专利名称：一种高密度高产脂率培养产油微藻的方法
技术领域：
本发明属于单细胞油脂及生物柴油生产技术领域，特别涉及一种同步式提高产油微藻的生物量和产脂量的方法。
背景技术：
产油微藻资源丰富，能在多种培养条件下生长，光合作用效率高，生物量高，生长繁殖快，生长周期短，自身合成油脂的能力强，因而被许多学者认为是制备单细胞油脂及生物柴油的最佳原料之一。微藻油脂通过与低碳醇进行转酯化反应可生产生物柴油，利用微藻生产生物柴油，对缓解人类面临的能源短缺和环境污染有着巨大的潜力，同时对减少生产生活中对化石能源的依赖、保证国家能源安全具有深远意义。微藻油脂通过与多碳醇进行酯交换反应，可用于生产可生物降解的润滑油、溶剂油、油漆和油墨溶剂、表面活性剂、粘接剂等产品，高值化潜力大。部分微藻油脂含有多不饱和脂肪酸，是生产具有高附加值单细胞油脂的重要原料。然而利用微藻生产单细胞油脂及生物柴油存在一个较大的问题就是在培养过程中，藻细胞生长与产脂不同步。藻体增殖与油脂合成间存在着竞争关系，一般产脂微藻在正常的生长环境条件下，细胞内累积较少的脂类。在不利于生长繁殖的环境条件下，才进入产油模式，细胞内累积较多的脂类和其他抗逆活性物质，以维持种群生存。为了解决这些问题，实现藻细胞生长模式与产油模式的可控调变，已经使用了养料分批供应培养技术或更换培养基组合物的方法。然而，这些技术和方法仍有局限性，控制错综复杂的营养供应非常麻烦而且容易出错
发明内容
本发明目的在于提供一种操作简单的同步式提高产油微藻生物量和产脂量的方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为取对数生长期的产油微藻，培养至添加有碳源和/或氮源的无菌添加液的液体培养基中，在温度为18-35°C，转速为100-200rpm，光照强度为0-150μπιΟ1 πΓΥ1连续光照的摇床中振荡培养6-40天，直至藻液中其他营养元素如磷、硫、镁等耗尽(取培养液采用离子色谱法测定营养元素残留量)，培养结束；其中，添加有碳源和/或氮源的添加液的液体培养基中培养过程中再次添加无菌添加液。所述再次添加无菌添加液时添加碳源和氮源的添加液或碳源添加液两种模式，两种添加模式交替进行，直至培养至再添加碳、氮源对提高生物量和产脂量效果已不明显时结束添加。所述每种添加模式的间隔为2-5天。所述碳源为无机碳源和或有机碳源；所述无机碳源为二氧化碳、碳酸盐和/或碳酸氢盐；有机碳源为葡萄糖、蔗糖、果糖、甘油、乙醇和/或醋酸盐。所述氮源为无机氮源和/或有机氮源；其中无机氮源为硝酸盐、铵盐和/或氨水；机氮源为尿素、酵母粉和/或蛋白胨。所述产油微藻为脂含量达到细胞干重8%以上的可培养微藻株系。本发明原理是藻体增殖与油脂合成间存在着竞争关系，一般产脂微藻是在生长培养基中氮素耗尽并且有过量碳素用于脂类合成时，才能在细胞内累积较多的脂类。需要在适当的生长期切断营养物质氮的供应，这样就能控制藻类进入产油模式。不过，这也同时减缓了藻细胞的生长，甚至导致死亡，需要在适当的产脂期恢复营业物质氮的供应，只要找准这个量，控制藻株处于间歇式氮缺乏和持续碳素供应状态，就可实现产油微藻的生长与产脂同步进行。本发明所具有的优点本发明将产油微藻的生长过程和产脂过程通过交替、循环的控制模式进行技术集成，既能提高藻细胞浓度，同时又能高效产脂，与现有技术相比，本发明提供的方法操作简单可行，无需更换培养基组合物，无需全营养养料分批供应，无需实时计算调整养料流加速率,添加液成本低廉制备简单,从而大大地降低了生产成本。
图1是本发明实施例所提供的本发明技术方案流程示意图。本发明目的、功能及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施例方式
如图1所示，本发明实施例提供的技术方案流程示意图。具体而言，本发明提供了一种培养产油微藻的方法，其特征在于以简单易操作的流程实现同步式提高产油微藻生物量和产脂量，包括以下步骤(I)选取合适的碳源和氮源，分别制成添加液，高压蒸汽灭菌或过滤灭菌；碳源既包括无机碳源如二氧化碳、碳酸盐和/或碳酸氢盐，也包括有机碳源如葡萄糖、蔗糖、果糖、甘油、乙醇和/或醋酸盐。氮源既包括无机氮源如硝酸盐、铵盐和/或氨水，也包括有机氮源如尿素、酵母粉和/或蛋白胨。(2)取产油微藻在液体培养基中培养，通过向藻液中加入步骤(I)所述的碳添加液和氮添加液，控制藻细胞进入生长模式；通过向藻液中加入步骤(I)所述的碳添加液，控制藻细胞进入产油模式；所述的向藻液中加入碳、氮添加液，添加方式是一次性添加；添加间隔以2-5天为宜，添加量以加入的碳源和氮源在添加间隔期间能够被藻细胞完全消耗为宜，添加次数以藻细胞的碳、氮实际总需量除以每次的添加量换算而得。(3)步骤(2)所述的两种添加模式交替进行，直至藻液中其他营养元素如磷、硫、镁等耗尽，培养结束，采收藻细胞破壁提脂。此时可同时获得最大生物量和最大产脂量。所述的至藻液中其他营养元素如磷、硫、镁等耗尽时培养结束，是指再添加碳、氮源对提高生物量和产脂量效果已不明显，在藻细胞密度达到最高且培养液内外加碳源被完全消耗时结束培养。实施例1(I)选取葡萄糖作为碳源，硝酸钾作为氮源，配制成高浓度的无菌添加液。(2)取产油微藻小球藻(Chlorella kessleri)在液体培养基中暗异养培养，培养基为Kuhl培养基,配方10g/L葡萄糖、lg/L硝酸钾、89mg/L十二水磷酸氢二钠、621mg/L 二水磷酸二氢钠、246mg/L七水硫酸镁、9. 3mg/L EDTA、6. 9mg/L七水硫酸亚铁、14. 7mg/L 二水氯化钙、O. 29mg/L七水硫酸锌、O. 17mg/L 一水硫酸锰、O. 06mg/L硼酸、O. 002mg/L五水硫酸铜、O. 012mg/L四水钥酸铵，pH 6. 5。藻种按10% (体积比)接种量，接种到含IOOml无菌Kuhl培养基的250ml三角瓶中，在温度为25 □ C，连续黑暗，转速为150rpm的摇床中振荡培养。(3)培养4天后，在无菌条件下，向培养液内加入葡萄糖至终浓度20g/L，继续培养5天后，向培养液内加入葡萄糖至终浓度20g/L，硝酸钾至终浓度为lg/L，再继续培养5天后，培养结束，取样测定生物量和产脂量。生物量采用干重法测定(取5ml藻悬液于室温3000rpm离心5min,弃去上清液。藻细胞沉淀用蒸懼水洗2次,然后过滤到Whatman GF/C滤纸上，置80°C烘箱内烘至恒重后称重)，测得生物量浓度高达18g/L ;脂含量通过气相色谱(GC)测定(色谱条件为DB-23毛细管气相色谱柱30mX0. 25mmX0. 25 μ m ;氮气为载气；采用分流模式，进样体积为I μ I ;进样口温度为250°C ；FID检测器温度为260°C ;柱温箱的温度为以2. 50C /min的升温速率从140°C升至240°C )，测定脂含量高达细胞干重的48%。实施例2(I)选取葡萄糖作为碳源，硝酸钾作为氮源，配制成高浓度的无菌添加液。(2)取产油微藻小球藻(Chlorella kessleri)在液体培养基中光异养培养，培养基为Kuhl培养基,配方10g/L葡萄糖、lg/L硝酸钾、89mg/L十二水磷酸氢二钠、621mg/L 二水磷酸二氢钠、246mg/L七水硫酸镁、9. 3mg/L EDTA、6. 9mg/L七水硫酸亚铁、14. 7mg/L 二水氯化钙、O. 29mg/L七水硫酸锌、O. 17mg/L 一水硫酸锰、O. 06mg/L硼酸、O. 002mg/L五水硫酸铜、O. 012mg/L四水钥酸铵，pH 6. 5。藻种按10%接种量，接种到含IOOml无菌Kuhl培养基的250ml三角瓶中，在温度为25 □ C,转速为150rpm,光照强度为100 μ mo I m_2s_1连续光照的摇床中振荡培养。(3)培养2天后 ，在无菌条件下，向培养液内加入葡萄糖至终浓度10g/L，继续培养2天后，向培养液内加入葡萄糖至终浓度10g/L，硝酸钾至终浓度为O. 5g/L，再继续培养3天后，向培养液内加入葡萄糖至终浓度10g/L，继续培养3天后，向培养液内加入葡萄糖至终浓度10g/L，硝酸钾至终浓度为0. 5g/L，继续培养4天后，培养结束，取样测定生物量和产脂量。生物量采用干重法测定(取5ml藻悬液于室温3000rpm离心5min,弃去上清液。藻细胞沉淀用蒸懼水洗2次,然后过滤到Whatman GF/C滤纸上,置80°C烘箱内烘至恒重后称重)，测得生物量浓度高达19g/L ;脂含量通过气相色谱(GC)测定(色谱条件为DB-23毛细管气相色谱柱30mX0. 25mmX0. 25 μ m ;氮气为载气；采用分流模式，进样体积为I μ I ;进样口温度为250°C ;FID检测器温度为260°C ;柱温箱的温度为以2. 5°C /min的升温速率从140°C升至240°C )，测定脂含量高达细胞干重的47%。实施例3(I)选取蔗糖作为碳源，尿素作为氮源，配制成高浓度的无菌添加液。(2)取产油微藻小球藻(Chlorella zofingiensis)在液体培养基中光异养培养，培养基为Kuhl培养基,配方10g/L鹿糖、0. 3g/L尿素、89mg/L十二水磷酸氢二钠、621mg/L二水磷酸二氢钠、246mg/L七水硫酸镁、9. 3mg/L EDTA、6. 9mg/L七水硫酸亚铁、14. 7mg/L 二水氯化钙、0. 29mg/L七水硫酸锌、0. 17mg/L 一水硫酸锰、0. 06mg/L硼酸、0. 002mg/L五水硫酸铜、0. 012mg/L四水钥酸铵，pH 6. 5。藻种按10%接种量，接种到含IOOml无菌Kuhl培养基的250ml三角瓶中，在温度为25°C，转速为150rpm，光照强度为IOOymol πΓΥ1连续光照的摇床中振荡培养。(3)培养4天后，在无菌条件下，向培养液内加入蔗糖至终浓度10g/L，继续培养4天后，向培养液内加入蔗糖至终浓度10g/L，尿素至终浓度为O. 3g/L，再继续培养4天后，培养结束，取样测定生物量和产脂量。生物量采用干重法测定(取5ml藻悬液于室温3000rpm离心5min,弃去上清液。藻细胞沉淀用蒸懼水洗2次,然后过滤到Whatman GF/C滤纸上,置80°C烘箱内烘至恒重后称重)，测得生物量浓度高达15g/L;脂含量通过气相色谱(GC)测定(色谱条件为DB-23毛细管气相色谱柱30mX0. 25mmX0. 25 μ m;氮气为载气；采用分流模式，进样体积为1μ I ;进样口温度为250°C ;FID检测器温度为260°C ;柱温箱的温度为以2. 50C /min的升温速率从140°C升至240°C )，测定脂含量高达细胞干重的47%。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式
，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或 改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种高密度高产脂率培养产油微藻的方法，其特征在于取对数生长期的产油微藻，培养至添加有碳源和/或氮源的无菌添加液的液体培养基中，在温度为18-35°C，转速为100-200rpm,光照强度为0-150 u mo I m_2s_1连续光照的摇床中振荡培养6_40天。
其中，添加有碳源和/或氮源的添加液的液体培养基中培养过程中再次添加无菌添加液。
2.按权利要求1所述的高密度高产脂率培养产油微藻的方法，其特征在于所述再次添加无菌添加液时添加碳源和氮源的添加液或碳源添加液两种模式，两种添加模式交替进行。
3.按权利要求2所述的高密度高产脂率培养产油微藻的方法，其特征在于所述每种添加模式的间隔为2-5天。
4.按权利要求1所述的高密度高产脂率培养产油微藻的方法，其特征在于所述碳源为无机碳源和或有机碳源；所述无机碳源为二氧化碳、碳酸盐和/或碳酸氢盐；有机碳源为葡萄糖、蔗糖、果糖、甘油、乙醇和/或醋酸盐。
5.按权利要求1所述的高密度高产脂率培养产油微藻的方法，其特征在于所述氮源为无机氮源和/或有机氮源；其中无机氮源为硝酸盐、铵盐和/或氨水；机氮源为尿素、酵母粉和/或蛋白胨。
全文摘要
本发明属于单细胞油脂及生物柴油生产技术领域，特别涉及一种同步式提高产油微藻的生物量和产脂量的方法。取对数生长期的产油微藻，培养至添加有碳源和/或氮源的无菌添加液的液体培养基中，在温度为18-35℃，转速为100-200rpm，光照强度为0-150μmol m-2s-1连续光照的摇床中振荡培养6-40天。其中，添加有碳源和/或氮源的添加液的液体培养基中培养过程中再次添加无菌添加液。本发明将产油微藻的生长过程和产脂过程通过交替、循环的控制模式进行技术集成，既能提高藻细胞浓度，同时又能高效产脂，一举两得。无需更换培养基组合物，无需全营养养料分批供应，无需实时计算调整养料流加速率，不但操作简单，而且大大地降低了生产成本。
文档编号C12R1/89GK103045478SQ20111031877
公开日2013年4月17日 申请日期2011年10月14日 优先权日2011年10月14日
发明者王艳, 秦松 申请人:中国科学院烟台海岸带研究所