专利名称：拮抗菌核病菌的固氮芽孢菌及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及拮抗菌核病菌的固氮芽孢菌及其应用。
背景技术：
氮肥是农业生产中最重要的生产资料之一。生产化学氮肥消耗大量能源，占生产总成本的70% 80%。近年来能源日趋紧张，我国化肥生产用煤价格飚升导致化学氮肥价格上涨，农民难以承受，反响强烈。此外，化学氮肥在提高作物产量、保障我国粮食安全方面发挥了巨大作用，但是不合理施氮已经形成了严重的面源污染，造成一系列的严重危害，如太湖蓝藻事件令人触目惊心。城市地下水硝酸盐污染已经对饮用水安全造成了威胁。大气中含有78%的氮素，但其存在形式是分子态氮气，动植物不能直接利用，自然界只有某些原核微生物具有直接利用大气中氮气的能力，将其还原成氨，这就是生物固 氮作用。选用高效固氮微生物菌种工厂化生产制成菌剂，或进一步与其它富含植物营养的物料复合加工成生物制品，应用于农业生产，可以提供作物氮素营养，改善作物根际生态环境，提高土壤生物肥力性状，这就是通常所说的固氮微生物菌剂或固氮微生物肥料。生物氮肥具有多种优势①生物氮肥由可再生的生化制剂和活体微生物组成，可以再生，不存在资源枯竭问题，是可持续发展农资产品。②生物氮肥是环境友好型肥料，其生产和使用过程均不产生三废等污染性物质，而且能改善土壤理化性质，提高土壤肥力，是生态农业农资产品。③生物氮肥生产耗能少、成本低，其成本仅为等效化学氮肥的20% 40%，可以为国家节省大量的煤炭和石油等能源战略物资。④使用生物氮肥可以显著降低农业生产成本，提高农产品品质，提升土壤肥力，使农民受益，促进社会和谐发展。核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)的是作物菌核病的病原菌,形态特征表现为子囊盘小，呈小杯状，浅肉色至褐色，单个或几个从菌核上生出，直径O. 5-lcm，柄褐色细长，弯曲，长3-5cm，向下渐细，与菌核相连。菌丝体可以形成菌核，长柄的褐色子囊盘产生在菌核上。菌核形状多样，长3-15 μ m。子囊圆柱形，120-140 μ mX 11 μ m，孢子通常8个，单行排列，椭圆形，8-14 μ mX 4-8 μ m，侧丝细长，线形，无色，顶部较粗。该菌是一种危害作物和蔬菜的世界性的重要的植物病原菌，广泛地侵染、危害十字花科、豆科、茄科、芸香科等植物，如造成油菜、大豆、向日葵、黄瓜、辣椒等经济作物和蔬菜菌核病。目前对菌核病的防治主要依靠化学农药，然而化学防治不仅成本高、污染环境，而且防效也不理想，同时食品的安全性也受到严重影响。菌种是微生物肥料生产应用的基础。目前，限制我国微生物肥料行业发展的瓶颈就是高效菌种的选育问题。农业生产迫切需求固氮效能高、拮抗病原真菌、抗逆性强、货架期长的微生物肥料生产用菌种。
发明内容
本发明的目的是提供一株可以在农作物根际进行高效固氮，并且拮抗核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)的细菌。
本发明所提供的细菌是芽孢杆菌(Bacillus sp.)⑶SD212，该菌株已于2011年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏编号为CGMCC No. 5035。本发明的另一个目的是提供一种菌剂，该菌剂的活性成分为所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035。该菌剂除包含作为活性成分的芽孢杆菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035夕卜，还可包括辅料，如草炭、动物的粪便、各类作物的秸杆、松壳、稻草、花生皮等。该菌剂可用于抑制病原真菌、防治植物真菌病害、固氮、产生固氮酶等。
所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035在制备下述I)-4)中任一菌剂中的应用也属于本发明的保护范围I)用于抑制病原真菌的菌剂；2)用于防治植物真菌病害的菌剂；3)用于固氮的菌剂；4)产生固氮酶的菌剂。所述病原真菌为通过土壤、施入土壤中的肥料、和/或种子传播的真菌，具体可为引起菌核病的真菌；所述植物真菌病害可为菌核病。所述引起菌核病的真菌可为核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)。所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035或以芽孢杆菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035为活性成分的菌剂在生产固氮酶中的应用以及在制备生物有机肥中的应用也属于本发明的保护范围。本发明的再一个目的是提供一种含有芽孢杆菌(Bacillus sp.)⑶SD212CGMCCNo. 5035或以芽孢杆菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035为活性成分的菌剂的生物有机肥。本发明的又一目的是提供一种培养芽孢杆菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCCNo. 5035的方法，包括将芽孢杆菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035在用于培养芽孢杆菌的培养基中培养的步骤。本发明的又一目的是提供一种制备所述菌剂的方法，该方法包括如下步骤将所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035作为活性成分，得到所述菌剂。实验证明，本发明是从土壤样品中经过层层筛选，最终筛选出了芽孢杆菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035，该菌株具有很高的固氮酶活性，能够拮抗作物菌核病病原菌核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum),竞争适应能力强,接种效果好,在固氮微生物菌剂和生物有机肥生产中具有广阔的应用前景。保藏说明菌种名称芽孢杆菌拉丁名(Bacillussp.)菌株编号⑶SD212保藏机构中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏机构简称CGMCC地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号
保藏日期2011年7月6日保藏中心登记入册编号CGMCC No. 503
图I为芽孢杆菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035的固氮酶活性。图2 为芽孢杆菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035 拮抗菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)。 左侧菌落为病原真菌核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum),右侧菌落为芽抱杆菌(Bacillus sp.)GDSD212 CGMCC No. 5035。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。固氮菌富集培养液ACCC55 成份蔗糖 10g、K2HPO4 · 3H20 0. 5g、NaCl 0. 2g、CaCO3Ig^MgSO4 · 7H20 0. 2g、蒸馏水 1000ml、pH 7. 0 7. 2。改良固氮培养基成份蔗糖10g、K2HPO4 · 3H20 0. 5g、NaCl 0. 2g、CaCO3 lg、MgSO4 · 7H20 0. 2g、酵母膏 0. 5g、蒸馏水 1000ml、琼脂 I. 5% 2· 0%, pH7. 0 7· 2。无氮培养基蔗糖10g，NaCl 0. 12g，K2HPO4 · 3H20 0. 5g，CaCO3 lg,MgSO4 · 7H200. 2g，蒸馏水 IOOOmL, pH7. 2。圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum) ACCCl 1103 (参见“孙建光等.高效固氮芽孢杆菌筛选及其生物学特性.中国农业科学，2009，42 ￠) :2043-2051”)。菌核病菌-核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)(中国农业微生物菌种保藏管理中心，ACCC30046)。实施例I、固氮菌⑶SD212的分离与鉴定一、固氮菌⑶SD212的富集与分离取IOg土样(中国黑龙江省氮素营养相对贫瘠的农田土壤)放入90ml无菌水中摇床振荡20min制成混浊液，吸取5ml放入30ml固氮菌富集培养液ACCC55中，lOOrpm，28°C进行摇床振荡培养，72h后换新鲜培养液继续培养。重复培养3次后进行固氮芽孢菌分离。吸取Iml上述固氮菌富集培养物放到9ml无菌水中制成KT1稀释度，继续稀释制成10_2、10_3、10_4、10_5稀释度的菌悬液，在100°C沸水中加热lOmin，冷却后每个稀释度取0. Iml涂布在固氮菌分离培养基平板上，29°C静置培养。2 3d待菌落形成后，在改良的ACCC55固氮菌培养基平板上，用平板划线法进行菌种纯化。将分离并纯化所得的其中一个菌株命名为固氮菌 GDSD212。二、固氮菌⑶SD212的鉴定从以下几个方面鉴定步骤一分离并纯化得到的固氮菌⑶SD212 I、形态学鉴定将处于对数生长期，且菌落大小稳定，上述步骤一分离并纯化得到的固氮菌GDSD212进行单菌落状态描述，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态(是否平坦、突起、褶皱、凹陷等)、菌落边缘状态(是否整齐、不规则、放射状等)。对于处于对数生长期的所述固氮菌⑶SD212，经涂片染色后采用光学显微镜观察菌体的形态。结果表明，上述步骤一分离并纯化得到的固氮菌⑶SD212菌落圆形凸起，浅乳白色，有光泽，表面光滑湿润，边缘整齐；菌体杆状，O. 5 X 2. O 3. O μ m，有芽孢。2、生理生化特征分析参考《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册.北京科学出版社，2011.)和《微生物学实验》(沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验(第三版).北京高等教育出版社，1999.)测定上述固氮菌⑶SD212的生理生化特征。所述固氮菌⑶SD212的生理生化特征测定结果如表I所示表I固氮菌⑶SD212的生理生化特征·
生理生化特征实验结果生理生化特征实验结果
接触酶反应__+ 糖D+葡萄糖__-
VP反应__- 醇D+蔗糖__+吲哚实验__+ 类D+乳糖__-
明胶液化__+ 发D+半乳糖__-
淀粉水解__+ 酵D+核糖__+
卵磷脂酶__- 产L+阿拉伯糖一
硝酸盐还原__+ 酸D+果糖__+
甲基红__~__D+甘露酉早__—
石蕊牛奶反应__+D+山梨醇__+
梓檬酸盐利用__—__D+麦芽糖__+ 苯丙氨酸脱氨酶__=__D+纤维二糖十
产二轻基丙酮__—__甘油glycerol__—
葡萄糖产气__+ 2%NaCl__-
pH5.7生长测定__+___
0.001%溶菌酶__+___注“ + ”表示阳性，“”表示阴性。3、16s rDNA序列同源性分析常规方法培养上述步骤一分离纯化得到的固氮菌GDSD212，提取菌株的总DNA作为基因扩增模板，以细菌16s rDNA通用引物，27f :5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '，1492r -TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'进行PCR反应。反应体系采用上海生物工程有限公司PCR扩增试剂盒。反应程序为95°C变性30s、55°C退火lmin、72°C延伸2min，共30个循环。DNA测序由北京三博远志生物技术公司完成，序列拼接及相似性分析使用DNAStar软件完成，序列比对通过美国国家生物技术信息中心NCBI数据库(http://www. ncbi. nlm.nih. gov)在线完成。固氮芽孢菌⑶SD212菌株16s rDNA的序列详见序列表中序列I。
4、生长特性分析进行了菌株最适温度和最适pH生长实验。采用无氮培养基分别在4°C、28°C、37°C、60°C培养、观察、记录菌株的温度适应性，每个处理3次重复。调整酸度分别为pH3、pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9、pHIO、pHll，每个处理3次重复，培养、观察、记录菌株生长的最适pH。结果表明，所述固氮菌⑶SD212的最适生长温度为28°C，最适生长pH为pH7 8。鉴于上述形态、生理生化特征分析和16s rDNA序列同源性分析结果，将步骤一分离并纯化得到的固氮菌GDSD212鉴定为变型细菌α亚群芽孢杆菌科芽孢杆菌属(Bacillussp.)。该固氮菌⑶SD212已于2011年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏编号为CGMCCNo.5035。实施例2、芽孢杆菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035固氮酶活性测定·对实施例I所得的芽孢杆菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035进行固氮酶活性测定，具体操作如下所述在15X 150mm螺口玻璃管中加入5ml改良固氮培养基制成斜面，接种芽孢杆菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035，28°C培养。以微生物肥料常用生产菌种圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum) ACCC11103为阳性对照,不接种空白斜面为阴性对照，设3个重复。培养72h后，换橡胶塞，注入乙炔气体使终浓度为10%，用医用胶布密封，继续培养72h，取100 μ I反应气体，用气相色谱仪测定乙烯生成量，根据以下公式计算菌株的固氮酶活性。固氮酶活性(nmol/mg ·1ι) = C2H4nmol/[菌体蛋白量(mg) X反应时间(h)]，其中 C2H4nmol = IOOOXC2H4 体积(μ I) X 273XP/[22. 4X (273+t) X 760]，其中P为气压(mm汞柱)，t为反应温度CC )。其中，菌体蛋白含量测定方法如下所述用5ml生理盐水将试管斜面上的菌苔洗入离心管中，收集菌体，向沉淀中加入3ml 0. 5M的NaOH沸水煮沸5min,加入3ml 0. 5M的HCl混合，离心后取上清I. Oml，加入5ml考马斯亮蓝溶液，在漩涡混合器上混合，显色3min，测定595nm处的吸光值A595，根据牛血清白蛋白标准曲线计算菌体蛋白含量。结果显示，筛选到的芽孢杆菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035的固氮酶活性为68. 403nmol C2H4/h -mg蛋白，统计分析显著高于微生物肥料常用生产菌种圆褐固氮菌ACCC11103的固氮酶活性25. IOOnmol C2H4/h · mg蛋白，如图I所示。这一结果表明，本发明的芽孢杆菌(Bacillus sp. )GDSD212 CGMCC No. 5035能高效固氮。实施例3、芽孢杆菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035拮抗病原真菌抑菌率测定采用两点对峙法对实施例I所得到的芽孢杆菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCCNo. 5035进行拮抗病原真菌抑菌率测定，具体操作如下所述在PDA平板上距离中心2cm的两点上分别接种作物病原真菌核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)和芽孢杆菌(Bacillussp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035，每个筛选处理3个重复，以只接病原真菌不接固氮菌的平板为对照。28°C恒温培养，15d后用毫米刻度尺测量对峙平板上病原真菌沿被测芽孢杆菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035方向的菌落半径Γι、及对照平板上病原真菌的菌落半径4。病原真菌生长抑制率(％)=(对照半径对峙培养病原真菌菌落半径r)/对照半径rQX 100%。
结果显不，菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)的 rQ 是 63. 0±2· Imm，I11 是 14.67±1. 13mm。将平均值代人上述公式计算得所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)⑶SD212CGMCCNo. 5035对菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)的抑菌率为 76. 71 %，如图 2所不。
权利要求
1.芽孢杆菌(Bacillussp.)⑶SD212，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No. 5035。
2.一种菌剂，它的活性成分为权利要求I所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)⑶SD212CGMCC No. 5035。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于所述菌剂为下述I)-4)中任一的菌剂 1)用于抑制病原真菌的菌剂； 2)用于防治植物真菌病害的菌剂； 3)用于固氮的菌剂； 4)产生固氮酶的菌剂。
4.权利要求I所述的芽孢杆菌(Bacillussp. )GDSD212 CGMCC No. 5035在制备下述I)-4)中任一的菌剂中的应用 1)用于抑制病原真菌的菌剂； 2)用于防治植物真菌病害的菌剂； 3)用于固氮的菌剂； 4)产生固氮酶的菌剂。
5.根据权利要求3所述的菌剂或权利要求4所述应用，其特征在于所述病原真菌为引起菌核病的真菌；所述植物真菌病害为菌核病。
6.根据权利要求5所述的菌剂或应用，其特征在于所述引起菌核病的真菌为核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)。
7.权利要求1所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035、或权利要求.2、3、5、或6所述菌剂在生产固氮酶中应用；或， 权利要求1所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035、或权利要求2、.3、5、或6所述菌剂在生产生物有机肥中应用。
8.含有权利要求1所述的芽孢杆菌(Bacillussp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035、或权利要求2、3、5、或6所述菌剂的生物有机肥。
9.培养权利要求1所述的芽孢杆菌(Bacillussp. )GDSD212 CGMCC No. 5035的方法，包括将芽孢杆菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035在用于培养芽孢杆菌的培养基中培养的步骤。
10.权利要求2、3、5或6所述菌剂的制备方法，包括如下步骤将权利要求I所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035作为活性成分，得到所述菌剂。
全文摘要
本发明公开了拮抗菌核病菌的固氮芽孢菌及其用途。该固氮芽孢菌是芽孢杆菌(Bacillus sp.)GDSD212，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.5035。本发明所提供的芽孢杆菌(Bacillus sp.)GDSD212 CGMCC No.5035具有较高的固氮活性，可以有效拮抗菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)，在固氮微生物菌剂和生物有机肥生产中具有广阔的应用前景。
文档编号C05G3/00GK102876596SQ20111019758
公开日2013年1月16日 申请日期2011年7月15日 优先权日2011年7月15日
发明者周剑浩, 孙建光, 江峰, 徐晶, 张友恒 申请人:上海环垦生态科技有限公司, 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所