专利名称：一株变栖克雷伯氏菌菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株变栖克雷伯氏菌菌株。
背景技术：
白蚁(Termite)属于节肢动物门昆虫纲有翅亚纲等翅目的昆虫，是较为古老的社会性害虫，主要以富含纤维素、半纤维素和木质素等木质材料为食，这种本领是靠其后肠内的微生物的作用。Termite若丧失了肠道中消化木质素和纤维素的微生物的作用，就会因为不能消化木材而死。Termite属于典型的寡氮营养型生物，其肠道固氮微生物的固氮作用是白蚁体内氮素的主要来源。Termite肠道固氮菌及其代谢产物可能直接作为Termite生长的氮源， 这使Termite得以利用含氮极低的木质食物为生。固氮作用是Termite生命活动必不可少的，可以通过破坏Termite的固氮系统，使Termite氮素营养不良而死亡，这不失为是一种值得探索的防治白蚁方法与途径。目前，对于Termite氮营养方面，还有许多重要问题仍需作进一步研究，这不仅具有理论意义，而且也有一定的应用意义。
发明内容
本发明提供了一株变栖克雷伯氏菌菌株。本发明变栖克雷伯氏菌菌株为变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola) HUB-IV-005，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2011年9月15日，保藏编号为CCTCC No =M 2011313 ；本发明变栖克雷伯氏菌 HUB-IV-005为革兰氏阴性菌，呈短杆状，菌体大小为(2. 0 μ m-2. 3 μ m) X (1. 6 μ m_l. 8 μ m)， 无芽孢，荚膜染色呈阳性；在富集培养基(无氮培养基)上菌落呈乳白色，圆形，半透明，边缘整齐，表面湿润不易挑取(如图1)；培养5d后有褐色色素产生。本发明变栖克雷伯氏菌HUB-IV-005淀粉水解试验呈阳性，脂肪水解试验呈阴性， 明胶水解试验呈阴性，半固体穿刺呈阴性，H2S试验呈阴性，尿素试验呈阳性，吲哚试验呈阴性，甲基红试验呈阴性，伏普试验呈阳性，柠檬酸盐试验呈阳性，尿酶试验呈阳性；分解蔗糖产酸产气，分解麦芽糖产酸产气，分解D-山梨醇产酸产气，分解鼠李糖产酸产气，分解甘露醇产酸产气，分解乳糖产酸产气，分解海藻糖产酸产气。变栖克雷伯氏菌HUB-IV-005最适生长温度为37°C，最适生长环境的pH为7. 0 士0. 2。本发明变栖克雷伯氏菌(Klebsiellavariicola)HUB-IV-005 通过 16S rDNA序列比对分析，与变栖克雷伯氏菌At-22 (Klebsiella variicola At-22)菌株的亲缘关系最近， 相似性达99 %。通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定变栖克雷伯氏菌 HUB-IV-005属于克雷伯菌属(Klebsiella)，为变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola) 的一株新菌株。本发明变栖克雷伯氏菌HUB-IV-005为从白蚁肠道内筛选得到的固氮菌，可作为指示菌，用于研究树木内生菌发酵产物对白蚁肠道固氮菌的抑制作用，对于白蚁肠道固氮菌有抑制作用的树木内生菌发酵产物可以有效的杀灭白蚁。本发明变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)HUB-IV_005属于克雷伯菌属 (Klebsiella)，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2011年9月15日，保藏编号为CCTCC No =M 2011313。
图1为本发明变栖克雷伯氏菌HUB-IV-005的菌落形态图；图2为具体实施方式
二中PCR扩增产物的电泳图，其中M表示Marker ；图3为通过变栖克雷伯氏菌HUB-IV-005和相近菌株的16S rDNA序列进行同源性比对构建的系统进化树。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式变栖克雷伯氏菌菌株为变栖克雷伯氏菌 (Klebsiella variicola)HUB-IV-005，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2011年9月15日，保藏编号为CCTCC No =M 2011313。本实施方式变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)HUB-IV-005为革兰氏阴性菌，呈短杆状，菌体大小为(2. 0 μ m-2. 3 μ m) X (1. 6 μ m-1. 8 μ m)，无芽孢，荚膜染色呈阳性； 在富集培养基(无氮培养基)上菌落呈乳白色，圆形，半透明，边缘整齐，表面湿润不易挑取；培养5d后有褐色色素产生。所述富集培养基(无氮培养基)由15g蔗糖、0. 8g ΚΗ2Ρ04、0· 2g MgS04、0· 2g NaCl、 Ig CaCO3、ImL质量百分比浓度为10%的Na2MO4溶液、ImL H3BO3溶液、ImL MnSO4溶液、ImL Fe2SO4 溶液和 IOOOmL H2O 组成，调 pH 至 6. 5-7. 0，于 121°C灭菌 30min。参照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第八版)和《常见细菌系统鉴定手册》对变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)HUB-IV-005进行生理生化鉴定变栖克雷伯氏菌 HUB-IV-005淀粉水解试验呈阳性，脂肪水解试验呈阴性，明胶水解试验呈阴性，半固体穿刺呈阴性，吐3试验呈阴性，尿素试验呈阳性，吲哚试验呈阴性，甲基红试验呈阴性，伏普试验呈阳性，柠檬酸盐试验呈阳性，尿酶试验呈阳性；分解蔗糖产酸产气，分解麦芽糖产酸产气， 分解D-山梨醇产酸产气，分解鼠李糖产酸产气，分解甘露醇产酸产气，分解乳糖产酸产气， 分解海藻糖产酸产气。变栖克雷伯氏菌HUB-IV-005的最适生长温度为37°C，最适生长环境的 PH 为 7. 0 士 0. 2。
具体实施方式
二本实施方式变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola) HUB-IV-005从白蚁肠道内筛选得到。筛选按以下步骤进行一、制备白蚁勻浆蚁巢中收集10只健康的白蚁，用体积浓度为75%的乙醇对白蚁消毒3 ％iin，再用无菌水冲洗3次后，然后切去头胸部，将腹部置于已灭菌的培养皿中；之后，在无菌条件下将10只白蚁的腹部转入已灭菌的装有0. lmmol/L pH 7. 0的磷酸盐缓冲液的研钵中，研磨成勻浆，加入IOmL 无菌水稀释成混浊液，即为白蚁勻浆；同时，将消过毒的白蚁腹部于计数培养基平板上滚动擦拭，放入培养箱培养，以检验白蚁表面消毒是否彻底；二、富集培养用灭菌的移液枪吸取ImL白蚁勻浆装入盛有30mL富集培养基(无氮培养基)的250mL的三角瓶中，于IOOr/min、3(TC培养3 5d，得富集培养后的培养液；三、平板分离单菌落将富集培养后的培养液梯度稀释至10-2,10-3,10-\10-5,10-6,10-7和10_8，用移液枪各取0. ImL培养液，无菌操作涂布于平板培养基上，30°C下倒置培养Mh。挑取生长较大及不同形态菌落纯化6次以上， 镜检，将纯化的单菌落转至斜面培养基，4°C冰箱保存，即得到变栖克雷伯氏菌HUB-IV-005。 每次试验重复三次(n = 3)。本实施方式所述富集培养基(无氮培养基)由15g蔗糖、0. 8g KH2P04、0. 2g MgSO4, 0. 2gNaCl、Ig CaCO3> ImL 质量百分比浓度为 10% 的 Na2MO4 溶液、ImL H3BO3 溶液、ImL MnSO4 溶液、ImL Fe2SO4溶液和IOOOmL H2O组成，调pH至6. 5 7. 0，于121°C灭菌30min。平板培养基的制备过程为在富集培养基中加入2%琼脂，灭菌后，倒入无菌培养皿中制成平板培养基。斜面培养基的制备过程为在富集培养基中加入2%琼脂，灭菌后，加入试管中制成斜面培养基。本实施方式所述白蚁为黑翅土白蚁(Odontotermes formosanus)，取自中国武汉珞珈山大白蚁亚科的高等培菌白蚁。对筛选得到的变栖克雷伯氏菌HUB-IV-005进行分子鉴定，按以下步骤进行一、 提取菌株的总DNA，以细菌16S rDNA通用引物对所获得的DNA进行PCR扩增后，用1 %琼脂糖凝胶电泳(如图2)。结果可以看出，在1600bp左右出现特异条带，条带清晰、完整， 无DNA、RNA等污染，此片段与预计的片段条带大小基本吻合。二、将阳性克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司测序，变栖克雷伯氏菌HUB-IV-005的16SrDNA序列长度为1579bp，序列如SEQ ID N0:1所示。将变栖克雷伯氏菌HUB-IV-005的16S rDNA基因序列与GenBank 数据库中已知细菌16S rDNA基因序列进行比对，然后利用MEGA4. 1和ClustalX软件绘制系统进化树，如图3所示，分析结果表明变栖克雷伯氏菌HUB-IV-005与变栖克雷伯氏菌 At-22 (Klebsiella variicola At-22)菌株的亲缘关系最近，相似性达99%。通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定变栖克雷伯氏菌HUB-IV-005属于克雷伯菌属(Klebsiella)，为变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)的一株新菌株。白蚁属于典型的寡氮营养型生物，主要以富含纤维素、半纤维素和木质素等木质材料为食，此类食物的含氮量都不高，但白蚁组织的含氮量与其他动物相似，因此白蚁具有从空气中固定N2并转化为氨的能力。固氮作用是仅限于原核生物才有的现象，白蚁生活所必须的氮主要来自其肠道共生固氮微生物的固氮作用，且白蚁固氮活性的高低与白蚁肠道内共生微生物的种类和组成有关。白蚁肠道中微生物对其营养具有重要作用，固氮菌及其代谢产物可能直接作为白蚁生长的氮源，这使白蚁得以利用含氮极低的木质食物为生。目前，对于白蚁氮营养方面，还有许多重要问题仍需作进一步研究，这不仅具有理论意义，而且也有一定的应用意义。如果固氮作用是白蚁生命活动必不可少的，那么就有可能通过破坏白蚁的固氮系统，使白蚁氮素营养不良而死亡，这不失为是一种值得探索的防治白蚁方法与途径。本实施方式的变栖克雷伯氏菌HUB-IV-005可作为指示菌，用于研究树木内生菌发酵产物对白蚁肠道固氮菌的抑制作用，对于白蚁肠道固氮菌有抑制作用的树木内生菌发酵产物可以有效的杀灭白蚁。本试验以变栖克雷伯氏菌HUB-IV-005为指示菌，以树木内生菌枯草芽孢杆菌新亚禾中(Bacillus subtilis subsp. Iawsoniana subsp. nov)HUB-I_004、枯草芽孢杆菌新亚种(Bacillus subtilis subsp. virginiana subsp. nov)HUB-I-047 和罗森桧沙雷氏菌 (Serratia lawsoniana sp. nov)HUB-I-107为功能菌，进行抑菌试验。枯草芽孢杆菌新亚种(Bacillus subtilis subsp. lawsoniana subsp. nov)HUB-I-004 保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2009年7月22日，保藏编号为 CCTCC No :M 209161 ；枯草芽孢杆菌新亚种(Bacillus subtilis subsp. virginiana subsp. nov) HUB-I-047保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2009年7月22日，保藏编号为CCTCC No =M 209162 ；罗森桧沙雷氏菌 (Serratia lawsoniana sp. nov)HUB-I_107保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2009年7月22日，保藏编号为CCTCC No :M209163。试验结果如表1所示。可以看出，树木内生菌的发酵产物对白蚁肠道固氮菌-变栖克雷伯氏菌HUB-IV-005具有较好的抑制作用。表1树木内生菌发酵液对变栖克雷伯氏菌HUB-IV-005的抑菌圈大小(mm)
权利要求
1. 一株变栖克雷伯氏菌菌株，其特征在于变栖克雷伯氏菌菌株为变栖克雷伯氏菌 (Klebsiella variicola)HUB-IV-005，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2011年9月15日，保藏编号为CCTCC No =M 2011313。
全文摘要
一株变栖克雷伯氏菌菌株，涉及一株变栖克雷伯氏菌菌株。本发明提供了一株变栖克雷伯氏菌菌株。本发明变栖克雷伯氏菌菌株为变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)HUB-IV-005，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2011年9月15日，保藏编号为CCTCC NoM 2011313。本发明变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)HUB-IV-005为从白蚁肠道内筛选得到的固氮菌，可作为指示菌，用于研究树木内生菌发酵产物对白蚁肠道固氮菌的抑制作用，对于白蚁肠道固氮菌有抑制作用的树木内生菌发酵产物可以有效的杀灭白蚁。
文档编号C12R1/22GK102344898SQ20111031887
公开日2012年2月8日 申请日期2011年10月19日 优先权日2011年10月19日
发明者夏昕, 孙立庆, 常志威, 张小燕, 赵凯, 郝妍 申请人:黑龙江大学