过"a-face"脱水作用生成戊二醇(祝钦泷.彩叶草(50/^0败,《^她//^0^^)叶色形成相关的花色素苷合成途径的分子调控:[博士学位论文].重庆:西南人学，2007)。目前报道的大多数^VS基因的结构均由2个外显子和1个内含子组成，且剪接位点一致，如拟南芥(AT4G2288)、裂叶牵牛(/po/Kora/2e<ieracra,AY257210)、草莓(FragcWa(3wawoS(3,AY695818)、金钟连翘(Fors^Wa!'"ferwefi/a;Rosati,SimoneauP.MoleeularcharacterizationoftheanthocyanidinsynthasegeneinForsythiaxintermediarevealsorgan-specificexpressionduringflowerdevelopment.PlantSci.，1999，149:73-79)等，但小麦(7W"cwwaeWvMw,AB247921)和水稻的Q^AW(Os06g0626700)却没有内含子。^VS基因在紫苏中冇2-3个拷贝(Gongetal.Cloningandmolecularanalysisofstructuralgenesinvolvedinanthocyaninbiosynthesisandexpressedinaforma-specificmannerinPm7/a并z/tocmy.PlantMolBiol1997,35:925-927)，在金钟连翘中有2个拷贝，而在葡萄中只有1个拷贝(Sparvolietal.Cloningandmolecularanalysisofstructuralgenesinvolvedinflavonoidandstibenebiosynthesisingrape(Ftov/"z/erai.).PlantMolBiol,1994,24:743-755),因此推测^A^基因是由单基因或小基因家族构成。多序列比对和保守结构域搜索显示，ANS蛋白都含有两个保守结构域，20G-FeII—Oxy(20G-Fe(H)氧化酶超家族)结构域和PcbC(COG3491，异青霉素N-合成酶和相关双加氧酶)结构域，与2-ODD家族的F3H，FLS及FNSI有大约30。/。左右的序列同源性，被推测属于2-ODD(2-酮戊二酸依赖的氧化酶)家族(PrescottandJohn,1996)。这个推测被两个独立的研究证明(Saitoetal.Directevidenceforanthocyanidinsynthaseasa2-oxoglutarate-dependentoxygenase:molecularcloningandfunctionalexpressionofcDNAfromaredformaofPerillafrutescens.PlantJ,199917(2),17(2),181-189,;Turnbulletal.purificationcrystallizationandpreliminaryX-raydiffractionofanthocyanidinsynthasefrom^ra6油/M!'sf/2a//awa,ActaCrystallographica,SectionD,2001，57(Pt3):425-427)。Rupert等在拟南芥中得到了ANS的晶体结构，发现其活性位点是一个金属离子、共底物(cosubstrate)和两分子的底物类似物(substrateanalog)共同构成的多复合体(RupertC,WilmouthR,JonathanJ,etal.StructureandmechanismofanthocyanidinsynthasefromJra/^o/whStructure,2002，10:93-103)。拟南芥ANS是S前唯一己知三维结构的2-ODD家族的蛋白，是黄酮类化合物合成途径中其它2-ODD蛋白三维建模的基础。ANS已开始作为花色基因工程和代谢工程的调控点，Rosati等将紫罗兰的^W基因导入金钟连翘CForj^Wa/"tenwe&a)中使原为黄色的金钟花开出了棕色的花朵(Rosati，SimmoneauPetal.TransformationofForsythiaXintermediacv'SpringGlory'withtwoflovonoidpathwaygenesleadstoanthocyaninsynthesisinpetalsatearlyfloweringstages.PolyphenolsCommun，2000，l:57-58)。Carlo等将C7/S和^VS基因同时转入美国金钟连翘获得了具有深橙黄色花朵的新品种，而分别转入这两种基因则无改变花色的效果(CarloR,PhilippeS,DieterT,etal.Engineeringofflowercolorinforsythiabyexpressionoftwoindependentlytransformeddihydroflavonol4-reductaseandanthocyanidinsynthasegenesofflavonoidpathway.MolBreed,2003,12:197-208)。Nakatsuka等发现，爿AW基因的突变是导致龙胆花变为白色的重要原因(NakatsukaT,NishiharaM，MishibaK，etal.Twodifferentmutationsareinvolvedintheformationofwhite-floweredgentianplants.PlantSci,2005,169:949-58)。Ambavaram等在果皮有原花色素积累，其余组织不含无任何花色素苷的水稻W尸(Mx^^a//^/^taW)突变体中，超量表达水稻^VS基因，导致转基因植株的叶鞘、节间、稻壳中出现不同程度的花色素苷的积累，并在整个转基因植株抗氧化能力的增强(Ambavarametal.Noveltransgenicriceoverexpressinganthocyanidinsynthaseaccumulatesamixtureofflavonoidsleadingtoanincreasedantioxidantpotential.MetabolicEngineering,2007,9:95-111》。
发明内容本发明的目的是提供一种与植物花色素苷形成相关的酶及其编码基因。本发明所提供的与植物花色素苷形成相关的酶，名称为ANS，来源于苹果属王族海棠(Malus)，是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物花色素苷形成相关的由l)衍生的酶。上述与植物花色素苷形成相关的酶的cDNA基因也属于本发明的保护范围。与植物花色素苷形成相关的酶的cDNA基因具体可为如下l)-4)中任一所述的基因1)其编码序列是序列表中序列1的自5'末端第1-1350位脱氧核糖核苷酸；2)其核苷酸序列是序列表中的序列l;3)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码上述与植物花色素苷形成相关的酶的DNA分子；4)与l)的基因具有95%以上的同源性，且编码上述与植物花色素苷形成相关的酶的DNA分子。序列表中的序列1由1350个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5'末端第1-1350位碱基，编码氨基酸序列是序列表中序列2的ANS。扩增上^AW基因全长或任一片段的弓I物对也属于本发明的保护范围。具体实施例方式卜述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物合成及测序工作均由上海生i:生物技术服务有限公司完成。限制性内切酶EcoRl、HindIII和Taq酶，T4DNA连接酶均购自大连宝生物工程有限公司，pBS-T-VectorKit载体试剂盒购自天为时代生物公司，BDSMARTRACEcDNAAmplificationKit购自Clontech公司。Amp抗生素、Tris饱和酚、水饱和酚、DEPC、DL2000DNAMarker、琼脂糖、酵母提取物、胰蛋白胨均购自北京鼎国生物技术有限公司。一、MMA^基因3'端序列的获得以王族海棠(Mate/o戸^)(北京农学院海棠种质资源圃)为实验材料，提取其根的总RNA，将提取得到的总RNA用50^1的DEPC水溶解，电泳检测。经甲醛变性凝胶电泳分析，结果如图1所示。从图中可以清晰地看到28SrRNA禾tl18SrRNA两条带，且28SrRNA禾U18SrRNA含a之比大约为1:1-2:1。结果表明，提取得到的RNA是完整的，染色结果显示，提取得到的总RNA可以用来进行反转录。~以上述提取得到的根总RNA为模板，将其反转录为cDNA。再以此cDNA为模板，跟据近缘物种植物^AW基因保守区段序列，设计3'race上游引物ANS3F扩增A/MWS基因的3'端序列。MasterMix预混物体系如下预混物体积(nL)ddH2025.810PCR缓冲液4dNTPMixture(2.5mM)3.2T叫酶(5U/1)1总体积34pL，将上述MasterMix预混物平均分成2管，每管，按照下表加入引物:双引物对照样品(序列表中序列3)i^IANS3F(序列表中序列4)lpl模板一lpl5PCR反应条件先95。C预变性3min;然后95'C变性15S;68。C退火6min，共30个循环；最后72。C延伸10min。取10nLPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，其中，M为MARKERII的DNA分于量标准，1为样品组的PCR扩增结果，2为ANS3F和3R双引物对照。结果表明，双引物对照组没有扩增出特异条带，只有样品组扩增得到900bp左右的片段。切下目的条带，纯化回收后按照pBS-T-VectorKit载体试剂盒(天为时代生物公司)说明书将PCR产物连接到pBS-T载体上，进行测序。经同源性比较分析后确定获得的899bp片段即是^VS基因的3'端序列。二、^VS基因5'端序列的获得以步骤一获得的保守序列为模板，在其5'端设计引物，进行PCR反应，扩增MMAW基因的5'端序列。MasterMix预混物体系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>总体积34^L，将上述MasterMix预混物平均分成2管，每管，按照下表加入引物:双引物对照样品<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>PCR反应条件先95。C预变性3min;然后95'C变性15S;68'C退火6min，共30个循环；最后72'C延伸7min。将第一轮PCR产物稀释1000倍，取lnL作为模板，以5F和ANS5R2(序列表中序列6)为引物，进行巢式PCR反应，PCR反应条件与第一轮相同。取10nL第二轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示，其中，M为MARKERII的DNA分子量标准，1为样品组的PCR扩增结果，2为ANS5R2和5F双引物对照。结果表明，双引物对照组没有扩增出特异条带，只有样品组扩增得到750bp左右的片段。切下目的条带，纯化回收后按照pBS-T-VectorKit载体试剂盒(天为时代生物公司)说明书将PCR产物连接到pBS-T载体上，进行测序。经同源性比较分析后确定获得的781bp片段即是A/MAW基因的5'端序列。三、M/"AVS基因全长cDNA序列的获得将上述PCR扩增获得的Mvi膽基因5'端序列以及3'端序列进行同源性比较，利用DNAMAN等生物软件进行拼接校正，拼接出MM7VS基因全长cDNA序列。根据拼接的MMAW基因全长cDNA序列设计引物ANSF和ANSR(序列表中序列7和序列8)，提取王族海棠叶根的总RNA，反转录为cDNA，利用RT-PCR方法扩增全长MMAW基因，用高保真Pfu酶替换rag酶，PCR反应混合物如下<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>PCR反应条件先94'C预变性3min;然后94°C50S，62°Clmin，72°C2min，共35个循环；再72。C延伸7min，4'C保存。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示，其中，M为MARKERII的DNA分子量标准，1为A^4MS基因全长cDNA序列的PCR产物。结果表明获得约1100bp的条带。切下该目的条带，纯化回收后按照pBS-T-VectorKit载体试剂盒(天为时代生物公司)说明书将PCR产物连接到pBS-T载体上。对扩增得到的MMA/S基因全长cDNA序列进行测序，测序结果表明，获得1074bp的条带，该1074bp的核苷酸片段即为A/MMS，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，其编码的氨基酸序列如序列表中序列2所示。序列表序列一DNA苹果属王族海棠1074CAACCATCCC121TCGAACAAGA181AGTCTGATAA241ACTGGGGTGT301GGAAGGCCGG361ACCAGGCCTC421AGCTTGAGTG481CTATTTGGCC541TGAGGGAGTT601GGAGGCTGGA661ACTACCCAAA721GTGCACTCAC781AGTGGGTCAC841AGATTTTGAG901AGGTGAGGAT961CACTGCCGGA1021AGCACATTCA1081CGTTGTGCTA1141AGTTGGTATG81201GCTACTCCTG1261GAATGGCTAT1321TTTCAAGTCAAGATTTCAACAAAAAAAAAA序列二PRT苹果属王族海棠161lEQKEKYAND121QASGKIQGYGSKLANNASGQLEWEDYFFHCVYPEDKRDLSIWPQTPADYIEATAEYAK(^LLGVEAHTDVS241ALTFILHNMVPGLQLFYEGKWVTAKCVPNSIVMHIGDTLEILSNGKYKSILHRGMVNKEK301序列三DNA人工序列3R和5F:Long(0.4(iM):Short(2nM):5'—CTAATACGACTCACTATAGGGC_3'序列四DNA人工序列ANS3F:5，-gggaGGACTACTTCTTCCAC-3，。序列五DNA人工序列ANS5R1:5，-GGAACCATGTTGTGGAGGATG-3，。序列六DNA人工序列ANS5R2:5'-GGCGAGTGCACTCACGTCAG-3'序列七DNA人工序列ANSF:5，-ATGGTGAGTTCTGATTCAGTGAAT-3'序列八DNA人工序列ANSR:5，國TCACTTGGGGAGCAAAGCCTC-3'10图1为王族海棠叶总RNA的题取结果图2为JWh4iVS基因的5'RACEPCR扩增结果图3为MrJiVS基因的3'RACEPCR扩增结果图4为MMAW基因全长cDNA序列的PCR扩增结果权利要求1、一种蛋白，是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物花色素苷形成相关的由1)衍生的蛋白质。2、权利要求l所述蛋白的编码基因。3、根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述蛋白的cDNA基因为如下l)-4)中任一所述的基因[1)其编码序列是序列表中序列1的自5'末端第1-1350位脱氧核糖核苷酸；[2)其核苷酸序列是序列表中的序列l;[3)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子；[4)与l)的基因具有95。/。以上的同源性且编码编码权利要求l所述蛋白的DNA分子。全文摘要本发明公开了一种植物花色素苷合成后期关键酶的编码基因。该蛋白，是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且能改变植物花色或叶色的由1)衍生的蛋白质。文档编号C12N15/11GK101538559SQ20081022609公开日2009年9月23日申请日期2008年11月6日优先权日2008年11月6日发明者姚允聪,宋婷婷,沈红香,佶田申请人:北京农学院;姚允聪