专利名称：一种玉米Zmptil基因启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程领域，特别涉及一种玉米Zw;^7基因启动子及其应用。
背景技术：
植物基因启动子是重要的顺式作用元件，是一段提供RNA聚合酶识别和结合的DNA序列，它通常位于基因的上游，能指导酶与模板的正确结合，活化RNA聚合酶，使之具有起始特异性转录的形式，并决定转录的方向和效率，是植物基因转录调控的中心。
在生物的生长、发育、生殖过程中，生物能够根据自身的需要及环境的改变，定时、定位及定量地表达所需的基因产物，生物的这种能力是通过其核苷酸上的特定序列和细胞内的蛋白信号或环境中的热、光等理化因素的相互作用来实现的。在这个过程中涉及到启动子、终止子等序列调控元件，在这些调控元件中，启动子的作用尤为重要。因此，启动子的克隆及功能分析，成为我们了解生物的生长发育过程、探讨生物对其生长环境的适应机制以及更好控制外源基因在转基因植物中的表达等具有重要意义。对于一些己知序列的启动子和那些己经全基因组测序的生物，可以设计序列特异性引物，通过PCR扩增的方法克隆基因的启动子序列。在只知道基因的cDNA序列的情况下，可以利用PCR技术设计很多方法克隆其上游的启动子区序列，如环状PCR、利用载体的PCR、利用接头的PCR、 YADE法、TAIL-PCR等等。
蛋白激酶和蛋白磷酸酶催化的蛋白质可逆磷酸化是生物体内普遍存在的一种调节机制，它在细胞的信号识别与转导中起着重要作用。目前，许多编码植物蛋白激酶的基因已经分离出来,然而人们对大多数植物蛋白激酶的功能还不甚了解，它们对基因表达和代谢过程的调节机制、偶联胞外刺激和胞内反应的方式以及其所调节的功能蛋白等许多问题还有待进一步的研究。
Zm;^7基因编码一个有功能的蛋白激酶，半定量RT-PCR分析表明，与其他/^74目似，Zm/^7的表达可以被信号分子SA所上调，表明Zmi^7可能在SA依赖的抗病信号途径中起作用；在玉米中，不同非生物胁迫条件下，
Zm/^7也可以被低温、甘露醇和盐所诱导表达，但是不被ABA所诱导；在35S启动子下，在拟南芥中持续表达Zmi^7，与野生型相比，转基因植株的抗病性没有明显提高，再抗冷性和抗旱性方面没有明显的提高，但是明显提高了抗盐性(尸/a""c/e""， 2006， 171: 99-105.)。以上实验显示，该基因受到胁迫诱导，但是对它转录调控的分子机制还不清楚。在不同的植物体中，Zw/^7的诱导表达情况不同，可能原因是该基因在不同植物体内，和不同启动子的调控作用下，显示出表达量的差异。
发明内容
本发明提供一种玉米Zm;^7基因启动子及其应用，该启动子序列经分析发现含有与胁迫相关的转录因子的结合位点，Zm尸A7基因在玉米中受到该启动子的调控，参与了逆境信号的传导途径。本发明构建了瞬时表达载体，该启动子的瞬时表达的结果显示，该启动子是有功能的启动子。
一种玉米Zm;^7基因启动子，其特征在于是下列核苷酸序列之一
A. 序列表中的SEQIDNQ: 1;
B. 与序列表中的SEQ IDNq: 1限定的DNA序列具有90%以上同源性的DNA序列；
C. 在高严谨条件下可以与序列表SEQIDNQ: 1限定的DNA序列杂
交的序列。
所述的启动子，其特征在于
所述的SEQIDN2: l中，在自5'端第53位至第747位碱基为该序列的启动子核心序列，在自5'端第590位至第594位碱基有1个TATA-box,在自5'端第61位至第69位碱基有1个响应脱落酸ABA的motifllb序列，在自5'端第505位至第511位碱基有一个响应赤霉素的GARE-motif序列，在自5'端第584位至第589位碱基有1个CCAAT-box是MYBHvl转录因子的结合位点。
所述的SEQIDNq: l中，含有与信号传导相关的顺式作用元件。所述的与信号传导相关的顺式作用元件为与光应答有关的顺式作用元件ACE 、 TGG-motif、 circadian 、 I-box 、 Spl ;增强转录的顺式作用元件CAAT-box 、 CCAAT-box、 G-box 、 GC-motif ;胚乳表达的顺式作用元件Skn-l-motif、 GCN4-motif;参与玉米醇溶蛋白代谢相关的顺式作用元件02-site。
所述的启动子具有明显启动子特性，与现已知启动子无同源性，通过瞬间表达证明其能够驱动基因表达，是个全新启动子。
含有的所述的启动子的表达盒、表达载体、细胞系、宿主菌，均属于本发明的保护范围。
能够扩增出所述的启动子任一片段的引物对，均属于本发明的保护范围。
研究所述的启动子在植物中应用方法包括的步骤为启动子下游基因
5'端的未知序列的扩增、启动子片段的克隆、植物表达载体的构建、转化植物、瞬时表达的显微观察，其特征在于，所述的启动子下游基因5'端的扩增未知序列采用YADE法，所述的转化植物的方法是基因枪法。
本发明的有益效果为
本发明中克隆的玉米Z/w尸07基因启动子，研究该启动子在玉米中的转录调控机制以及在抗逆信号途径中的作用，有希望将它直接应用到转基因工程中，改良作物抗逆性状，加快作物的育种进程。
图1:玉米基因组的酶切结果；
图2: YADE法扩增ZmW〃基因5'端未知序列结果；
图3: ZmpW基因5'端调控区序列及其分析结果；
图4: Zm/^7基因启动子的PCR检测结果；
图5: 基因启动子驱动的GFP瞬时表达的显微观察结果。
具体实施例方式
实施例l: YADE法扩增Zm/^7基因5，端未知序列
1.引物的设计与合成
接头序列的设计参照论文《用衔接头PCR克隆新的胡萝卜II型转化酶基因启动子》(王新国，肖成祖，张国华，方荣祥.^^^"激众学与分f主激学叛,2001, 17(1): 61-65.)和《Analysis of differential gene expression bydisplay of 3， end restriction fragments of cDNAs》(Prashar Y, Weissman S M.尸racA^/A^/Sc7'[/AS, 1996,93:659-663.)中所述的方法，设计下述引物接头长链A1: 5' CGGTAGGATCCCGCAGAACGACGCCAG3，；接头短链A2: 5' AGCTCTGGCCCTCCAAGACGC3，；接头引物A3: 5， CGGTAGGATCCCCAGAAC3，；
2. 内切酶的选用
采用CTAB (CTAB:十六烷基三甲基溴化铵)法提取从玉米自交系178的叶片中提取玉米基因组，选用6种常用内切酶BamHI、 EcoRI、HindIII、 Ncol、 Sall、 Xhol，酶切玉米基因组DNA。酶切结果在含0.5昭/ml溴乙啶的1%琼脂糖凝胶上电泳；电泳图如图1所示，泳道M中为DL15000DNA marker,泳道l陽6中分别为BamHI、 EcoRI、 HindIII、 Ncol、 Sall、Xhol对该玉米基因组的酶切结果；表明不同的酶切对玉米DNA的酶切效率各不相同，其中NcoI对玉米DNA酶切后片断较散，另外5种酶酶切较完全。因此，选用这6种酶切产物进行连接和扩增。
3. YADE法扩增》w; n7基因5 ，端未知序列
A:酶切取2昭玉米基因组DNA，用10U的上述6种内切酶按产品说明书的条件按20^1体系酶切过夜，再进行70°C 10min灭活，得到玉米基因组酶切灭活产物；
B. 加接头取2|il接头短链(0.68ug/(xl)，加入5U T4 Polynucleotidekinase, 10mmol/LATP lpl，按产品说明书的条件按lOpl体系加入上述的玉米基因组酶切灭活产物，37。C保温30min，再进行70。C灭活10min;再加入2 pl 10X退火缓冲液，2^接头长链(0.68ug4il)和6^il水，65。C保温10min，慢慢却冷到室温；取2^1接头引物(130ng尔l)和5ng上述玉米基因组酶切灭活产物，加入5U连接酶，16'C连接16h，得到连接产物。
C. YADE法扩增a.第一步线性扩增
根据玉米Zmptil的cDNA设计的特异引物为上游引物5'TGAAGCATTAAACCTCGTGCAG3， ； (Z3)下游弓l物5，AACCATTTCCTTTCTCCTC3'; (Z4)扩增反应体系为总反应体积为25(il:上述的连接产物lpl; 10XPCR
Buffer 2.5^1; dNTPs 200 mol/L; 1.5mmol/L MgCl2; 200mnol/L特异引物；
lUTaq DNA聚合酶；
PCR反应的程序为
94 °C 5min
94 °C30s 、
756°C 30s 40个循环
72 °C 30s 72 °C 7min; 得到线性扩增产物； b.第二步指数扩增-
取l^ll上述的线性扩增产物进行第二步指数扩增，除引物为接头引物 和特异引物外，反应体系中其他成分同上述的线性扩增。PCR反应程序为 94 °C 5min 94°C 30s 、 56°C 30s^ 35个循环 72°C 30s J 72 °C lOmin;
得到指数扩增产物，即为ZmpW基因5'端未知序列；将该ZmpW 基因5'端未知序列在含0.5pg/ml溴乙啶的1%琼脂糖凝胶上电泳检测； 如图2所示，泳道1中为DL15000 DNAmarker,泳道2-7中分别为经内切 酶BamHI、 EcoRI、 HindIII、 Ncol、 Sall、 Xhol酶切玉米基因组酶切灭活 产物的对Zmptil基因5'端延伸的结果；图2中，泳道2-泳道4中均显示 扩增出的长度在750bp和lOOObp之间的片段；将该片段经过测序，可知 该片段为一个长度为S48bp的序列。
D. Zmp"7基因5'端未知序列分析
经相似性分析和比对，上述长度为848bp的Zm;^7基因5，端未知序 列与已知的启动子没有相似性，是个全新的启动子。如图3所示，对上述 长度为848bp的基因5'端未知序列的通过启动子预测软件 PlantCARE对序列进行在线分析(网址为http: 〃 bioinfo腿tics. psb. ugent. be/webtools/plantcare/html)，其中"+"表示该序列的正链，"-"表示该序 列的负链；图3中的分析结果为该序列中，在自5'端第53位至第747 位碱基为该序列的启动子核心序列，在自5'端第590位至第594位碱基 有l个TATA-box，在自5'端第61位至第69位碱基有1个响应脱落酸 ABA的motifIIb序列，在自5'端第505位至第511位碱基有一个响应赤 霉素的GARE-motif序列，在自5'端第584位至第589位碱基有1个 CCAAT-box是MYBHvl转录因子的结合位点。如图3所示，对上述长度为848bp的Zm;^7基因5'端未知序列的序 列结构进一步用PlantCARE软件进行分析；图3中的分析结果为该序列 含有一些与各种信号传导相关的顺式作用元件，如与光应答有关的ACE 、 TGG-motif、 circadian 、I-box 、Spl ，增强转录的CAAT-box 、CCAAT-box、 G-box 、GC-motif ,及胚乳表达的瞬式作用元件Skn-l-motif、 GCN4-motif， 参与玉米醇溶蛋白代谢相关的顺式作用元件02-site等。上述结果表明，该 长度为848bp的ZmpW基因5'端未知序列具有明显的启动子特性，为 Zm; //7基因的启动子。
本实施例中采用YADE法分步扩增得到ZwAz7基因5'端未知序列。 YADE法为一种"Y"形接头延伸未知序列的方法(YADE， Y-shaped Adaptor Dependant Extension)。其原理是接头引物处于"Y"接头的2个分叉单链 上，序列与接头一样，只有与特异引物引导合成了接头的互补序列后，接 头引物才能退火参与扩增。该方法能够减少接头引物的单引物扩增，具有 假阳性低、效率高的优点，理论上能扩出所有目的片段。
实施例2: Z/M/^7基因启动子的克隆
根据上述序列分析后得到Zw/^7基因的启动子，设计了PCR扩增引物 P848上游引物5，-ATTACGCCGTGCCCCGCC-3， P848下游引物5'隱ACCGACCTTTCCTTTGACTTA-3，； PCR扩增反应体系为
扩增反应体系为总反应体积为25nl;玉米基因组DNA50ng; 2.5^1 10 XPCRBuffer; dNTPs 200 mol/L; 1.5mmol/L MgCl2; 200mnol/L特异引物； lplTaqDNA聚合酶. PCR扩增反应程序为 94 °C 5min 94 °C 30s 、
72 °C 10min;
将上述序列的扩增产物在含0.5|ig/ml溴乙啶的1%琼脂糖凝胶上进行 电泳检测；如图4所示，泳道1中为DL2000 DNA marker,泳道2-3中分 别为该Zm;^'7基因的启动子扩增的结果；图4中，泳道2、泳道3中均显示扩增出的该Zm/^7基因的启动子片段；将该片段测序验证正确，并按照
产品T-载体使用说明书中的方法将该ZmpW基因的启动子连接到T载体 上；
将该连接有Zm;^7基因的启动子的T载体转入大肠埃希氏菌 (&c/z^v'c/H'aco//)中，将该含有连接有Zm;^7基因的启动子的T载体的 大肠埃希氏菌命名为Zmptil promoter001，送交中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，登记入册编号(CGMCC No) 为2760，保藏日期为2008年11月24日。
再在所述的P848上游引物和P848下游引物上加入限制性内切酶 HindIII和Spel的酶切位点，PCR扩增得到含有酶切位点的片断并测序验 证结果正确。
实施例2中测序验证含有酶切位点的片断，两端的酶切位点均为 HindIII和SpeI，将该片断分别连接到质粒pGreen0029上，得到中间载体 pGreen0029-848;通过基因重组方法在该长度为848bp的启动子后面引入 绿色荧光标记基因GFP，经过测序验证正确后，得到植物表达载体 pGreen0029-848-GFP。
将所述的瞬时表达载体转化到大肠杆菌DH5a (￡.co//)，扩大培养后
提采用碱裂解法提取质粒，将质粒溶液的浓度调整到lng/|il，用于实施例 4中的转化。
实施例3:植物表达载体基因枪法转化玉米叶片
A. 植物材料准备
a. 玉米植物材料为玉米自交系178;将玉米种子置于30X的NaC10 消毒5分钟，再置于70%的乙醇洗两次，最后用灭菌水洗数次，并置于灭 菌水中过夜，后将种子播种于蛭石中，27匸培养。10天后，植株长到大约 20cm高，叶片约10cm长；将整个植株平铺于板上，叶片置于平板中心，用于
打基因枪。
b. 洋葱切取2cmX4cm的洋葱表皮组织置于MS固体平板培养基上， 27'C暗培养16h后用于打基因枪。
B. 基因枪转化
a.微粒子弹的准备
取50pl金粉至无菌离心管，弹动；加入5^ll质粒(l吗/)11)，弹指混合；加入50|il2.5MCaCl2，弹指混合；加入2(^1亚精胺，弹指混合；继续震荡 2 3min，静置1 min， 1000rpm离心3min，吸去上清；14(^170%乙醇洗 沉淀，吸去上清；140^1无水乙醇洗沉淀，吸去上清；60^1无水乙醇重悬 沉淀，分散颗粒。
b.打基因枪步骤
先用70%乙醇对基因枪(PSD1000/He (Bio-md))表面及样品室进行灭 菌，吹干；同时将可裂膜(临界压力为1300psi)浸泡在异丙醇中进行灭菌， 阻挡网、微弹载体及其固定器、固定工具、托座和镊子等进行高压灭菌(120 °C， 20min);打开氦气瓶总阀，顺时针旋转氦气调节阀，使压力表指针的 示数为1300psi;打开基因枪及变压器开关；将微粒载片固定环中，取DNA 及金粉的混合物加于微粒载片中心，干燥l-3min;安装可裂膜于其托座上， 顺时针拧到气体加速器上；将空间环、阻挡网、阻挡网托座、微粒载片及 固定环(带有微粒的一面朝下)安装好，旋紧盖子，插入枪中；把样品 放在轰击室中，关好门；按动真空键，待真空度至28英寸汞柱(约 88.05-94.82kpa)时，迅速按下"hold"键，接着按住发射键，并保持不动， 直到击发为止；按通气键待真空表回零后，取出样品；最后关机。
用基因枪轰击后，仍将玉米植株和洋葱表皮置于有水的器皿中，同时 保证植株不折、不弯，于黑暗中放置，待显微镜观察。
实施例4: Zm/^7基因启动子瞬时表达的显微观察
将轰击后12-24h的玉米叶片材料和洋葱表皮在激光扫描共聚焦显微 镜(fTCSSP2)下进行分层扫描观察，激发光波长为488nm和568nm，通 过FITC和TRITC滤光器观察并收集GFP荧光。将收集到的GFP荧光图 片转入Adobe Photoshop软件，同时进行叠加。
在激光扫描共聚焦显微镜下进行观察，通过FITC滤光器和TRITC滤 光器分别可以收集叶绿素荧光和GFP荧光。而未经基因枪轰击的玉米叶 片(对照)在显微镜下没有绿色荧光，只看到红色的叶绿素荧光(图略)。
在经包裹有质粒的金粉轰击后的玉米叶片细胞中均看到绿色的GFP 荧光，如图5所示。在细胞中，收集到GFP绿色荧光如图5(A)，叶绿素 的发出红色的荧光图5(B) ， A和B叠加后，红光和两侧光重叠的部分， 显示黄的荧光，如图5(C)。由于玉米叶片较厚，部分明场未扫描到，因 此无清晰明场图，如图5(D)。
11从显微镜观察的结果可以看出，经基因枪轰击后的叶片均能收集到 GFP表达的绿色荧光；在用普通荧光显微镜观察时，848bp长度的片断作 为启动子的瞬时表达载体能够观察到绿色荧光，说明该片段具有启动子功 能。
实施例1至实施例4中，各种限制性内切酶、T4DNA连接酶、TaqDNA 聚合酶均购自Takara公司；DL2000+15000Marker购自Takara公司；植物 表达载体pGreen0029、 DNA纯化试剂盒、T-载体试剂盒、凝胶回收试剂盒 均购自Promega公司；CTAB等其他常规生化试剂购自北京经科宏达生物 技术公司和北京欣经科生物技术公司。
实施例1至实施例4中，PCR引物合成和DNA测序工作均由上海生 工生物工程技术服务有限公司完成。
实施例1至实施例4中，所述的PCR反应使用PTC-100 Peltier Thermal Cycler基因扩增仪，购自MJ Research Inc公司；所述的琼脂糖凝胶电泳使 用UVP Gel Documentation凝胶分析系统，购自基因公司；所述的琼脂糖 凝胶电泳使用DYCP-31DN电泳仪，购自北京六一仪器公司。
实施例1至实施例4中，所采用的DNA提取、PCR、酶切、连接、 转化等基因工程基本操作方法记载于《分子克隆实验指南第三版》中((美〕 J.萨姆布鲁克等著，科学出版社，2002年出版)，和《植物基因工程原理 与技术》中(王关林，方宏筠著，科学出版社,1998)。<110>北京市农林科学院
<120> <210> 1 <211>848 <212>DNA
<213>玉米属玉米(Ze緒，L.) <400> 1
cgccgtgccccgccgtcgscccgcctcsggt333CCCCtCtgctctctctctctccgtct60
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ttttctcgtttgcstgtcc3C3tgtsgstg33gtg3C3ctttttagtcas3sttggtgta780
ttstggct33cttgttctctttcgc3tcgstggc3t3g33gtcsaaggsa840
3ggtcggt848
权利要求
1. 一种玉米Zmptil基因启动子，其特征在于是下列核苷酸序列之一A. 序列表中的SEQ ID №1；B. 与序列表中的SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性的DNA序列；C. 在高严谨条件下可以与序列表SEQ ID №1限定的DNA序列杂交的序列。
2. 根据权利要求l所述的玉米Zm;^7基因启动子，其特征在于 所述的SEQIDNq: l中，在自5'端第53位至第747位碱基为该序列的启动子核心序列，在自5，端第5卯位至第594位碱基有1个TATA-box, 在自5'端第61位至第69位碱基有1个响应脱落酸ABA的motif lib序歹!j， 在自5'端第505位至第511位碱基有一个响应赤霉素的GARE-motif序列， 在自5'端第584位至第589位碱基有1个CCAAT-box是MYBHvl转录 因子的结合位点。
3. 根据权利要求2所述的玉米Zm/^7基因启动子，其特征在于所 述的SEQIDNq: l中，含有与信号传导相关的顺式作用元件。
4. 根据权利要求3所述的玉米Zm内//基因启动子，其特征在于所 述的与信号传导相关的顺式作用元件为与光应答有关的顺式作用元件 ACE 、 TGG-motif、 circadian 、 I-box 、 Spl ;增强转录的顺式作用元件 CAAT-box 、 CCAAT-box、 G-box 、 GC-motif ;胚乳表达的顺式作用元 件Skn-l-motif、 GCN4-motif;参与玉米醇溶蛋白代谢相关的顺式作用元 件02-site。
5. —种表达盒，其特征在于含有权利要求1或2或3或4所述的启动子。
6. —种表达载体，其特征在于含有权利要求1或2或3或4所述的 启动子。
7. —种细胞系，其特征在于含有权利要求1或2或3或4所述的启 动子。
8. —种宿主菌，其特征在于含有权利要求1或2或3或4所述的启动子。
9. 一种引物对，其特征在于含有权利要求1或2或3或4所述的启 动子的任一片段。
10. —种玉米Zm;^7基因启动子的应用，其特征在于将根据权利要 求1或2或3或4所述的基因转入玉米中，得到抗逆性玉米。
全文摘要
本发明提供一种玉米Zmpti1基因启动子及其应用，该启动子序列经分析发现含有与胁迫相关的转录因子的结合位点，ZmPti1基因在玉米中受到该启动子的调控，参与了逆境信号的传导途径。本发明构建了瞬时表达载体，该启动子的瞬时表达的结果显示，该启动子是有功能的启动子。本发明的有益效果为研究该启动子在玉米中的转录调控机制以及在抗逆信号途径中的作用，有希望将它直接应用到转基因工程中，改良作物抗逆性状，加快作物的育种进程。
文档编号C12N15/29GK101475941SQ20081022759
公开日2009年7月8日 申请日期2008年11月28日 优先权日2008年11月28日
发明者吴忠义, 张秀海, 李春华, 梁宏霞, 王永勤, 黄丛林 申请人:北京市农林科学院