抗稻褐飞虱主效基因及其分子标记方法和应用的制作方法

专利名称：：抗稻褐飞虱主效基因及其分子标记方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及分子遗传学领域，具体涉及水稻抗褐飞虱主效基因位点及其分子标记方法，可用于水稻抗褐飞虱种质资源的利用和品种的选育及抗虫性鉴定等等方面。技术背景褐飞虱是水稻生产区最严重的害虫之一(程遐年等，2003;Pathak1972;Dyck"a/.，1979;Sogawa，1982)。实践证明，利用品种抗性是防治褐飞虱为害的最佳途径之一(Pathak,1969;Sogawa,1982)。因此，发现并鉴定新的褐飞虱抗性基因，培育具有持久抗性的水稻品种，是利用品种抗性防治褐飞虱为害的关键所在，对抗性基因的精细定位，是利用抗性基因的基础前提。然而，随着抗虫水稻品种的推广应用，能够克服品种抗性的褐飞虱新生物型也随即出现，成为褐飞虱防治及抗虫育种工作中面临的主要难题。上世纪60年代，遗传育种学家和昆虫学家已着手筛选鉴定褐飞虱抗性基因资源，选育抗性水稻品种。迄今为止，已先后鉴定了至少23个主效抗性基因，其中17个已被分子定位(苏昌潮等，2003;Yang"2004;YangWa/.，2005;Chen"a/.，2006)。在第2染色体上，目前只是定位了l个抗性基因万户/2"(t)(Liu""/.,2001)。在第3染色体上，目前已定位了3个抗性基因5pW3(t)、BpW4和Z^WW"("Renganayaki"a/.,2002;Huang"a/.,2001;Chen"a/.，2006)。在第4染色体上，已定位了3个抗性基因^p/3、万//L/2(t)和BpW"黄朝锋2003,Yang2002;HuangW/.,2001)。在第6染色体上，目前定位了2个隐性抗性基因(Kawaguchi"a/.，2001;Yang"a/.,2005)。在第9染色体上，到目前为止，只定位了l个显性抗性基因，但尚未给基因命名(Mei"a/.，1996)。在第ll染色体上，迄今为止，也只定位了l个显性抗性基因，也未给基因定名(Jena""/.,2002)。在第12染色体上，目前已定位的抗性基因是最多的，总共有5个，即(Hirabayashi"a/.，1995)、6卢(Murata"a/.,1998)、6卢(Murai"，2001)、B卢0(t)(Ishii",1994)和5卢S(t)(Jena"a/.,2005)。目前，部分抗性基因如BpW、^Zz2和B;^3，已被成功应用在水稻抗性育种上，而且在开始大面积推广时的确起到了控制褐飞虱危害的作用。但是，随着褐飞虱新生物型的出现，由主效基因控制的抗性稳定性有所改变(Kenmore^a/.，1984)。因此，筛选、寻找更多有用的抗性基因，应用于今后的基因聚合，培育出更有效、具有持久广谱抗性的优良品种(系)，是本发明的研究目的意义。
发明内容本发明的目的在于提供水稻抗褐飞虱基因位点，并提供基因位点的分子标记方法，通过检测这些与褐飞虱抗性基因位点连锁的分子标记，可以预测水稻植株对褐飞虱的抗性，从而为褐飞虱抗性育种提供了可能。本发明通过研究水稻抗性品种RBPH54发现两个抗褐飞虱基因位点，分别是bph20(t)和bph21(t)，它们共同控制水稻抗褐飞虱的抗性。其中，抗褐飞虱基因位点bph20(t)与下述分子标记紧密连锁SSR标记BYL7:5，端正向引物序列AAGCTAGGGAATCAGCGGTTA3'端反向引物序歹'JTGTGGCATGTCACTCACTCAC或SSR标记BYL8:5，端正向引物序歹'JCCCACTTCCACAACCACA3，端反向引物序列ATGCTCCTAGCTTCCTATTCC扩增水稻基因组DNA，如果用引物BYL7能够扩增出142bp的扩增片段，或用引物BYL8扩增出190bp的扩增片段，则标志着水稻品种含有抗褐飞虱基因位点bph20(t)，该基因位于第6染色体的短臂上，与BYL7和BYL8连锁，且位于BYL7和BYL8两者之间，与两者的距离分别为1.3cM和1.2cM。本发明还提供上述抗褐飞虱基因位点bph20(t)的分子标记方法，其是利用SSR标记引物BYL7和/或BYL8扩增水稻基因组DNA，通过扩增结果判断该水稻品种是否含有抗褐飞虱基因位点bph20(t)。其中，抗褐飞虱基因位点bph21(t)，与下述分子标记紧密连锁SSR标记RM222:5，端正向引物序列CTTAAATGGGCCACATGCG3，端反向引物序列CAAAGCTTCCGGCCAAAAG或SSR标记RM244:5，端正向弓I物序歹JCCGACTGTTCGTCCTTATCA3，端反向引物序列CTGCTCTCGGGTGAACGT扩增水稻基因组DNA,如果用引物RM222能够扩增出213bp的扩增片段，或用引物RM244扩增出163bp的扩增片段，均标志着水稻品种含有抗褐飞虱基因位点bph21(t)，该基因位于第10染色体的短臂上，与RM222和RM244连锁，且位于RM222和RM244两者之间，与两者的距离分别为7.9cM和4.0cM。本发明还提供上述抗褐飞虱基因位点bph21(t)的分子标记方法，其是利用SSR标记引物RM222和/或RM224扩增水稻基因组DNA,通过扩增结果判断该水稻品种是否含有抗褐飞虱基因位点bph20(t)。本发明还提供筛选上述抗性基因位点标记的方法，其包括如下步骤(1)使用水稻品种RBPH54与TN1杂交后复交两代再自交而得BC2F2群体，对后代进行抗虫性鉴定，经抗性鉴定后抗性表现较好的300个体作为作图群体；(2)提取亲本及作图群体的DNA，以BC2F2群体作为作图群体，从覆盖水稻基因组的2840多条SSR引物中，选取间隔10~15cM左右、且均匀分布在水稻12条染色体上的229对引物进行分析，用于亲本间多态性筛选，然后应用有多态性的分子标记用于分离群体的分析；(3)根据分子标记多态性,结合分离群体抗性表型参数,用Mapmaker/QTL3.0作图软件进行抗虫基因与分子标记的遗传连锁分析，LOD23.0,获得连锁图谱；(5)根据连锁图谱，确定在RBPH54中的抗性基因bph20(t)与分子标记RM435、RM589、RM586、RM588、RM190、RMR540、BYL7和BYL8连锁；bph21(t)与分子标记RM222、RM311、RM5348和RM244连锁。因此，RM435、RM589、RM586、RM588、RM190、RMR540、BYL7和BYL8为抗褐飞虱基因位点bph20(t)的分子标记引物，而RM222、RM311、RM5348和RM244为抗褐飞虱基因位点bph21(t)的分子标记引物。有益效果(1):发现两个来源于普通野生稻的抗褐飞虱隐性基因位点bph20(t)和bph21(t)，这两个基因同时控制抗性材料RBPH54的抗性，它们对抗性的作用为重复作用。(2):定位了上述两个抗性基因位点，其中bph20(t)与SSR分子标记BYL7和BYL8连锁，且位于BYL7和BYL8两者之间，与两者的与两个标记的遗传距离为1.3cM和1.2cM;bph21(t)与SSR分子标记RM222和RM244连锁，且位于RM222和RM244两者之间，与两者的与标记距离分别为7.9cM和4.0cM。(3):这两个抗性基因的发现与定位,可用于水稻品种抗褐飞虱的选育工作，借助分子标记辅助育种，通过基因聚合把多个基因聚集一起而获得优质广谱抗性育种材料，可大大提高育种效率，同时延缓品种抗性的丧失。图l.水稻品种RBPH54抗褐飞虱基因位点(t)与分子标记连锁图；图2.水稻品种RBPH54抗褐飞虱基因位点(t)与分子标记连锁图。具体实施方案本发明是从抗性材料RBPH54中发现两个隐性的褐飞虱抗性基因(t)和(t)，该抗性材料具有广谱的抗性，兼抗褐飞虱生物型II及孟加拉型等，广谱抗性材料的发现及应用在抗性育种中有着重大的作用，而在抗性基因位点的发现及分子标记定位基础上，可借助分子标记辅助育种技术进行有目的的抗虫基因的聚合，选育抗虫品种。而本发明中的抗性材料RBPH54可以作为抗性育种的种质资源，同时应用与抗性基因连锁的分子标记对抗虫育种过程的材料进行筛选，可大大提高育种效率。以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1材料与方法1.材料选择RBPH54抗虫性鉴定后发现其具有较强的抗褐飞虱特性，因此把其作为亲本，与感虫品种TN1杂交，杂交后再回交自交，各代植株均经抗虫性鉴定。(RBPH54和TN1购自广西农科院植保所)2.抗虫性鉴定褐飞虱抗性的鉴定方法参照国际水稻研究所使用的标准苗盘筛选法SSST(IRRI，1988)，并做一定的修改。育苗用的土壤取自稻田表土，经初步处理后，取泥质均一的土用于育苗。水稻种子在25'C下用水浸泡24h,洗净、催芽后播于盛有上述土壤的搪瓷育秧盘中。每盘播10个品种，每个品种播20-30粒种子。中间播抗虫对照品种ASD7，和感虫对照TN1。播种后，覆土，并置于网室内生长。育苗期间正常管理。褐飞虱鉴定种群为生物II型。在秧苗3.54叶期，去除弱苗、小苗，剩下留20苗接虫鉴定。接虫前把秧盆转移到注有水的水槽中(水要浸过秧苗0.5lcm深，以保持高湿度，利于秧苗和虫的生长，并防止蚂蚁和蜘蛛等侵入。罩上接虫鉴定笼，平均每株秧苗接57头l-2龄若虫，接虫时尽量均匀地把虫释放于接虫笼内。当感虫对照品种TN1死亡达100%以上时，调查各品种的各株受害情况，受害级别按表1统计。各水稻品种的平均受害级别釆用如下方法计算累加各水稻品种的各个植株的最终抗性级别，再除以该品种的总植株数。根据平均受害级别，釆用广西农业科学院植保所修订的评级标准，确定各品种的抗性级别，即0级免疫；1级高抗(0.1-1.9);3级抗(2.0-3.9);5级中抗(4.05.9);7级中感(6.0—7.9);9级高感(8.0~9.0)(韦素美等，1994，1998)。抗性鉴定设1~3次重复，分析材料的综合抗性，并根据抗性级别推测基因型。表1水稻对褐飞虱抗性的评价标准<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>3第一、二片叶部分黄化抗5植株明显黄化或矮缩中抗7植株大部分叶片萎蔫，但依然存活中感9植株全部叶片萎蔫或枯死_高感3.作图群体的建立总共发展了BC2F2群体900多株，经过三次重复的苗期抗性鉴定，最终选择了极端抗性和极端感性的300株作为作图群体。4.抗性基因定位(1)SSR标记选择才艮据http:〃genome.cornell.edu/ric,http:〃www.gramene.org和2002年公布的SSR相关序列进行设计合成提供的SSR引物信息，从覆盖水稻基因组的2840多条SSR引物中，选取间隔1015cM左右、且均匀分布在水稻12条染色体上的229对引物进行分析，用于亲本间多态性筛选，将有多态的分子标记用于分离群体的分析。(2)DNA的提取和制备DNA的提取用简易CTAB抽提法进行。具体过程如下在分蘖盛期每个单株取上部1~2片幼叶，保存于-8(TC冰箱中备用。抽提DNA时取长约35cm的叶片放入研钵中，加入液氮充分研磨至粉末状，转移至2ml离心管中，加入500600jal预热的CTAB抽提液，放置于65。C水洛保温40-50min,期间不时小心摇动离心管，以免成团；然后加入氯仿/异戊醇(24:l)约lml，振荡10min,充分混勻后于12000rpm离心10min,上清夜转移至另一个1.5ml离心管中，加入两倍体积氯仿/异戊醇(24:l),振荡5min,充分混匀后于12000rpm离心10min，上清夜转移至另一个1.5ml离心管中加入双倍预冷无水乙醇，4。C下放置至DNA析出，12000rpm离心3min，去上清液，用75%乙醇漂洗两次，弃乙醇，适度风干，力口100200jilTE(10mMTris-HClpH8.0，lmMEDTA)溶解。抽提的DNA放置于4'C冰箱中冷藏备用。如要长期保存放于-2(TC冰箱中冷藏。(3)PCR扩增及电泳PCR扩增按照Panaudda/.(1996)的方法稍加修改进行。20pl反应体系中包括0.10pM的引物、250pMdNTP、lxPCR反应缓冲液(50mMKCl、10mMTris画HClpH8.3、1.5mMMgCl2、)、50100ng的DNA模板、1Ur"《酶。反应在TgmdientPCR仪中进行。反应程序为94。C预变性5min，循环(94。Clmin、51-61°Clmin、72。Clmin)41次，最后72'C延伸5-10min。根据引物的特性，对退火温度作相应的修改。PCR扩增产物在6%的变性(或中性)聚丙烯胺凝胶电泳分离。电泳后用硝酸银银染法染色后读图分析。(4)基因定位为快速鉴定抗性基因，本例应用抗虫亲本、感虫亲本及抗虫基因池15R和感虫基因池15S作为标记筛选的模板进行扩增，以(1)选择的水稻染色体的229对SSR引物为扩增引物，寻找有多态性的标记。为了保证筛出的标记的准确性，对初步筛选到的标记进一步用两个亲本和作图群体的单株进行确认，寻找与抗性基因连锁的候选标记。候选标记确定以后，釆用隐性群体分析法(recessive-classanalysis,RCA;Zhangda/.，1994;Pan"a/"2003)进行连锁分析。根据分子标记多态性，结合分离群体抗性表型参数，用Mapmaker/QTL3.0作图软件进行抗虫基因与分子标记的遗传连锁分析，LOD^3.0。(5)抗性基因位点的进一步定位根据抗性基因位点初步定位的结果，本发明借助BIA法，在抗性基因位点的目的区域查找并开发基于PCR的标记，对抗性基因位点进行精细定位。具体方法如下一方面，应用国际水稻微卫星发起组织(InternationalRiceMicrosatelliteInitiative,IRMI)所公布的公共数据库(http:〃www.gramene.org)，在由抗性基因位点的连锁标记标定的覆盖了抗性基因位点的区域内查找新的SSR标记。另一方面，从日本水稻基因组研究计划(RiceGenomeResearchProgram,Japan,RGP)数据库(http:〃rgp.dna.affrc.go.jp)中下载由IRGSP释放的粳稻参考品种(referencecultivar)日本晴的PAC/BAC克隆的序列，根据该序列信息进行基于PCR引物的设计。具体过程如下首先将下载的PAC/BAC克隆的序列用DNAStart软件进行格式转换，去掉数字，然后才进行下一步的搡作。对于SSR标记，则利用重复序列搜索软件SSRIT(SimpleSequenceRepeatIdentificationTool)(http:〃www.gramene.org/db/searches/ssrtool)进fH敫卫星序歹'J的搜索，然后选择重复单位较好(一般要求重复数在8以上，为GA/CT重复，尽量避免AT重复)、重复序列长度长的微卫星序列，利用包含有此微卫星序列的一小段基因组序列(500600bp),进行PCR引物的设计。将所开发的SSR标记命名为BYLxx。上述所有SSR分子标记引物的设计均使用PrimerPremier5.0(http:Vwww.premierbiosoft.com)软件，设计的引物一般要求GC含量在4565%之间，退火温度(Tm)在5065"之间，引物序列长度在1825bp之间，且尽量避免错配、二聚体和发夹结构等，并在GenBank中检测序列的特异性，也就是说避免与水稻基因组其它染色体序列同源。所设计的引物由上海生工生物技术公司和大连宝生物生物技术公司合成。SSR标记的扩增体系及扩增程序与检测方法同上述(3)。结果与分析1.从鉴定结果来看，在所有的鉴定材料中，Fi群体全部表现为感虫材料，根据F!表型全为感虫与其它群体的表型初步判断这些材料的抗性是由隐性基因控制，推测抗虫性由主效基因控制发现其是隐性基因(表2)。2.在229对SSR引物中，在双亲间有扩增产物的有215对，占89%，无扩增产物的24对，占11%。其中具有多态性，并能扩增出稳定的条带的有97对，占总引物的42%，没有多态性的108对，占总引物的47%。这97对引物扩增的DNA片段大小在100bp-400bp之间。通过BSA法对97对多态性SSR引物进行了初步的筛选，其中有2个标记，即第6染色体的SSR标记RM589和第10染色体RM311同时在两个抗、感基因池中都表现出较好的多态性，因此初步把它们定为候选标记。表2TNI(Pi)/RBPH54(P2)杂交后代对褐飞虱II的抗性遗传分离世代植株分离Segregationof比率X2P-检验Generationplants*RatioP-Valu6RS(R:S)TN1(Pi)040(8.89)一-—RBPH54(P2)40(3.00)0一-一(Pi/P2)Fi0120(8.50)一--F29014101:150.1400.95-0.9930000:1--BdP23529631:32.1920.50-0.80*R-抗性；S-感性；P-检验值取平均值。为了进一步确定这2个候选标记，我们把构成作图群体的个体分别逐一筛选了一遍。结果表明，这2个标记均与抗虫基因连锁。据此初步确定控制该材料抗褐飞虱性状的基因位点可能有两个，一个(RM589)在第6染色体，另一个(RM311)在第10染色体上。由所得结果，我们初步认为该抗性材料的抗虫性由两个主效基因位点控制。在第6染色体上已公开发表了一个抗虫基因Z^似(Kawaguchi"a/.,2001)，Z^/z4与第6染色体上的标记RM217和RM225连锁，经过我们用RM217和RM225对我们的亲本及抗感基因池和作图群体进行检测，发现两亲本在RM217和RM225间均无多态性，且这两个标记与RM589间的遗传距离相差约有15cM以上，所以我们认为本发明中所发现并鉴定的第6染色体上的抗性基因位点与^W是不同位点的基因，即是一个新的的抗性基因位点，暂时命名为义同时，由于目前在水稻第10染色体的短臂上还没有公开发表的抗褐飞虱隐性主效基因，因此，我们认为在本研究中所鉴定到的第10染色体上的褐飞虱抗性基因位点也是一个新的抗性基因位点，暂时命名为Z^W7^。通过BSA法及对作图群体的个体分别逐一筛选后，发现多个与抗性基因位点连锁的SSR引物(表3)。通过分析，它们与抗性基因位点的的距离分别如下RM589、RM586、RM588、RM190均位于基因6;/z20O的一侧，与^/zW"J的遗传距离分别为4.1cM、4.7cM、6.2cM和10.2cM(图1)。RM244、RM5348与RM311位于6p/z"(^的同一侧，与^M/(^的距离是4.0cM、8.1cM和16.3cM,RM222位于^/7"^的另一侧，与该基因的遗传距离是7.9cM(图2)。表3来自IRMI数据库的与两个抗性基因连锁的SSR标记<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>3.为了更精细地定位抗性基因位点，从IRGSP发布的序列资料中下载了由近旁标记RM540和RM435所界定的包含了6p/^0(^位点的来自参考品种日本晴的BAC克隆的序列。根据此序列资料总共设计了IO对SSR引物。对作图群体检测的结果表明，自行开发的SSR引物BYL7和BYL8与抗性基因6;/^羊」连锁(表4、图1),位于该抗性基因的两侧(图1),与基因位点^MO(^的距离分别是1.3cM和1.2cM。表4根据Nipponbare序列自行开发的与6p/M(t)连锁的新引物标记<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>l卯实施例2分子标记的验证1、材料和方法1.1材料阴性品种无抗性基因品种，感性品种TN1阳性品种含有抗性基因，为抗性品种:RBPH54和ASD7(购自广西农科院植保所)分子标记引物BYL7和BYL8以及RM222和RM244分别交由上海生工合成。1.2方法CTAB抽提法提取水稻样品基因组DNA(方法同实施例1)。分别用引物反BYL7和BYL8以及RM222和RM244扩增样品DNA。反应体系中包括O.lOpM的引物、250|aMdNTP、lxpCR反应缓冲液(50mMKC1、10mMTris画HClpH8.3、1.5mMMgCl2、)、lOOng的DNA模板、1Ur"《酶。反应在TgradientPCR仪中进行。反应程序为94。C预变性5min，循环(94。Clmin、51-6rClmin、72。Clmin)41次，最后72'C延伸10min。根据引物的特性，对退火温度作相应的修改。PCR扩增产物在6%的变性(或中性)聚丙烯胺凝胶电泳分离。电泳后用硝酸银银染法染色后读图分析。2、结果用上述方法，分别对水稻品种RBPH54和ASD7各十份不同样本以及五份TN1不同样本进行扩增。结果表明，在阳性样本中均能分别扩增出142bp和190bp以及213bp和163bp的片段，而在阴性样本中均不能扩增出这些片段。由此说明，本发明提供的分子标记方法能够准确筛选出含有抗褐飞虱的主效基因，从而大大提高育种效率。〈110〉广西壮族自治区农业科学院<120>抗稻褐飞虱主效基因的及其分子标记方法及其和应用<130〉KHP08112979.7〈160〉20<170〉Patentlnversion3.5〈210>1<211〉20<212〉DNA<213〉人工序列<400>1attacgtgcatgtctggctg20<210>2<211>20<212>腿<213>人工序列〈400>2cgtacctgaccatgcatctg20<210〉3<211>20〈212>DNA<213>人工序列<400>3ctttgtctatctcaagacac20<210>4<211>21〈212〉DNA<213>人工序列<400>4ttgcagatgttcttcctgatg21〈210>5<211>20<212>DNA〈213>人工序列〈400>5atcatggtcggtggcttaac20〈210>6<211〉20<212>腿〈213>人工序列<400〉6caggttccaaccagacactg20〈210〉7<211〉20<212〉DNA<213〉人工序列<400>7gccttctggctcatttatgc20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<400〉8ctaggcctgccagattgaac20〈210〉9〈211〉21<212>腦A〈213>人工序列<400>9acctcgcgttattaggtaccc21<210>10<211〉21<212〉DNA<213〉人工序列<400>10gagatacgccaacgagatacc21<210〉11<211>20<212>丽<213>人工序列〈400〉11gttgctctgcctcactcttg20<210〉12<211>18<212>DNA<213>人工序列〈400>12肪cg3gccaacg犯gc3g18〈210〉13〈211〉19<212>DNA〈213〉人工序列<400〉13cttaaatgggccacatgcg19〈210〉14<211>19<212>腿<213〉人工序列<400>14caaagcttccggccaaaag19<210>15<211>22〈212>DNA〈213〉人工序列<400>15tggtagtataggtactaaacat22〈210〉16〈211>22〈212〉DNA<213〉人工序列<400〉16tcctatacacatacaaacatac22<210>17〈211〉20<212>DNA<213>人工序列<400>17aatccgataggagtaccgcc20〈210〉18<211〉20〈212〉醒<213>人工序列<400〉18aagtgtatgggctggaatgg20〈210>19<211〉20<212>DNA<213〉人工序列<400>19ccgactgttcgtccttatca20<210>20〈211>18<212>腿<213〉人工序列<400〉20ctgctctcgggtgaacgt18权利要求1、抗稻褐飞虱主效基因位点，该主效基因位点为1)bph20(t)，其与下述分子标记紧密连锁SSR标记BYL75’端正向引物序列AAGCTAGGGAATCAGCGGTTA3’端反向引物序列TGTGGCATGTCACTCACTCAC或SSR标记BYL85’端正向引物序列CCCACTTCCACAACCACA3’端反向引物序列ATGCTCCTAGCTTCCTATTCC该基因位于第6染色体的短臂上，与BYL7和BYL8连锁，且位于两者之间，与两者的距离分别为1.3cM和1.2cM；或2)bph21(t)，其与下述分子标记紧密连锁SSR标记RM2225’端正向引物序列CTTAAATGGGCCACATGCG3’端反向引物序列CAAAGCTTCCGGCCAAAAG或SSR标记RM2445’端正向引物序列CCGACTGTTCGTCCTTATCA3’端反向引物序列CTGCTCTCGGGTGAACGT该基因位于第10染色体的短臂上，与RM222和RM244连锁，且位于两者之间，与两者的距离分别为7.9cM和4.0cM。2、抗稻褐飞虱主效基因的分子标记，其为主效基因bph20(t)的SSR标记BYL7:5，端正向引物序列AAGCTAGGGAATCAGCGGTTA3'端反向引物序列TGTGGCATGTCACTCACTCAC或SSR标记BYL8:5，端正向引物序列CCCACTTCCACAACCACA3，端反向引物序歹'JATGCTCCTAGCTTCCTATTCC。3、抗稻褐飞虱主效基因的分子标记方法，其特征在于1)用引物BYL7扩增水稻基因组DNA,如果用引物BYL7能够扩增出142bp的扩增片段，或用引物BYL7扩增水稻基因组DNA,如果用引物BYL8能够扩增出190bp的扩增片段，则标志着水稻品种含有抗褐飞虱基因bph20(t);或2)用引物RM222扩增水稻基因组DNA，如果能够扩增出213bp的扩增片段，或用引物RM244基因组DNA,如果能够扩增出163bp的扩增片段，则标志着水稻品种含有抗褐飞虱基因位点bph21(t)。4、权利要求2所述的分子标记在选育抗稻褐飞虱水稻中的应用。5、一种筛选抗褐飞虱基因位点的分子标记的方法，其步骤如下(1)使用水稻品种RBPH54与TN1杂交后复交两代再自交而得BC2F2群体，对后代进行抗虫性鉴定，经抗性鉴定后抗性表现较好的300个体作为作图群体；(2)提取亲本及作图群体的DNA,以BC2F2群体作为作图群体，从覆盖水稻基因组的SSR引物中，选取间隔10~15cM、且均匀分布在水稻12条染色体上的229对引物进行分析，用于亲本间多态性筛选，然后应用有多态性的分子标记用于分离群体的分析；(3)根据分子标记多态性,结合分离群体抗性表型参数，用Mapmaker/QTL3.0作图软件进行抗虫基因与分子标记的遗传连锁分析，LOD23.0,获得连锁图谱；(4)根据连锁图谱，确定在RBPH54中的抗性基因bph20(t)与分子标记RM435、RM589、RM586、RM588、RM190、RMR540、BYL7和BYL8连锁；bph21(t)与分子标记RM222、RM311、RM5348和RM244连锁。全文摘要本发明提供了抗稻褐飞虱基因的分子标记。本发明通过抗性亲本RBPH54与感虫品种TN1杂交回交后得到各后代，分别对各后代株系进行抗性鉴定及分子遗传连锁分析，获得抗褐飞虱主效隐性基因bph20(t)和bph21(t)，与bph20(t)连锁的两侧最近的分子标记是自行开发的SSR标记BYL7和BYL8，它们与bph20(t)的距离分别为1.3cm和1.2cm；与bph21(t)连锁的两侧最近的分子标记是RM222和RM244，它们与bph21(t)的距离分别为7.9cM和4.0cm。通过与抗褐飞虱基因连锁的分子标记来检测抗虫品种RBPH54及其衍生品种(系)中是否含有上述抗虫基因位点，可大大提高抗褐飞虱水稻的选择效率。文档编号C12N15/29GK101403011SQ20081022694公开日2009年4月8日申请日期2008年11月20日优先权日2008年11月20日发明者驰刘,李容柏,李杨瑞,朗杨,韦素美,黄大辉,黄立飞申请人:广西壮族自治区农业科学院