专利名称：：一株高效固氮短芽孢杆菌及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
，具体地涉及一株高效固氮短芽孢杆菌。技术背景氮素是农作物最重要的大量营养元素，氮肥是农业生产中最重要的生产资料之一。生产化学氮肥消耗大量能源，占生产总成本的70%~80%。近年来能源日趋紧张，我国化肥生产用煤价格飚升导致化学氮肥价格上涨，农民难以承受，反响强烈。此外,化学氮肥在提高作物产量、保障我国粮食安全方面发挥了巨大作用，但是不合理施氮已经形成了严重的面源污染，造成一系列的严重危害，如太湖蓝藻事件令人触目惊心。城巿地下水硝酸盐污染已经对饮用水安全造成了威胁。大气中含有78%的氮素，但其存在形式是分子态氮气，动植物不能直接利用，自然界只有某些原核微生物具有直接利用大气中氮气的能力，将其还原成氨，这就是生物固氮作用。根据固氮微生物与植物的关系，生物固氮可以分为共生固氮、联合固氮和自生固氮三种类型。共生固氮包括①根瘤菌与豆科植物共生，②弗兰克氏菌与非豆科植物乔木或灌木共生，③蓝细菌与真菌、苔藓、蕨类植物共生。联合固氮是指某些固氮微生物定居于根圈、根表，甚至进入根内，获得植物分泌物作营养，同时可以固定空气中的氮素供自己和植物利用，并分泌生长激素，促进植物生长。联合固氮体系中，植物与微生物的结合程度弱于共生固氮，不形成专门的固氮结构。自生固氮则是固氮微生物独立于植物，自行将空气中的氮转化成氨，供自身营养。在这三大固氮体系中，能为大豆、花生等豆类作物提供氮素营养的是根瘤菌与豆科植物共生固氮体系，而要为水稻、玉米、小麦、棉花、蔬菜、果树等非豆科作物提供氮素营养则要发掘联合固氮和自生固氣微生物的潜能。选用高效固氮微生物菌种工厂化生产制成菌剂，或进一步与其它富含植物营养的物料复合加工成生物制品，应用于农业生产，可以提供作物氮素营养，改善作物根际生态环境，提高土壤生物肥力性状，这就是通常所说的固氮微生物菌剂或固氮微生物肥料。生物氮肥具有多种优势①生物氮肥由可再生的生化制剂和活体微生物组成，可以再生，不存在资源枯竭问题，是可持续发展农资产品。②生物氮肥是环境友好型肥料，其生产和使用过程均不产生三废等污染性物质，而且能改善土壤理化性质，提高土壤肥力，是生态农业农资产品。③生物氮肥生产耗能少、成本低，其成本仅为等效化学氮肥的20%~40%，可以为国家节省大量的煤炭和石油等能源战略物资。使用生物氮肥可以显著降低农业生产成本，提高农产品品质，提升土壤肥力，使农民受益，促进社会和谐发展。菌种是微生物肥料生产应用的基础。目前，限制我国微生物肥料行业发展的瓶颈就是髙效菌种的选育问题。农业生产迫切需求适用农作物范围广、田间竟争性强、固氮效能高、抗逆性强、货架期长的微生物肥料生产用菌种。本发明是从全国各地广泛釆集土壤样品，经过层层选拔最终选育出了高效固氮菌GD296，该菌株固氮酶活性高，土壤竟争适应能力强，接种效果好，在固氮微生物菌剂和生物有机肥生产中具有广阔的应用前景。
发明内容(一)要解决的技术问题本发明的目的是提供一株高效固氮短芽孢杆菌，本发明的又一目的是公开该细菌的应用。(二)技术方案本发明所述的短芽孢杆菌(S^W6ac/〃wssp.),该菌株已于2008年11月17曰被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC,保藏编号为CGMCCNo.JHL_。该高效固氮菌(GD296菌)经形态、生理生化特征分析和16srDNA基因序列同源性分析，鉴定为变型细菌a亚群类芽孢杆菌科短芽孢杆菌属(^^v/6"c/〃wsp.)。GD296菌最适生长温度为28°C，最适生长pH为7~8。该菌能在作物根际高效固氮，可应用于生产固氮微生物菌剂和生物有机肥。(三)有益效果，本发明所述的固氮短芽孢杆菌(&evAac/〃wssp.)CGMCCNo.，该菌的固氮酶活性高达4.68nmol/mg'h,接种小白菜后植株鲜重增加313%,干重增加409%,全氮含量增加631%，增产效果显著，接种效果明显好于施用化学氮肥和接种圆褐固氮菌ACCC11103的试验处理。该菌在生产固氮微生物菌剂和生物有机肥上具有很好的生产应用前景。本发明所述的短芽孢杆菌(^^/^c/〃wsp.),该菌株已于2008年11月17曰被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC,保藏编号为CGMCCNo.W化；。图1是本发明所述高效固氮菌株GD296与圆褐固氮菌(^zotoZ^cterc/;raococcww)ACCC11103的固氮酶活性比较图。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。实施例l本发明所述高效固氮菌株GD296的分离取10g土样放入90ml无菌水中摇床振荡20min制成混浊液，吸取5ml放入30m個氮菌富集培养液ACCC55(成份为蔗糖10g、K2HP04'3H200.5g、NaCl0.2g、CaCO"g、MgS04.7H200.2g、蒸馏水1000ml、pH7.0—7.2)中，100rpm，28'C进行摇床振荡培养，72h后换新鲜培养液继续培养。重复培养3次后进行固氮芽孢菌分离。吸取lml上述固氮菌富集培养物放到9ml无菌水中制成10"稀释度，继续稀释制成10-2、10-3、IO4、10-5稀释度的菌悬液，在100。C沸水中加热10min,冷却后每个稀释度取0.1ml涂布在固氮菌分离培养基平板上，29。C静置培养。23d待菌落形成后，在改良的ACCC55固氮菌培养基平板上(成份为蔗糖10g、K2HP04.3H200.5g、NaCl0.2g、CaC031g、MgS04.7H200.2g、酵母膏0.5g、蒸馏水1000ml、琼脂1.5%~2.0%,pH7.0~7.2)用平板划线法进行菌种纯化。实施例2本发明所述高效固氮菌株GD296的固氮酶活性测定1、菌体蛋白含量测定用5ml生理盐水将试管斜面上的菌苔洗入离心管中，收集菌体，向沉淀中加入3ml0.5M的NaOH沸水煮沸5min，加入3ml0.5M的HC1混合，离心后取上清1.0ml，加入5ml考马斯亮蓝溶液，在漩涡混合器上混合，显色3min,测定595nm处的吸光值As95，根据牛血清白蛋白标准曲线计算菌体蛋白含量。2、菌株固氮酶活性测定在15xl50mm螺口玻璃管中加入5ml改良固氮培养基制成斜面，接种本发明所述固氮菌，28。C培养。以微生物肥料常用生产菌种圆褐固氮菌(爿zoto&cferc/zraococcww)ACCC11103为阳性对照，不接种空白斜面为阴性对照，设3个重复。培养72h后，换橡胶塞，注入乙炔气体使终浓度为10%，用医用胶布密封，继续培养72h,取10(^1反应气体，用气相色谱仪测定乙烯生成量，根据以下公式计算菌株的固氮酶活性固氮酶活性(nmol/mg'h)=(3必41111101/[菌体蛋白量(mg)x反应时间(h)],其中C2H4nmol=C2H4体积(jil)x273xP/[22.4x(273+t。C)x760]，其中P为气压(mm汞柱)，t为反应温度。实验结果如附图1所示，高效固氮菌GD296的固氮酶活性为4.68nmol/mg'h,显著高于微生物肥料常用生产菌种圆褐固氮菌ACCC11103的固氮酶活性'1.63nmol/mg七。实施例3本发明所述高效固氮菌株GD296的接种效应试验选用菜园土，过2mm土壤筛。试验用盆选用直径13cm,高12cm的塑料花盆，每盆装土约700g。1、育苗种子表面灭菌选取大小一致的小白菜种子用95%酒精浸5min，倒去酒精用3%NaOCl溶液表面灭菌2min,倒去次氯酸钠用无菌水洗6次。育苗及移栽在育苗钵中装入上述灭菌土壤，浇透水每钵播种3粒种子，在智能光照培养箱中育苗，待真叶长到两叶一心时进行移栽。每盆移栽一株，在温室中进行。2、盆栽试验试验设4个处理，即1)无氮对照处理(记为CK1)、2)化学氮肥处理(记为CK2)、3)选育菌种接种处理(记为GD296)和4)参比菌圆褐固氮菌ACCC11103对照处理(记作ACCC11103)。每个处理三盆重复，每盆种小白菜l株，完全随机排列。小白菜移栽两天后进行实验处理，方法为1)无氮对照处理CK1，每盆浇50mlFahraeus无氮植物营养液(成份Na2HP04'12H200.15g,MgS04'7H200.12g,杼檬酸铁0.005g，CaCl2'2H20O.lg,KH2P04O.lg,Gibson微量元素lml,H201000ml,PH6.5~7.0。Gibson微量元素液H3B032.86g，ZnS047H200.22g,CuS04'5H200.08g,MnS04.4H202.03g，Na2Mo04.2H201.26g,H2O1000ml);2)氮肥处理CK2每盆浇50ml有氮全营养液(成份在lOOOmlFahraeus无氮植物营养液中加入0.12g尿素)；3)选育菌种接种处理296,培养收集296菌体，用Fahraeus无氮植物营养液洗涤菌体，稀释到OD6w1.5,每盆浇50ml;4)参比菌圆褐固氮菌对照处理ACCC11103，培养收集ACCC11103菌体，用Fahraeus无氮植物营养液洗涤菌体，稀释到006。。1.5,每盆浇50ml。小白菜生长期间管理按照常规方法进行，30天后收获进行分析测试。3、测定项目及方法包括植株长势、生物量等。植株总含氮量参考《土壤农业化学分析方法》，釆用KDY-9820型凯氏定氮仪进行测定。数据分析釆用SPSS统计分析软件完成。4、实验结果如表1所示。表1高效固氮菌株GD296的接种固氮效能<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注同一列大写字母不同表示差异达到0.01显著水平。小白菜接种高效固氮菌株GD296后，与无氮对照相比植株鲜重增加313%,干重增加409%，植株全氮含量增加631%,增产效果极显著。接种效果显著好于施用化学氮肥和接种固氮菌生产菌种ACCC11103的试验处理，具有很好的生产应用前景。权利要求1、一株高效固氮短芽孢杆菌(Brevibacillussp.)CGMCCNo.id="icf0001"file="A2008102261940002C1.tif"wi="21"he="7"top="28"left="156"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>2、根据权利要求1所述的菌株的固氮酶活性为4.68nmol/mg-h。3、根据权利要求1所述的菌株在生产固氮微生物菌剂和生物有机肥上的应用。全文摘要本发明提供了一株高效固氮短芽孢杆菌(Brevibacillussp.)CGMCCNo.2745。该菌的固氮酶活性高达4.68nmol/mg·h，接种小白菜后植株鲜重增加313％，干重增加409％，全氮含量增加631％，增产效果显著，接种效果明显好于施用化学氮肥和接种圆褐固氮菌ACCC11103的试验处理。该菌在生产固氮微生物菌剂和生物有机肥上具有很好的生产应用前景。文档编号C12N1/20GK101402932SQ20081022619公开日2009年4月8日申请日期2008年11月17日优先权日2008年11月17日发明者孙建光申请人:中国农业科学院农业资源与农业区划研究所