专利名称：Hpv融合蛋白、基因、载体、菌株、制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域。具体地，本发明涉及一种人乳头瘤病毒(HPV) 16 型L2E7融合蛋白、其编码基因、质粒载体、表达菌株、制备方法及其免疫预防和治疗用途。
背景技术：
世界卫生组织统计资料表明，子宫颈癌在全球妇女癌症死亡率中排列第二，在一 些发展中国家甚至居首位。每年大约有50万新发宫颈癌病例，约20万人死于宫颈癌[1—3]， 其中80%在发展中国家。我国是宫颈癌高发国之一，据不完全统计我国宫颈癌年发病率约 13.8万人，每年死于宫颈癌的患者约5万人。已有研究资料证明高危人乳头瘤病毒(HPV) 感染和子宫颈癌发生密切相关，90%以上的宫颈癌以及癌前病变，鳞状上皮病变组织中可 检测到HPV DNA，是宫颈癌的重要致病因子。由于刚在美国上市的HPV预防性疫苗价格昂贵 及伦理问题，目前临床仍无广泛预防HPV感染的措施，而现行的早期宫颈粘膜涂片筛查可 实现宫颈癌的早期发现，能降低癌症死亡率，但并不能消除HPV感染，且费用高，在不发达 国家难以普及。此外，目前对中晚期宫颈癌的化疗和手术治疗效果仍不理想，复发率较高且 花费较大。因此，研制特异性的免疫治疗方法即疫苗接种的办法预防和治疗HPV的慢性感 染及其所引起的癌前病变成恶性病变是迫在眉睫的任务，如果研究成功其将成为预防和治 疗宫颈癌的重要手段，尤其在发展中国家应更不失为一条经济有效的途径。
由于HPV在体外难于培养和其致癌性，完整的病毒颗粒不大可能发展为疫苗，只 能研制基因工程疫苗。近十几年来，HPV疫苗研究可以分为两种类型预防性疫苗和治疗性 疫苗。预防性疫苗一般以HPV16主要衣壳蛋白Ll和次要衣壳蛋白L2为靶抗原作用在于诱 发机体产生特异性的中和抗体和有效的局部免疫反应以阻止建立HPV的长期感染和再感 染。HPV的衣壳蛋白在真核以及原核表达系统中表达时，能自我装配或体外包装折叠成病毒 样颗粒(VLP)，其结构和抗原表位与天然的病毒颗粒十分相似「4—9]。 VLP能与细胞受体结合 进入细胞，这样有利于抗原的加工呈递，诱发强的细胞免疫。治疗性疫苗通常是以经修饰后 去除其转化活性但仍保留其抗原性的HPV16早期蛋白作为靶抗原，诱导特异性的细胞免疫 反应用于控制或消除感染HPV的良性和恶性病灶，可作为该类疾病的手术后辅助治疗。在 大多数HPV16相关宫颈癌及其癌前病变中，HPV16的E6和E7蛋白是持续表达的，而这种持 续表达是肿瘤细胞转化和维持恶性特征所必需的，宫颈癌细胞不可能通过抗原丢失来逃避 免疫监视，并且正常组织中不存在这两种蛋白，因此E6和E7蛋白成为HPV16相关宫颈癌及 癌前病变治疗性疫苗的理想靶抗原。中晚期癌症病人手术后残留的肿瘤细胞可采用这种治 疗性疫苗接种，激发细胞免疫来杀伤清除这些肿瘤细胞和已感染的上皮细胞，从而防止或 限制肿瘤的复发和扩散。预防性和治疗性这两类疫苗划分不是绝对的，如在良性疣和轻度 CIN病变中存在HPV晚期蛋白的表达，预防性疫苗对这些疾病也有一定治疗作用，近年研制 的一些疫苗，如嵌合性疫苗、HPV假病毒疫苗等同时具备预防和治疗双重作。有些研究是将 HPV衣壳蛋白与早期蛋白融合在一起，目的是为了同时提供预防和治疗两种效果。
近几年大量的研究资料表明[9]， L2次要晚期蛋白能诱发中和抗体，而且具有一定的交叉保护活性。
发明内容
下面详细讨论本发明各种技术方案的制备和使用，但应该理解，本发明提供了许 多适用的发明构思，其可以体现在各种各样的具体方面上。 为有助于理解本发明，下面定义了一些术语。本文定义的术语具有本发明相关领 域的普通技术人员通常理解的含义。术语可用于说明的具体实例的一般类别，但它们的使 用不限制本发明，权利要求中所概括的除外。 除非另外指出，本文所述的"HPV"是指人乳头瘤病毒(H咖anpapillomavirus);
除非另外指出，本文所述的"bp"是指碱基对(base pair); 除非另外指出，本文所述的"ELISPOT"是指酶联免疫斑点(Enzyme-linked imm皿ospot); 除非另外指出，本文所述的"IPTG"是指异丙基硫代-13 -D半乳糖苷(Isopropylt hio_0 _D_galactoside); 除非另外指出，本文所述的"SDS-PAGE"是指十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis);
除非另外指出，本文所述的"HRP"是指辣根过氧化物酶 (Horseradishperoxidase); 除非另外指出，本文所述的"IFN-Y "是指Y-干扰素(Interfern gamma);
除非另外指出，本文所述的"PBS"是指磷酸盐缓冲液(Phosphate bufferedsaline) 5 本发明旨在提供一种能简单、经济、有效的制备人类乳头瘤病毒HPV16L2E7融合 蛋白的优化基因核苷酸序列，该优化基因能在大肠杆菌中获得大量表达，表达蛋白能用于 HPV16感染和相关宫颈癌的预防和治疗。 具体地，本发明的一个目的在于，提供一种人乳头瘤病毒(HPV) 16型L2E7融合蛋 白。本发明的另一个目的在于，提供一种用于前述的人乳头瘤病毒(HPV) 16型L2E7融合蛋 白的DNA序列。本发明的另一个目的在于，提供一种大肠杆菌表达质粒载体。本发明的另 一个目的在于，提供一种用于生产前述的人乳头瘤病毒(HPV) 16型L2E7融合蛋白的大肠杆 菌菌株。本发明的另一个目的在于，提供一种制备前述的人乳头瘤病毒(HPV) 16型L2E7融 合蛋白的方法。 针对上述发明目的，本发明提供以下技术方案 —方面，本发明提供一种人乳头瘤病毒(HPV)16型L2和E7的融合蛋白，所述融合 蛋白的氨基酸序列为SQE ID N0.2所示的序列。 另一方面，本发明提供一种用于前述的人乳头瘤病毒(HPV)16型L2E7融合蛋白的 DNA序列，所述DNA序列的核苷酸序列为SQE ID NO. 1所示的序列。 再一方面，本发明提供一种大肠杆菌表达质粒载体，所述的质粒载体是由前述的 HPV16的L2和E7基因片段插入至质粒pET9a的Ndel和BamHI位点之间来构建的。
优选地，前述大肠杆菌表达质粒载体中，所述的大肠杆菌是BL21 (DE3)。
又一方面，本发明提供一种用于生产前述的人乳头瘤病毒(HPV) 16型的L2E7融合
4蛋白的大肠杆菌菌株，所述大肠杆菌菌株含有前述的质粒载体。
优选地，前述的大肠杆菌菌株为BL21 (DE3)。 还一方面，本发明提供一种制备前述的人乳头瘤病毒(HPV) 16型L2E7融合蛋白的 方法，所述方法包括以下步骤 1)将前述的HPV16L2E7基因片段插入大肠杆菌表达载体pET9a的Ndel和BamHI 位点，将该质粒转化大肠杆菌获得含有pET9al6L2E7的菌株，接种培养，IPTG诱导表达；
2)表达菌体经离心裂解后，收获包涵体，用6M尿素悬起，离心，取上清用CM柱纯化 表达蛋白。 优选地，在本发明制备前述的人乳头瘤病毒(HPV) 16型L2E7融合蛋白的方法中， 所述的大肠杆菌是BL21。 另一方面，本发明提供一种制备用于治疗人乳头瘤病毒16型感染及其相关疾病 (如宫颈癌)药物的方法，所述方法包括，将含有pET9al6L2E7的大肠杆菌菌株用于中试发 酵生产L2E7融合蛋白。 另一方面，本发明提供前述的人乳头瘤病毒(HPV) 16型L2E7融合蛋白、前述的人 乳头瘤病毒(HPV) 16型L2E7融合蛋白的DNA序列、前述的大肠杆菌表达质粒载体或前述的 大肠杆菌菌株在制备用于治疗人乳头瘤病毒16型感染及其相关疾病(如宫颈癌)的药物 中的应用。优选地，所述的药物为疫苗；最优选地，所述的疫苗具备预防和治疗双重作用。
下面根据本发明的一个优选的实施方式，结合说明书附图对本发明的技术方案进 行进一步的详细说明 本实验采用基因工程技术，首先将分离测序获得的HPV16早期蛋白E7与晚期蛋 白L2的多肽序列融合，根据大肠杆菌优势密码子及mRNA的二级结构综合分析，设计出编码 HPV16L2E7融合蛋白多肽的核苷酸序列，经公司合成后，将其插入原核表达载体pET9a，改 造基因获得高效表达，表达水平占全菌的50%，表达蛋白经纯化后免疫小鼠，用动物免疫实 验评价合成基因表达蛋白的免疫原性。 本发明根据优化密码子的基因序列来生产乳头瘤病毒16型L2E7融合蛋白的方法 包括以下步骤 将设计的密码子优化HPV16L2E7基因片段插入大肠杆菌表达载体pET9a的Ndel 和BamHI位点，将该质粒转化大肠杆菌获得含有pET9al6L2E7的菌株，接种培养，IPTG诱导 表达； 表达菌体经离心裂解后，收获包涵体，用6M尿素悬起，离心，取上清用CM柱纯化表 达蛋白。 优选地，在本发明生产HPV16L2E7融合蛋白的方法中，所述的大肠杆菌是 BL21(DE3) (BL21(DE3)是常用的大肠杆菌表达菌株， 一般配合以强表达载体来进行目的基 因的强表达)。 本发明的含有重组质粒pET9al6L2E7的大肠杆菌菌株能用于中试发酵生产L2E7 融合蛋白，研制治疗人乳头瘤病毒16型感染和与此感染相关的疾病(如宫颈癌)药物。
众所周知，同一种氨基酸有几组密码子，生物学上将几组密码子代表一种氨基酸 的现象称为密码子的简并性，而简并性主要是由于密码子的第三个碱基发生摆动现象形成 的，也就是说密码子的专一性主要由前两个碱基决定，即使第三个碱基发生突变也能翻译出正确的氨基酸，这对于保证物种的稳定性有一定意义；例如GCU， GCC， GCA， GCG均代表丙氨酸。除色氨酸和甲硫氨酸外，其他氨基酸的密码子均多于l个(2 6个)。简并性并不意味着密码不完善，每个密码子只对应1种氨基酸。简并性可使突变的有害影响减到最小。大部分密码子具有简并性，即两个或者多个密码子编码同一氨基酸。简并的密码子通常只有第三位碱基不同，例如，GAA和GAG都编码谷氨酰胺。如果不管密码子的第三位为哪种核苷酸，都编码同一种氨基酸，则称之为四重简并；如果第三位有四种可能的核苷酸之中的两种，而且编码同一种氨基酸，则称之为二重简并， 一般第三位上两种等价的核苷酸同为嘌呤(A/G)或者嘧啶(C/T)。只有两种氨基酸仅由一个密码子编码，一个是甲硫氨酸，由AUG编码，同时也是起始密码子；另一个是色氨酸，由UGG编码。遗传密码的这些性质可使基因更加耐受点突变。例如，四重简并密码子可以容忍密码子第三位的任何变异；二重简并密码子使三分之一可能的第三位的变异不影响蛋白质序列。由于转换变异(嘌呤变为嘌呤或者嘧啶变为嘧啶)比颠换变异(嘌呤变为嘧啶或者嘧啶变为嘌呤)的可能性更大，因此二重简并密码子也具有很强的对抗突变的能力。遗传学上将基因的这种不影响氨基酸序列的突变称为沉默突变。然而，在特定的表达菌株中，在不改变蛋白的氨基酸序列的前提下，使用不同的密码子对编码蛋白的产量有着非常显著的影响。因此，从多种密码子中选择特定的密码子以获得较高蛋白产量称为"密码子优化"。对于分子量较大，即组成的氨基酸数目较多的蛋白而言，寻找及确定密码子优化的核苷酸序列是具有相当难度的。
本发明人选择将分离的HPV16早期蛋白E7与晚期蛋白L2的多肽序列融合，根据大肠杆菌优势密码子，设计出编码HPV16L2E7融合蛋白的核苷酸序列，并根据设计序列合成后，将其插入原核表达载体pET9a，改造基因获得高效表达，表达水平占全菌的约50 % ，并进行了该蛋白的纯化，免疫动物后，结果表明该蛋白具有较好的免疫源性，同未经优化基因表达的L2E7融合蛋白具有相同的免疫原性，经ELISP0T检测免疫后的小鼠可产生针对HPV16E749—57CTL表位肽特异性的T细胞免疫反应，且能够保护部分C57BL/C小鼠抵抗TC-1肿瘤细胞的攻击，成瘤时间明显推迟。本发明可用于研发预防和治疗性宫颈癌疫苗。
与现有技术相比，本发明具有如下的明显优点 使用本发明的优化基因能够获得高效表达，表达水平占全菌的50%，表达蛋白经纯化后免疫小鼠，实验结果表明该蛋白与未经优化基因表达的蛋白具有相同的免疫原性，可产生针对HPV16E749—57CTL表位肽特异性的T细胞免疫反应，肿瘤生长抑制动物实验表明蛋白免疫对肿瘤的生长有明显抑制作用，其中90%小鼠肿瘤细胞生长完全抑制。该优化基因建立的L2E7融合蛋白原核高效表达系统能用于HPV16感染和相关宫颈癌的预防和治疗疫苗的中试生产及新药研发。
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中 图1为根据本发明实施例2的方法构建的重组质粒pUC18sL2E7的结构简图。
图2为根据本发明实施例3的方法构建的重组原核表达质粒pET9asL2E7的结构简图。 图3为根据本发明实施例4的进行的密码子优化基因sL2E7在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE凝胶分析的结果；其中，1为Marker, 2为优化基因表达产物，3为未优化基因(编码同一蛋白的其他基因)的表达产物，4为空载体对照。 图4为根据本发明实施例5进行的密码子优化基因sL2E7在大肠杆菌中表达蛋白的Western-blot鉴定结果；其中，1为载体对照，2为优化基因表达的裂解液，3为Marker。
图5为根据本发明实施例6进行的密码子优化基因sL2E7在原核系统表达经凝胶层析纯化后的SDS-PAGE凝胶分析的结果，其中，1为Marker ;2为经纯化的L2E7蛋白。
图6为根据本发明实施例7进行的优化基因表达蛋白经纯化，免疫小鼠后的抗体滴度检测的结果。 图7为根据本发明实施例7进行的密码子优化基因sL2E7表达蛋白免疫小鼠后酶联免疫斑点检测结果。 图8为根据本发明实施例7进行的密码子优化基因sL2E7表达蛋白对肿瘤生长的抑制作用。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。 实施例1 :设i十并合成人乳头瘤病毒16型L2E7融合蛋白大肠杆菌表汰的优化密石好細 将从宫颈癌病人标本中分离克隆的HPV16晚期基因L2和早期基因E7测序，根据
获得的HPV16晚期基因L2和早期基因E7的编码的多肽氨基酸序列，并将E7蛋白与pRB结
合位点的两个关键氨基酸第24位半胱氨酸和第26位谷氨酸的密码子分别突变为甘氨酸密
码子GGT和GGG，以消除其肿瘤转化活性。将HPV16病毒的次要衣壳蛋白序列L2与HPV16
病毒的E7蛋白序列组合设计为如下的融合蛋白MRHKRSAKRTKRASATQLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEGKTIADQ ILQYGSMGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGTRPPTATDTLAPV RPPLTVDPVGPSDPSIVSLVEETSFIDAGAPTSVPSIPPDVSGFSIT TSTDTTPAILDINNTVTTVTTHNNPTFTDPSVLQPPTPAETGGHFT LSSSTISTHNYEEIPMDTFIVSTNPNTVTSSTPIPGSRPVARLGLYS RTTQQVKVVDPAFVTTPTKLITYDNPAYEGIDVDNTLYFSSNDN SINIAPDPDFLDIVALHRPALTSRRTGIRYSRIGNKQTLRTRSGKSIGAKVHYYYDLSTIDPAEEIELQTITPSTYTTTSHAASPTSINNGLY DIYADDFITDTSTTPVPSVPSTSLSGYIPANTTIPFGGAYNIPLVSGPDIPINITDQAPSLIPIVPGSPQYTI IADAGDFYLHPSY预LRKRR KRLPYFFSDVSLAAMHGDTPTLHE预LDLQPETTDLYGYGQLN DSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP. (571个氨基酸) 利用基因简并性，在其编码的产物蛋白氨基酸序列保持不变的前提下设计出优化密码子核苷酸序列，发明人将该序列命名为sL2E7，经实验检测证明，该适于在大肠杆菌中表达的HPV16L2E7融合蛋白，其序列具体如下
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ATGCGTCATAAACGTTCTGCGAAACGTACCAAACGTGCGAGC GCGACCCAGTTATATAAAACGTGTAAACAGGCCGGTACCTGC CCGCCGGATATTATTCCGAAAGTGGAAGGCAAAACCATTGCG GATCAGATTCTGCAGTATGGCAGCATGGGCGTGTTCTTTGGCG GCCTGGGCATTGGCACCGGCAGCGGCACCGGCGGCCGTACC GGCTATATTCCGCTGGGCACCCGTCCGCCGACCGCGACCGAT ACCCTGGCGCCGGTGCGTCCGCCGCTGACCGTTGATCCGGTG GGCCCGAGCGATCCGAGCATTGTGAGCCTGGTGGAAGAAAC CAGCTTTATTGATGCGGGCGCGCCGACCAGCGTGCCGAGCAT TCCGCCGGATGTGAGCGGCTTTAGCATTACCACCAGCACCGAT ACCACCCCGGCGATTCTGGATATTAATAATACCGTGACCACCG TGACCACCCATAATAATCCGACCTTTACCGATCCGAGCGTGCT GCAGCCGCCGACCCCGGCGGAAACCGGCGGCCATTTTACCCT GAGCAGCAGCACCATTAGCACCCATAATTATGAAGAAATTCC GATGGATACCTTTATTGTGAGCACCAATCCGAATACCGTGACC AGCAGCACCCCGATTCCGGGCAGCCGTCCGGTGGCGCGTCTG GGCCTGTATAGCCGTACCACCCAGCAGGTGAAAGTGGTTGAT CCGGCGTTTGTGACCACCCCGACCAAACTGATTACCTATGATA ATCCGGCGTATGAAGGCATTGATGTGGATAATACCCTGTATTTT AGCAGCAATGATAATAGCATTAATATTGCGCCGGACCCGGATT TTCTGGATATTGTGGCGCTGCATCGTCCGGCGCTGACCAGCCG TCGTACCGGCATTCGTTATAGCCGTATTGGCAATAAACAGACC CTGCGTACCCGTAGCGGCAAAAGCATTGGCGCGAAAGTGCAT TATTATTATGATCTGAGCACCATTGATCCGGCGGAAGAAATTG AACTGCAGACCATTACCCCGAGCACCTATACCACCACCAGCC ATGCGGCGAGCCCGACCAGCATTAATAATGGCCTGTATGATAT TTATGCGGATGATTTTATTACCGATACCAGCACCACCCCGGTA CCGAGCGTGCCGAGCACCAGCCTGAGCGGCTATATTCCGGCG AATACCACCATTCCGTTTGGCGGCGCGTATAATATTCCGCTGG TGAGCGGCCCGGATATTCCGATTAATATTACCGATCAGGCGCC GAGCCTGATTCCGATTGTGCCGGGCAGCCCGCAGTATACCATT ATTGCGGATGCGGGCGATTTCTATCTGCATCCGAGCTATTATAT GCTGCGTAAACGTCGTAAACGTCTGCCGTATTTCTTTAGCGAT GTGAGCCTGGCGGCGATGCATGGCGATACCCCGACCCTGCAT GAATATATGCTGGATCTGCAGCCGGAAACCACCGATCTGTATG GCTATGGCCAGCTGAATGATAGCAGCGAAGAAGAAGATGAAA TTGATGGCCCGGCGGGCCAGGCGGAACCGGATCGTGCGCATT ATAATATTGTGACCTTTTGCTGCAAATGCGATAGCACCCTGCG TCTGTGCGTGCAGAGCACCCATGTGGATATTCGTACCCTGGA
AGATCTGCTGATGGGCACCCTGGGCATTGTGTGCCCGATTTGC
AGCCAGAAACCGTAA(1716bp)
实施例2 : 将上述sL2E7核苷酸序列送基因合成公司合成，并由公司将其克隆于pUC18中，获
得合成基因的重组克隆质粒pUC18sL2E7，该重组克隆质粒的结构见图1。 本实施例中所使用的pUC18为可商购获得的质粒载体，其具体结构见文献萨姆
布鲁克J，弗里奇EF，和曼尼阿蒂斯T，分子克隆实验指南.1992.第二版(北京)科学出版
社第9页。实施例3 : 将合成并克隆的L2E7优化基因用酶切消化，所述酶切消化的操作如下先用NdeI酶37t:水浴消化2小时，然后用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，再BamH I酶37。C水浴消化2小时，最后用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收片段，所使用的Nde I和BamH I酶均为Biolabs公司产品，购自北京北方仪涛商贸有限公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒为北京天根生化科技有限公司产品，然后将其插入大肠杆菌表达载体pET9a的Nde I和BamH I位点，经Nde I和BamH I酶切鉴定并测序筛选获得有正确插入的原核表达重组质粒pET9asL2E7，其结构简图如图2所示。所使用的pET9a为可商购获得的表达质粒载体，为Novagen公司产品，购自华美生物工程公司北京分公司。
实施例4 : 使用实施例3获得的重组质粒pET9asL2E7转化BL21 (DE3)大肠杆菌，涂平皿后，37t:过夜培养。挑单斑在LB培养基(已知培养基，该培养基配方见参考文献萨姆布鲁克J，弗里奇EF，和曼尼阿蒂斯T，分子克隆实验指南.1992.第二版(北京)科学出版社第908页)中培养，当0D = 0. 6，加入终浓度为0. 4mM的IPTG(为Promega公司产品，购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司)诱导表达二小时，取适量菌体进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，结果显示，在分子量约90KD处有一新增蛋白带，该蛋白带约占全菌蛋白总产量的50% ，电泳结果如图3所示。由此可见，优化基因比未优化基因在大肠杆菌中的表达水平提高了近三倍。 实施例5 :HPV16sL2E7优化基因原核表达的Western-blot检测 取实施例4获得的诱导表达菌液200iil，离心收获菌体，重悬于lOOiU的
SDS-PAGE加样缓冲液(已知缓冲液，该缓冲液的具体配方、配制方法见萨姆布鲁克J，弗里
奇EF，和曼尼阿蒂斯T，分子克隆实验指南.1992.第二版(北京)科学出版社笫935页)
混匀，IO(TC加热3分钟。离心后取5-10 iil上样于10%的SDS-PAGE胶，进行电泳，然后电
转硝酸纤维素膜。 使用抗HPV16L2自制豚鼠多抗和抗HPV16E7的单抗(抗HPV16L2自制豚鼠多抗，用HPV16L2原核系统表达并纯化的蛋白加弗氏佐剂，皮下多点注射免疫豚鼠，免疫两次后心脏采血，离心取血清。抗HPV16E7的单抗为Santa Cruz公司产品，购自北京北方仪涛商贸有限公司)作为第一抗体； 辣根过氧化物酶标记的蛋白A/G(购自北京北方同正生物技术发展公司)为与抗HPV16L2豚鼠多抗反应的第二抗体； 辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，为与抗HPV16E7的单抗反应的第二抗体，购自
9北京中杉金桥生物技术有限公司)，进行目的蛋白表达的特异性鉴定。结果表明，由优化基因表达的L2E7融合蛋白分子量约在90KD处，与未优化基因表达蛋白的大小相同，结果参见图4，经测序确认其氨基酸序列与前述实施例1所设计的嵌合蛋白序列相符。
实施例6 :L2E7优化某闵在大肠杆菌中的表汰和蛋白的纯化 a.将实施例4获得的菌种以1 : 1000接种于300ML2XYT培养基(已知培养基，见参考文献萨姆布鲁克J，弗里奇EF， and曼尼阿蒂斯T，分子克隆实验指南.1992.第二版(北京):科学出版社第909页)，在37。C下振荡培养至0D6。。 = 0. 8，加入IPTG (为Promega公司产品，购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司)至终浓度为O. 84mM/升，在37t:下诱导表达3小时，收集菌体沉淀； b.将前述步骤a中收获得到的表达菌体，溶解在lOmL裂解缓冲液(20mMTris，0. 5% TritonX-lOO， 0)中加入溶菌酶，于室温下放置30分钟后，在冰浴中超声处理(200瓦12次)12秒，间隔30秒。离心(12， OOOrmp， 20分钟，4°C )收集沉淀;
c.将前述步骤b获得的沉淀悬浮于20mL含有1M尿素的缓冲液(20mMTris， 1摩尔/升尿素，PH8. 0)，在冰浴中超声处理(200瓦，12次)12秒，每次间隔30秒。离心(12000rmp，20分钟，4。C )收集沉淀； d.将前述步骤c获得的沉淀重新悬浮于10mL含8M尿素缓冲液(20mMTris， 8摩尔/升尿素，PH8. 0)，在冰浴中超声处理(200瓦，12次)12秒，间隔30秒。离心(12000rmp，20分钟，4°C )，收集上清液备用。 e.离子交换层析将前述步骤d得到的上清液经QFF离子交换柱(请确定该交换柱的全称、并提供其现有技术文献出处或商购途径)和SP柱(请确定该交换柱的全称、并提供其现有技术文献出处或商购途径)纯化得到目的蛋白，纯度达95%以上，所得纯化蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳分析结果见图5。
QFF:Q S印harose" Fast Flow,
SP:SP S印harose" Fast Flow 均为Amersham Biosciences (安玛西亚)公司产品，购自北京中原合聚经贸有限公司 将回收蛋白经透析袋(购自华美生物工程公司北京分公司，规格匿-49，孔径为12-14KD)透析，最后透析至磷酸缓冲盐溶液(PBS，其配方见萨姆布鲁克J，弗里奇EF，和曼尼阿蒂斯T，分子克隆实验指南.1992.第二版(北京)科学出版社第927页)中储存供免疫动物使用。 实施例7 :L2E7融合蛋白动物免疫实验 a. L2E7融合蛋白免疫小鼠后血清特异性抗体和细胞免疫反应检测 使用由前述实施例6制备得到的L2E7融合蛋白20yg，来免疫C57BL/6小鼠
(C57BL/6小鼠，6-8周龄，雌性，购自中国学科学院实验动物繁育中心，在SPF2级动物房饲
养)，二周后加强一针(剂量为20 ii g)，免疫结束后两周进行血清特异性抗体检测和细胞免
疫检测。 (1)特异性抗体检测取血清，用酶联免疫法(ELISA)进行L2抗体和E7抗体的检测，以试剂组PBS为阴性对照，实验结果如图6所示。从图6中可看出，L2E7融合蛋白能诱导产生1 : 160000的高滴度L2抗体和1 : 14700的E7抗体。
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(2)细胞免疫反应检测取脾细胞，用酶联免疫斑点(ELISP0T)方法进行E7的第49-57位肽剌激产生的特异性分泌Y -IFN的效应T细胞的数目检测，实验结果如图7所示。ELISPOT检测是依据Miyahira等人和Murali-Krishna等人的方法(参见MiyahiraY， Murata K， Rodriguez D，等人Quantification of antigen specific CD8+ T cellusing an ELISPOT assay. JImm皿ol Methods, 1995， 181 (1) :45-54. Murali-Krishna K，Altman JD，Suresh M，et al. Counting antigen—speific CD8T cells :a reevaluation ofbystander activationduring viral infection. Immunity, 1998， 8 (2) : 1771-87.)，操作参见ELISPOT试剂盒说明书(ELISPOT试剂盒为U-CyTech公司产品，购自深圳达科维生物技术有限公司)。 实验结果见图7，经过t检验确定，实验组与对照组斑点数差异有统计学意义(p< 0. 05)，说明由优化后的基因表达的本发明嵌合蛋白能诱发小鼠产生特异性T细胞介导的细胞免疫应答。 b. HPV16L2E7对肿瘤生长的抑制作用 先用1X104TC_1肿瘤细胞(TC-l肿瘤细胞系HPV16-E6、E7和ras基因转化的C57BL/6小鼠肺上皮细胞，可稳定表达和递呈E7蛋白，由John Hopkins大学T. C. Wu教授馈贝曾，见参考文献丄in KY， Guarnieri FG， Stavelev-o' Canrroll KF， et al. Treatmentof established tumor with a novelvaccine that enhance major histocompatibilityclass II presentation of tumorantigen. Cancer Res， 1996， 56 Q) :21 26)腹股沟皮下注射(注射剂量为100iU)C57BL/6小鼠(C57BL/6小鼠，6-8周龄，雌性，购自中国学科学院实验动物繁育中心，在SPF2级动物房饲养)处，第二天肌肉注射20 g的L2E7融合蛋白(由前述实施例6制备得到的L2E7融合蛋白)免疫C57BL/6小鼠(C57BL/6小鼠，6_8周龄，雌性，购自中国学科学院实验动物繁育中心，在SPF2级动物房饲养)10天后加强免疫(剂量为20 i！ g的L2E7融合蛋白)，观察肿瘤生长情况(每周2次)。结果表明经蛋白免疫后对肿瘤的生长有明显抑制作用，其中90 %小鼠TC-1肿瘤细胞生长完全抑制。实验结果如图8所示。 参考文献 1. IARC :The Human Papillomaviruses. In :Monographs on the evaluation ofthecarcinogenic risks to humans. Eds :IARC，Lyon， (1995); 2.Munoz， N. :Human papillomavirus and cervical cancer :印idemiologicalevidence. In :New Developments in Cervical Cancer ScreeningandPrevention.Eds :E. Franco and J. Monsonego， Blackwell Science, Oxford,3-13(1997); 3.M皿oz N，Bosch FX，Castellsague Diaz M，etal. Int J Cancaer，2004 ;111 (2):278-285 ; 4.Hagensee ME， Yaegashi N， Galloway DA. S e 1 f-as s emb 1 y ofhumanp即illomavirus type 1 c即sids by expression of the LI protein alone orbycoexpression of the LI and L2 capsid proteins. J Virol. 1993Jan ;67 (1) :315-22;
5. Sasagawa T，Pushko P，Steers G，Gschmeissner SE，Hajibagheri MA，Finch J，Crawford L， Tommasino M. Synthesis and assembly of virus—like particles ofhumanpapillomaviruses type 6 and type 16 in fission yeastSchizosaccharomyces pombe. Virology. 1995 Jan 10 ;206(1) :126-35 ; 6. Xiaojiang S. Chen， Gregory Casini， Stephen C.Harrison and Robert Garcea. Papi1lomavirus Capsid Protein Expression in Escherichia coli : Purificationand Assembly of HPVll and HPV16L1. J. Mol. (2001)307,173-182 ;
7. Nardelli-Haefliger D，Wirthner D，Schiller, JT，et al. Specific antibody levelsat the cervix during the menstrual cycle of women vaccinated with huma即即illomavirus 16 virus-like particles. J Natl Cancer Inst， 2003， 95 (15): 1128-1137 ; 8. Harro CD， Pang YY， Roden RB， et al. Safety and imm皿ogenicity trial inadult volunteers of a human papillomavirus 16 LI virus—like particle vaccine. J Natl Cancer Inst， 2001， 93 (4) :284-292;9. Roden RB， Yutzy WH， Fallon R， et al. Minor Capsid Protein of H皿am GenitalPapillomaviruses Contains Subdiminant Cross—Neutalizing Epitopes. Virology,2000，270 :254-275。
序列表
〈110〉中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 〈120〉HPV融合蛋白、基因、载体、菌株、制备方法及用途 〈130>DIC08110143 〈160>2
〈170>PatentIn version 3. 3 〈210>1 〈211>1716 〈212>DNA
〈213〉人乳头瘤病毒融合蛋白16L2E7 〈400>1
aacgttctgc gaaacgtacc
60
120
180
240
300
360
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1020
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1500
1560
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13
530 535 540 Thr His Val Asp lie Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu 545 550 555 560 Gly lie Val Cys Pro lie Cys Ser Gin Lys Pro 565 570
权利要求
一种人乳头瘤病毒(HPV)16型L2E7融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列为SQE ID NO.2所示的序列。
2. —种用于编码权利要求l所述的人乳头瘤病毒(HPV)16型L2E7融合蛋白的DNA序 列，其特征在于，所述DNA序列的核苷酸序列为SQE ID NO. l所示的序列。
3. —种大肠杆菌表达质粒载体，其特征在于，所述的质粒载体是由权利要求2所述的 HPV16L2E7基因片段插入至质粒pET9a的Ndel和BamHI位点之间来构建的。
4. 根据权利要求3所述的大肠杆菌表达质粒载体，其特征在于，所述的大肠杆菌是 BL21(DE3)。
5. —种用于生产权利要求1所述的人乳头瘤病毒(HPV) 16型L2E7融合蛋白的大肠杆 菌菌株，其特征在于，所述大肠杆菌菌株含有权利要求3所述的质粒载体。
6. 根据权利要求5所述的大肠杆菌菌株，其特征在于，所述的大肠杆菌为BL21 (DE3)。
7. —种制备权利要求l所述的人乳头瘤病毒(HPV)16型L2E7融合蛋白的方法，其特征 在于，所述方法包括以下步骤1) 将权利要求2所述的HPV16L2E7基因片段插入大肠杆菌表达载体pET9a的Ndel和 BamHI位点，将该质粒转化大肠杆菌获得含有pET9al6L2E7的菌株，接种培养，IPTG诱导表 达；2) 表达菌体经离心裂解后，收获包涵体，用6M尿素悬起，离心，取上清用CM柱纯化表达 蛋白。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的大肠杆菌是BL21 (DE3)。
9. 一种制备用于治疗人乳头瘤病毒16型感染及其相关疾病(如宫颈癌)药物的方法， 其特征在于，所述方法包括，将权利要求5或6所述的大肠杆菌菌株用于发酵生产L2E7融 合蛋白。
10. 权利要求1所述的人乳头瘤病毒(HPV) 16型L2E7融合蛋白、权利要求2所述的人 乳头瘤病毒(HPV) 16型L2E7融合蛋白的DNA序列、权利要求3_4任一项所述的大肠杆菌表 达质粒载体或权利要求5-6任一项所述的大肠杆菌菌株在制备用于治疗人乳头瘤病毒16 型感染及其相关疾病(如宫颈癌)的药物中的应用；优选地，所述药物为疫苗；最优选地， 所述疫苗同时具有为预防和治疗作用。
11. 一种用于预防和治疗宫颈癌的疫苗，其特征在于，所述疫苗包括权利要求1所述的 人乳头瘤病毒(HPV) 16型L2E7融合蛋白。
全文摘要
本发明涉及一种在大肠杆菌中高效表达的人乳头瘤病毒16型L2E7重组蛋白的密码子优化基因，将其插入原核表达载体pET9a，优化基因获得高效表达，表达水平占全菌的50％，表达蛋白经纯化后免疫小鼠，实验结果表明该蛋白与未经优化基因表达的蛋白具有相同的免疫原性，可诱发特异性的γ-INF的释放，肿瘤生长抑制动物实验表明蛋白免疫对肿瘤的生长有明显抑制作用，其中90％小鼠肿瘤细胞生长完全抑制。该优化基因建立的L2E7重组蛋白原核高效表达系统能用于HPV16感染和相关宫颈癌的预防和治疗疫苗的中试生产及新药研发。
文档编号C12P21/04GK101735310SQ20081022704
公开日2010年6月16日 申请日期2008年11月20日 优先权日2008年11月20日
发明者任皎, 张卉, 田厚文, 赵莉, 阮力, 高见 申请人:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所