专利名称：一株从白蚁肠道内分离的固氮菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株固氮菌。
背景技术：
白蚁Termite属于节肢动物门昆虫纲有翅亚纲等翅目的昆虫，是较为古老的社会性害虫，主要以富含纤维素、半纤维素和木质素等木质材料为食，这种本领是靠其后肠内的微生物的作用。Termite若丧失了肠道中消化木质素和纤维素的微生物的作用，就会因为不能消化木材而死。Termite属于典型的寡氮营养型生物，其肠道固氮微生物的固氮作用是白蚁体内氮素的主要来源。Termite肠道固氮菌及其代谢产物可能直接作为Termite生长的氮源， 这使Termite得以利用含氮极低的木质食物为生。固氮作用是Termite生命活动必不可少的，可以通过破坏Termite的固氮系统，使Termite氮素营养不良而死亡，这不失为是一种值得探索的防治白蚁方法与途径。目前，对于Termite氮营养方面，还有许多重要问题仍需作进一步研究，这不仅具有理论意义，而且也有一定的应用意义。
发明内容
本发明提供了一株从白蚁肠道内分离的固氮菌。一株从白蚁肠道内分离的固氮菌，它为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) HUB-IV-004，属于克雷伯菌属(Klebsiella)，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO =M 2011312，保藏日期为2011年9月 15日；它为革兰氏阴性菌，呈短杆状，长为2. 0 μ m 2. 2 μ m，宽为1. 6 μ m 2 μ m，有荚膜； 在无氮培养基上形成乳白色半透明的圆形菌落，菌落边缘整齐，表面湿润不易挑取，培养5d 后有褐色色素产生。本发明中一株从白蚁肠道内分离的固氮菌，它为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) HUB-IV-004,其半固体穿刺试验阴性、淀粉水解试验阳性、脂肪水解试验阴性、 明胶水解试验阴性、H2S试验阳性、尿素试验阳性、吲哚试验阴性、甲基红试验阳性、伏普试验阳性、柠檬酸盐试验阳性、尿酶试验阳性、蔗糖试验产酸产气、麦芽糖试验产酸产气、D-山梨醇试验产酸产气、鼠李糖试验产酸产气、甘露醇试验产酸产气、乳糖试验产酸产气、海藻糖试验产酸产气，最适生长温度为37°C，最适合生长pH为7. 0 士0. 2。本发明一株从白蚁肠道内分离的固氮菌，它为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) HUB-IV-004，经 16S rDNA 测序其基因序列与 GenBank (http //www. ncbi. nlm. nih. gov)数据库中已知细菌16S rDNA基因序列进行比对，获取相近典型菌株的基因序列； 利用MEGA4. 1和Clustal X软件绘制固氮菌株HUB-IV-004的系统进化树，菌株HUB-IV-004 与K. pneumoniae 342菌株的亲缘关系最近，比对后相似性达99%;结合菌株HUB-IV-004形态学观察、生理生化试验鉴定结果，确定菌株HUB-IV-004为克雷伯菌属(Klebsiella)的一个新菌株，命名为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HUB-IV-004。
本发明一株从白蚁肠道内分离的固氮菌，它为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) HUB-IV-004，属于克雷伯菌属(Klebsiella)，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO =M 2011312，保藏日期为2011年9月 15日。本发明从白蚁肠道内分离固氮菌株，并采用分子生物学方法对其进行鉴定，并结合生理生化特性等对其进行分类学鉴定，确定其种类地位，本发明肺炎克雷伯氏菌 (Klebsiella pneumoniae)HUB-IV-004，属于克雷伯菌属(Klebsiella)，它作为指示菌，可以被树木内生菌发酵产物所抑制，从而破坏白蚁的固氮系统，白蚁氮氮素营养不良而死亡， 达到防治白蚁的目的，同时开发了可利用的固氮微生物资源及筛选，对开发人畜无毒、环保的杀白蚁生物药剂具有重要的理论意义和现实意义。
图1为具体实施方式
一中16S rDNA PCR扩增产物电泳图，其中M :DNA Marker DL2000, Lane 1 :HUB-IV_004 16S rDNA 扩增片段；图2为具体实施方式
一中肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HUB-IV-004 的16S rDNA的系统发育树。
具体实施例方式具体实施方式
一本实施方式一株从白蚁肠道内分离的固氮菌，它为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HUB-IV-004，属于克雷伯菌属(Klebsiella)，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO =M 2011312，保藏日期为2011年9月15日；它为革兰氏阴性菌，呈短杆状，长为2.0μπι 2.2μπι，宽为 1. 6 μ m 2 μ m，有荚膜；在无氮培养基上形成乳白色半透明的圆形菌落，菌落边缘整齐，表面湿润不易挑取，培养5d后有褐色色素产生。本实施方式中肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HUB-IV-004可在无氮培养基上生长，最适生长温度为37°C，最适合生长pH为7. 0 士0. 2。本实施方式一株从白蚁肠道内分离的固氮菌它的筛选方法按以下步骤实现一、制备白蚁勻浆从蚁巢中收集10只健康的白蚁，用体积浓度为75%的乙醇消毒3-^iin，无菌水冲洗3次后，切去头胸部，腹部置于已灭菌的培养皿中；之后，无菌操作将10只白蚁腹部转入已灭菌的装有0. lmmol/L pH 7. 0磷酸盐缓冲液的研钵中，研磨成勻浆，加入IOmL无菌水稀释成混浊液，即为白蚁勻浆；同时，将消过毒的白蚁腹部于计数培养基平板上滚动擦拭，放入培养箱培养，以检验白蚁表面消毒是否彻底；二、富集培养用灭菌的移液枪吸取ImL白蚁勻浆装入盛有30mL富集培养基的250mL的三角瓶中，100r/min、30°C，培养 3_5d ；三、平板分离单菌落将富集培养后的培养液梯度稀释至ιο-2、ιο-3、ιο-4、ιο-5、ιο-6、 (Τ和10_8，用移液枪各取0. ImL培养液，无菌操作涂布于平板培养基上，30°C下倒置培养Mh ；挑取生长较大及不同形态菌落纯化6次以上，镜检，将纯化的单菌落转至斜面培养基，4°C冰箱保存；每次试验重复三次(n = 3)。本实施方式所述富集培养基(无氮培养基)的制备过程为蔗糖15g、KH2PO4 0.8g、MgSO4 0. 2g、NaCl 0. 2g、CaCO3 lg、质量分数为 10% 的 Na2MO4 · 2H20 lmL、质量分数为10%的H3BO3 lmL、质量分数为10%的MnSO4 lmL、质量分数为10 %的！^e2SO4 ImL、H2O IOOOmLdif PH至6. 5-7. 0，121°C灭菌30min ；平板/斜面分离培养基的制备过程为在富集培养基中加入2%琼脂制成平板分离培养基，灭菌后，倒入无菌培养皿中备用。本实施方式所述白蚁为黑翅土白蚁(Odontotermes formosanus)，取自中国武汉珞珈山大白蚁亚科的高等培菌白蚁。对筛选所得菌进行生理生化试验依据《伯杰氏细菌学鉴定手册》(第八版)和《常见细菌系统鉴定手册》对其进行常规生理生化鉴定，实验结果为半固体穿刺试验阴性、淀粉水解试验阳性、脂肪水解试验阴性、明胶水解试验阴性、压3试验阳性、尿素试验阳性、吲哚试验阴性、甲基红试验阳性、伏普试验阳性、柠檬酸盐试验阳性、尿酶试验阳性、蔗糖试验产酸产气、麦芽糖试验产酸产气、 D-山梨醇试验产酸产气、鼠李糖试验产酸产气、甘露醇试验产酸产气、乳糖试验产酸产气、 海藻糖试验产酸产气。分子生物学鉴定①以细菌16S rDNA通用引物对肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) HUB-IV-004的DNA片段进行PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳(见图1)。结果可以看出，在 1583bp出现特异条带，条带清晰、完整，无DNA、RNA等污染，此片段与预计的片段条带大小基本吻合；②将阳性克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司测序，序列结果见SEQ ID No. 1，将其基因序列与GenBank (http://www. ncbi. nlm. nih. gov)数据库中已知细菌16S rDNA基因序列进行比对，获取相近典型菌株的基因序列；利用MEGA4. 1和Clustal X软件绘制固氮菌株HUB-IV-004的系统进化树(如图2所示)。结果表明，菌株HUB-IV-004与Klebsiella pneumoniae 342菌株的亲缘关系最近，比对后相似性可达99% ；结合菌株HUB-IV-004形态学观察、生理生化试验鉴定结果，确定菌株HUB-IV-004为克雷伯菌属Klebsiella的一个新菌株,命名为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HUB-IV-004。树木内生菌发酵产物对肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) HUB-IV-004的抑制作用本试验以HUB-IV-004为指示菌，以实验室保藏的树木内生菌HUB-I-004〔它为才古草芽 包杆菌新亚禾中(Bacillus subtilis subsp. Iawsoniana subsp. nov)HUB-I-004, B 在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO =M 209161，保藏日期为2009年7月22日〕、HUB-I-47〔它为枯草芽孢杆菌新亚种(Bacillus subtilis subsp. virginiana subsp. nov)HUB-I-47,已在中国典型培养物保藏中心保藏， 保藏地址为武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO =M 209162，保藏日期为2009年7月22 日〕为功能菌，进行抑菌试验(结果见表1)。表明树木内生菌的发酵产物对肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HUB-IV-004 均有较好的抑制作用。表 权利要求
1. 一株从白蚁肠道内分离的固氮菌，其特征在于它为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) HUB-IV-004，属于克雷伯菌属(Klebsiella)，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO =M 2011312，保藏日期为2011年9月 15日。
全文摘要
一株从白蚁肠道内分离的固氮菌，它涉及一株固氮菌。它为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HUB-IV-004，属于克雷伯菌属(Klebsiella)，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NOM 2011312，保藏日期为2011年9月15日。本发明从白蚁肠道内分离固氮菌株，它作为指示菌，可以被树木内生菌发酵产物所抑制，从而破坏白蚁的固氮系统，白蚁氮氮素营养不良而死亡，达到防治白蚁的目的，同时开发了可利用的固氮微生物资源及筛选，对开发人畜无毒、环保的杀白蚁生物药剂具有重要的理论意义和现实意义。
文档编号C12R1/22GK102363758SQ20111031888
公开日2012年2月29日 申请日期2011年10月19日 优先权日2011年10月19日
发明者周东坡, 张小燕, 赵凯, 郝妍 申请人:黑龙江大学