一种重组蓝藻的制作方法

专利名称：一种重组蓝藻的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种重组蓝藻。
背景技术：
全球面临的能源问题、环境问题向人们提出了发展可再生清洁能源的要求，而粮 食短缺问题又要求可再生清洁能源的发展要实现不与人争粮、不与作物争地、不与人和作 物争淡水。 丁醇(butanol)是一种重要的化工原料，主要用于制造增塑剂、溶剂、萃取剂等， 是一种高附加值化学品，全球年需求量超过140万吨。此外，丁醇还是一种极具潜力的新型 生物燃料，具有如下优点其热值、辛烷值与汽油相当，含氧量与汽油中常用的甲基叔丁基 醚相近；其不腐蚀管道，便于管道输送；其蒸汽压低，安全性高，能与汽油以任意比混合。
丁醇可由发酵和石油化工合成法生产，由于石油危机，丁醇发酵生产成为研究热 点。发酵生产主要是通过丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)发酵粮食生产丁 醇。从70年代起三十几年的研究，阐明了丙酮丁醇梭菌的丁醇代谢途径，使丁醇发酵生产 取得了很大进展。但丁醇发酵生产存在发酵底物成本高、产物丁醇中混杂有丙酮、丙酮丁醇 梭菌严格厌氧及丁醇对细胞有毒害等缺点。因此，科学家们在改进发酵生产丁醇的同时也 在探索用非厌氧菌生物合成丁醇。美国和日本的科学家先后将丙酮丁醇梭菌的丁醇合成途 径导入大肠杆菌中，并得到有丁醇产生的菌株。这种方法虽然解决了梭菌发酵生产丁醇时 产物中混有丙酮和产丁醇梭菌的严格厌氧不利于操作的问题，但大肠杆菌仍为异养菌，其 原料成本依然很高，没有解决发展生物能源与粮食问题的冲突。 蓝藻(blue-green algae)又称蓝细菌(cyanobacteria)，是可以进行放氧光合作 用的原核生物。蓝藻能够利用二氧化碳和太阳能快速繁殖，而且其广泛分布在淡水、海水甚 至是污水中，是生物合成能源产品的理想宿主。作为原核生物，蓝藻细胞结构简单、遗传背 景与大肠杆菌相似，易于基因操作。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种产丁醇的重组蓝藻。 本发明所提供的重组蓝藻，是通过包括如下步骤的方法得到的重组蓝藻向蓝藻 中导入如下1)、2)或3)中所述的丁醇合成相关基因 1)所述丁醇合成相关基因包括如下酶的编码基因电子转移黄素蛋白A亚基、烯 酰水合酶(又称烯酰辅酶A水合酶)、丁酰辅酶A脱氢酶、乙醇脱氢酶； 2)所述丁醇合成相关基因包括如下酶的编码基因电子转移黄素蛋白B亚基、烯 酰水合酶、丁酰辅酶A脱氢酶、乙醇脱氢酶； 3)所述丁醇合成相关基因包括如下酶的编码基因电子转移黄素蛋白A亚基、电
子转移黄素蛋白B亚基、烯酰水合酶、丁酰辅酶A脱氢酶、乙醇脱氢酶。 所述丁醇合成相关基因还可包括如下酶的编码基因3-羟丁酰辅酶A脱氢酶和/或乙酰辅酶A乙酰转移酶(又称硫解酶)和/或丁醇脱氢酶。 所述方法还可包括灭活所述蓝藻中的至少一个聚-13羟基丁酸酯合成相关基因 的步骤。 所述灭活的方法可为用至少一个的所述丁醇合成相关基因替换至少一个的所述 聚-P羟基丁酸酯合成相关基因。 所述聚-P羟基丁酸酯合成相关基因具体可为聚-13羟基丁酸酯合成酶的编码基 因；所述灭活的方法具体可为用所述乙醇脱氢酶的编码基因替换所述聚_3羟基丁酸酯合 成酶的编码基因。 所述灭活的方法可以是通过同源重组实现的。 本发明方法中导入的丁醇合成相关基因可以自行通过复制型重组质粒来进行表
达(即不包括灭活所述色球藻科蓝藻中的至少一个聚-P羟基丁酸酯合成相关基因的步骤
的情况)，也可以整合到染色体上进行表达(即包括灭活所述色球藻科蓝藻中的至少一个
聚-13羟基丁酸酯合成相关基因的步骤情况)，或者二者同时进行。 所述各酶可以是如下氨基酸序列的蛋白质 所述烯酰水合酶为如下1)或2)所述的蛋白质 1)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质； 2)将序列表中序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加且具有烯酰水合酶功能的由1)衍生的蛋白质；
所述丁酰辅酶A脱氢酶为如下a)或b)所述的蛋白质
a)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质； b)将序列表中序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加且具有丁酰辅酶A脱氢酶功能的由a)衍生的蛋白质；
所述电子转移黄素蛋白B亚基为如I或II所述的蛋白质
I由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质； II将序列表中序列5的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加且具有电子转移黄素蛋白B亚基功能的由I衍生的蛋白质；
所述电子转移黄素蛋白A亚基为如下i或ii所述的蛋白质
i由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质； ii将序列表中序列6的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加且具有电子转移黄素蛋白A亚基功能的由i衍生的蛋白质；
所述3-羟丁酰辅酶A脱氢酶为如下①或②所述的蛋白质
①由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质； ②将序列表中序列7的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失
和/或添加且具有3_羟丁酰辅酶A脱氢酶功能的由①衍生的蛋白质； 所述丁醇脱氢酶为如下A或B所述的蛋白质 A.由序列表中序列8所示的氨基酸序列组成的蛋白质； B.将序列表中序列8的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加且具有丁醇脱氢酶功能的由A衍生的蛋白质；
所述乙醇脱氢酶为如下A)或B)所述的蛋白质
A)由序列表中序列9所示的氨基酸序列组成的蛋白质； B)将序列表中序列9的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加且具有乙醇脱氢酶功能的由A)衍生的蛋白质； 所述乙酰辅酶A乙酰转移酶(又称硫解酶)为如下(1)或(2)所述的蛋白质 (1)由序列表中序列10所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (2)将序列表中序列10的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺 失和/或添加且具有乙酰辅酶A乙酰转移酶功能的由(1)衍生的蛋白质。 所述导入的各酶的核苷酸序列可以如下 所述烯酰水合酶的编码基因为如下1) 、2)或3)所述的基因 1)其核苷酸序列为序列表中序列1自5'末端第1-786位核苷酸的DNA分子； 2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子； 3)与1)限定的DNA序列有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子； 所述丁酰辅酶A脱氢酶的编码基因为如下a) 、 b)或c)所述的基因 a)其核苷酸序列为序列表中序列1自5'末端第800-1939位核苷酸的DNA分子； b)在严格条件下与a)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子； c)与a)限定的DNA序列有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子； 所述电子转移黄素蛋白B亚基的编码基因为如I、 II或III所述的基因 I其核苷酸序列为序列表中序列1自5'末端第1958-2737位核苷酸的DNA分子； II在严格条件下与I限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子； III与I限定的DNA序列有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子； 所述电子转移黄素蛋白A亚基的编码基因为如下i、 ii或iii所述的基因 i其核苷酸序列为序列表中序列1自5'末端第2756-3766位核苷酸的DNA分子； ii在严格条件下与i限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子； iii与i限定的DNA序列有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子； 所述3-羟丁酰辅酶A脱氢酶的编码基因为如下①、②或③所述的基因 ①核苷酸序列为序列表中序列1自5'末端第3871-4719位核苷酸的DNA分子； ②在严格条件下与①限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子； ③与①限定的DNA序列有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子； 所述乙醇脱氢酶的编码基因为如下A、 B或C所述的基因 A.其核苷酸序列为序列表中序列2自5'末端第610-3186位核苷酸的DNA分子； B.在严格条件下与A限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子； C.与A限定的DNA序列有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子； 所述丁醇脱氢酶的编码基因为如下(1) 、 (2)或(3)所述的基因 (1)其核苷酸序列为序列表中序列11所示的DNA分子； (2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子； (3)与(1)限定的DNA序列有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子； 所述乙酰辅酶A乙酰转移酶的编码基因为如下(1) 、 (2)或(3)所述的基因 (1)其核苷酸序列为序列表中序列12所示的DNA分子； (2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；
(3)与(1)限定的DNA序列有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子；
本发明中所用的出发菌可以蓝藻门中的任一蓝藻，具体可以是色球藻科蓝藻，具 体可如色球藻科蓝藻为淡水蓝藻聚球藻6803(Synechocystis sp. PCC 6803)和海水蓝藻聚 球藻7002(Synechococcus sp. PCC 7002)。 本发明中得到的重组蓝藻具体为蓝藻集胞藻(Synechocystis sp. ) SMB-100CGMCC No.2795和聚球藻(Synechococcus sp.)SMB-101 CGMCC No. 2794。 蓝藻集胞藻(Synechocystis sp. )SMB-IOO已于2008年12月10日保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址北京市朝阳区大屯路，中国 科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No. 2795。 聚球藻(Synechococcus sp. )SMB-lOl已于2008年12月10日保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址北京市朝阳区大屯路，中国科学 院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No. 2794。 本发明利用了蓝藻可以进行光合自养的特性、可以在海水和污水中生长的特性及 易于进行基因操作的优点。 本发明对蓝藻代谢途径进行改造和重建，在蓝藻中建立丁醇合成途径，使其具有 产丁醇的能力。这样构建的重组蓝藻根据其自身的光合自养的特点来大量繁殖，从而产生 更多的能源产品丁醇。本发明中使用蓝藻自身的诱导启动子，在控制丁醇合成途径的同时 又避免了丁醇对蓝藻的毒害作用。 本发明实现了利用蓝藻将地球上取之不尽的太阳能和温室气体二氧化碳转化为 能源产品丁醇，避免了能源再生过程中对粮食等其它有机物的浪费，同时又有利于环境保 护。因此，利用本发明重组蓝藻来生产丁醇是实现可再生清洁能源持续、健康发展的理想途 径之一。


图1为重组蓝藻SMB-100的鉴定。 图2为标准品中丁醇的色谱图。 图3为重组蓝藻8MB-100培养液中丁醇的色谱图。 图4为重组蓝藻SMB-101的鉴定。
具体实施例方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从生物公司购买。 下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。 本发明的总体构思如下 —、通过代谢工程改造，在蓝藻中建立丁醇合成途径 1、从丙酮丁醇梭菌中克隆丁醇合成途径中所需酶的编码基因烯酰水合酶 (crt) 、 丁酰辅酶A脱氢酶(bed)、电子转移黄素蛋白B亚基(etfB)、电子转移黄素蛋白A亚 基(etfA) 、3-羟丁酰辅酶A脱氢酶(hbd)和乙醇脱氢酶(adhe)。其中前五个基因crt、bcd、 etfB、 etfB和hbd为一个操作子，将其命名为命名为crt操纵子。
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2、在蓝藻中诱导表达crt操纵子构建蓝藻表达载体pAM-crt，使crt操纵子在蓝 藻内源铜诱导启动子的启动下，在蓝藻中诱导表达。 3、在蓝藻中表达乙醇脱氢酶基因(adhe):通过同源重组，将adhe基因整合在蓝藻 基因组DNA上，并使其表达。 二、工程蓝藻的鉴定及丁醇的诱导合成与检测 1、基因水平鉴定上述丁醇合成途径所需酶的编码基因已成功转入蓝藻中； 2、通过诱导激活工程藻中建立的丁醇合成途径，使工程藻产丁醇；通过液相色谱
检测工程蓝藻中有丁醇产生。 下述实施例中，出发菌分别为色球藻科集胞藻属淡水蓝藻集胞藻 6803 (Synechocystis sp. PCC 6803)(Zhang S， Spann KW， et al. Identification oftwo genes， sll0804 and slrl306， as putative components of theC02—concentrating mechanism in the cyanobacterium Synechocystis sp. strainPCC 6803.J Bacteriol. 2008 190 :8234-7 ;)(中国科学院微生物研究所)和色球藻科聚球藻属海水蓝 藻聚球藻7002(Synechococcus sp. PCC 7002) : (Tin Z, Hei皿ickel M, et al. Biogenesis of iron—sulfur clusters in photosystem I :holo—NfuA from the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002 r即idly andefficiently transfers [4Fe_4S] clusters to 即o-PsaC in vitro. .T Biol Chem. 2008,283 :28426-35)(中国科学院微生物研究所)。
丙酮丁醇梭菌为丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) ATCC824(US2007020740(A1));蓝藻表达载体pAM2770 (Wu X， Li DW， et al. The Anabaenasp. strain PCC 7120 asrl734 gene encodes a negative regulator of heterocystDevelopment. Molecul Microbiol. 2007,64 :782-794.)(中国科学院微生 物石开究所)；质茅立pRL271 (Wei TF， Ramasubramanian TS， et al. Anabaena sp. strain PCC7120 ntcA Gene required for growth on nitrate and heterocyst development. JBacteriol. 1994， 176 :4473-4482.)。(中国科学院微生物研究所)。 下述实施例中Synechocystis sp. PCC 6803及其工程菌转化、筛选及培养时所用 培养基为BG-11培养基，基因工程菌株筛选时添加lOii g/ml的卡那霉素和lOii g/ml的氯霉素。 下述实施例中Synechococcus sp. PCC 7002及其工程菌转化、筛选及培养时所用 培养基为Medium 957培养基，基因工程菌株筛选时添加10 y g/ml的卡那霉素和10 y g/ml 的氯霉素。 BG-11培养基组成每升培养基中含有NaN031.5g， K2HP040 . 04g， MgS04 7H200. 075g， CaCl2 2H20 0. 036g，拧檬酸0. 006g，拧檬酸铁铵0. 006g， EDTA(disodiumsalt)O. 001g，Na2C030 . 02g， Trace metal mix A5 1. 0ml，琼脂10. 0g，蒸馏水 1. 0L， pH 7. 1±0. 3。 Medium 957培养基组成每升培养基中含有蒸馏水250. 0ml，海水750. Oml， MgS04 7H20 0. 04g， CaCl2 2H20 0. 02g， NaN03 0. 75g， K2HP04 3H20 0. 02g，拧檬酸3. 0mg， 柠檬酸铁铵3. 0mg， EDTA(disodium potassium salt)乙二胺四乙酸0. 5mg， Na2C030 . 02g， Trace metal mix A5 1. 0ml，琼月旨10. 0g， pH 8. 5±0. 3。Trace metal mix A5组成每升中含有1138032 . 86g，MnCl2 *4H20 1. 81g， ZnS04 *7H200. 222g， NaMo04 2H20 0. 39g， CuS04 5H20 0. 079g， Co(N03)2 6H2049. 4mg，蒸馏水1. 0L。
实施例1、色球藻科集胞藻属(Synechocystis)淡水蓝藻集胞藻的重组构建
本实施例中使用的出发蓝藻为淡水蓝藻集胞藻6803 (Synechocystis sp.PCC6803)。 —、向出发菌中导入丁醇合成相关基因 本实验中的丁醇合成相关基因由crt基因、bcd基因、etfB基因、etfA基因和hbd
基因组成，组成一个crt操纵子，各基因均来自梭菌。 1 、 crt操纵子的扩增 提取丙酮丁醇梭菌基因组DNA; 根据丙酮丁醇梭菌基因组中crt操纵子DNA序列和蓝藻表达载体pAM2770上的酶 切位点设计引物如下 crtF :ATTC GAGCTC AATGGAACTAAACAATGTCATCCT (下划线部分为Sacl酶切位点)；
crtR :CG GGATCC ATGGGGATTCTTGTAAACTTATT (下划线部分为BamHI酶切位点)。
以丙酮丁醇梭菌基因组DNA为模板、以crtF和crtR为引物，进行PCR扩增；对扩增 产物进行测序，得到的基因的序列如序列表中序列l所示，表明扩增产物为有crt基因、bcd 基因、etfB基因、etfA基因和hbd基因的crt操纵子，序列正确，其中自序列1的5'末端第 1-786位核苷酸为crt基因的序列，第800-1939位核苷酸为bed基因的序列，第1958-2737 核苷酸为etfB基因的序列，第2756-3766位核苷酸为etfA基因的序列，第3871-4719位核 苷酸为hbd基因的序列。 2、重组蓝藻表达载体pAM-crt的构建 为避免丁醇对蓝藻生长的毒害作用，使用蓝藻内源启动子铜诱导启动子petE在 蓝藻中诱导表达crt操纵子。 用限制性内切酶Sacl和BamHI酶切上述crt操纵子；用限制性内切酶Sacl和
BamHI酶切蓝藻表达载体pAM2770，回收大片段；将两酶切产物连接，连接产物转化至大肠
杆菌中，通过50ii g/ml卡那霉素筛选，得到重组质粒。重组质粒序列分析结果表明，crt操
纵子正确插入到pAM2770载体上铜诱导启动子petE下游Sacl和BamHI位点，并且插入的
序列正确，将正确的阳性重组蓝藻表达载体命名为pAM-crt。 3、pAM-crt对蓝藻Synechocystis sp. PCC 6803的转化及筛选 转化方法具体步骤为收集处于对数生长期的蓝藻细胞，用培养基BG-ll洗涤细
胞后，将质粒pAM-crt加入到蓝藻培养液中混匀，光照下静止培养5小时； 筛选在含有卡那霉素的固体BG-ll培养基平板上筛选重组子，卡那霉素筛选浓
度为10 y g/ml ; 将得到的阳性重组蓝藻命名为PCC 6803/pAM-crt。4、空载体pAM2770对蓝藻Synechocystis sp. PCC 6803的转化及筛选 转化方法具体步骤为收集处于对数生长期的蓝藻细胞，用培养基BG-ll洗涤细
胞后，将质粒pAM2770加入到蓝藻培养液中混匀，光照下静止培养5小时。 筛选在含有卡那霉素的固体BG-ll培养基平板上筛选重组子，卡那霉素筛选浓
度为lOii g/ml。； 将得到的含空载体的重组蓝藻命名为PCC 6803/pAM2770。
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二、用丙酮丁醇梭菌丁醇合成途径中adhe基因替换蓝藻Synechocystis sp. PCC 6803中PHB合成酶基因 由于蓝藻中存在聚羟基丁酸(PHB)次级代谢途径，PHB合成与丁醇合成有共同 的前体，而PHB合成酶的敲除不影响蓝藻生长，因此，用丁醇合成途径中最后一个酶乙醇 脱氢酶基因(adhe)来取代蓝藻基因组中的PHB合成酶基因(phb)，构建整合表达载体 pUC-up-adhe-Cm-down，通过同源重组，用adhe和氯霉素抗性基因(Cm)取代蓝藻PHB合成 酶基因。 1、蓝藻同源重组整合表达载体pUC-up-adhe-Cm-down的构建
adhe基因的获得以丙酮丁醇梭菌的基因组DNA为模板，用下述引物(adheF/ adheR)进行PCR扩增，PCR产物测序，得到adhe基因，其核苷酸序列如序列表中序列2中第 610-3186位核苷酸所示。 up为蓝藻基因组DNA中phb编码区上游的600bp DNA片段，通过以下方法获得 以淡水蓝藻集胞藻6803(Synechocystis sp. PCC 6803)的基因组DNA为模板，用下述引物 进行PCR扩增，PCR产物测序，得到up序列，其核苷酸序列如序列表中序列2中第1-609位 核苷酸所示。 down为蓝藻基因组DNA中phb编码区下游的600bp DNA片段，通过以下方法获得 以淡水蓝藻集胞藻6803(Synechocystis sp. PCC 6803)的基因组DNA为模板，用下述引物 (downF/downR)进行PCR扩增，PCR产物测序，得到down序列，其核苷酸序列如序列表中序 列2中第4402-4996位核苷酸所示。Cm序列的获得以质粒pRL271为模板，用下述引物(CmF/CmR)进行PCR扩增，PCR 产物测序，得到Cm序列，其核苷酸序列如序列表中序列2中第3352-4401位核苷酸所示。
up-adhe的获得首先PCR分别扩增得到up和adhe，然后再把两片段混在一起作 模板，用upF/adheR引物对进行第二轮PCR扩增，得到up-adhe ; Cm-down的获得首先PCR分别扩增得到Cm和down,然后再把两片段混在一起作 模板，用CmF/downR引物对进行第二轮PCR扩增，得到Cm-down ;; pUC-up-adhe-Cm-down的获得用限制性内切酶Xbal酶切Cm-down，用限制性 内切酶Xbal酶切pUC-18载体，连接得到重组载体pUC-18/Cm-down ;用限制性内切酶 BamHI酶切up-adhe，用限制性内切酶BamHI酶切pUC-18/Cm-down，连接得到重组载体 pUC_up_adhe_Cm_down 。 阳性质粒的转化及筛选用pUC-up-adhe-Cm-down转化大肠杆菌，经50 y g/ml氨 节霉素和30 g/ml氯霉素筛选阳性克隆。 阳性质粒的验证将筛选得到的阳性质粒进行测序，表明插入的up-adhe-Cm-down
序列如序列表中序列2所示，得到载体pUC-up-adhe-Cm-down正确； 扩增各片段及融合PCR所需引物如下卯F :5， -CGCGGATCCCAGATTCGGTCTTCCCCCAGGCG (BamHI) 卯R : 5 ， -CTTTTTGATTTGTAACTTTCATGGTCAAAATCCACCTTACTACTGGC (up-adhe融合所 需嵌合引物)adheF :5' -ATGAAAGTTACAAATCAAAAAGAadheR :5' —CGCGGATCCAAAGAATTGTGGAGTAAAGGATA(BamHI)
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CmF :5' -GCTCTAGAGGTTGATAATGAACTGTGCTGAT(Xbal)CmR:5' -GTTGCCCTAATGTATTCCAGCAAATCGAATTTCTGCCATTCATCCG (Cm-down融合所需嵌合引物) downF:5' -TTGCTGGAATACATTAGGGCAAC downR :5' -GCTCTAGAGATATCGAAGCGGACAACGGCAT (Xbal) 2、将pUC-up-adhe-Cm-down转化至实验一中的重组蓝藻PCC 6803/pAM_crt中
转化方法具体步骤为收集处于对数生长期的重组蓝藻PCC 6803/pAM-crt细胞， 用培养基BG-11洗涤细胞后，将质粒pUC-up-adhe-Cm-down加入到细胞液中混匀，光照下静 止培养5小时。 筛选在含有氯霉素的固体BG-ll培养基平板上筛选重组子，氯霉素筛选浓度为 lOii g/ml ;将筛选得到的重组蓝藻命名为SMB-IOO。 同时向蓝藻PCC 6803/pAM2770中转入空载体pUC-18，将得到的重组蓝藻命名为
PCC 6803/pAM2770/pUC，作为对照；同时向蓝藻PCC 6803中转入空载体pUC18，作为对照，
将得到的重组蓝藻命名为PCC 6803/pUC。三、重组蓝藻SMB-100的验证及目标产物丁醇的检测 (1)基因水平鉴定 分别提取蓝藻SMB-100、PCC 6803/pAM2770、PCC 6803/pUC和PCC 6803/pAM2770/ pUC的总DNA ;再分别以crtF、 crtR和phb700F、 phb700R(蓝藻PHB合成酶基因的上下 游700bp处设计的引物)为引物，进行PCR扩增。结果如图IA所示，在SMB-100中用引 物crtF、 crtR扩增得到4. 7kb的DNA片段，大小与crt操纵子一致；在对照组中用引物 crtF、 crtR没有扩增到条带，表明上述丁醇合成途径所需酶的编码基因crt操纵子已成 功转入蓝藻SMB-IOO中。结果如图IB所示，在SMB-100中，用引物phb700F、 phb700R扩 增得到5. 3kb的DNA片段，大小与up-adhe-Cm-down 一致；在对照组中用引物phb700F、 phb700R扩增到3.4kb片段，该片段为PHB合成酶基因(2kb)及其上下游700bp，这表明 adhe基因已成功转入蓝藻SMB-100中，并且adhe基因已通过同源重组成功取代PHB合 成酶基因。(图1中，A为crt操纵子导入重组蓝藻SMB-100的鉴定，泳道1 :DNA Maker 入DNA/HindIII，泳道2 :SMB-IOO，泳道3 :对照组PCC 6803/pAM2770，泳道4 :对照组PCC 6803/pUC、泳道5 :对照组PCC 6803/pAM2770/pUC ;B为adhe基因整合到SMB-100基因 组的鉴定，泳道1 :DNA Maker入DNA/HindIII，泳道2 :SMB-IOO，泳道3 :对照组PCC6803/ pAM2770，泳道4 :对照组PCC 6803/pUC，泳道5 :对照组PCC6803/pAM2770/pUC) 。 phb700F : 5， -TACAACATTTTTCTGTAGGC-3，， phb700R :5， -ATGTCGCCTATCAACTGTTGA-3，。
(2)重组蓝藻SMB-100生产丁醇性能的检测 将重组蓝藻SMB-100接种于不含铜的BG-11培养基中，在30。C 、60 iimol m—2s—1光 照、振荡的条件下培养至对数生长后期，使其细胞密度达到0D73。 = 1. 5 ;向培养液中加入 2 M CuS04使铜诱导启动子petE启动adhe基因和crt操纵子的表达，进而诱导丁醇合成； 在铜诱导48小时后，取培养液进行液相色谱检测。 液相色谱检测方法为样品前处理取培养液12000rpm离心lmin，取上清液， 用0. 22 ii m滤膜过滤；色谱条件:Agilent 1200液相色谱仪，示差检测器;BioRadAminex HPX-87H有机酸柱(300*7. 8mm)，柱温15 °C ;上样量10iU ;流动相为O. 05mM H2S04，流速0. 5ml/min。 丁醇标准品购自Sigma公司(目录号4C006217);在如上色谱条件下标准品中丁
醇的保留时间为40. 9分钟，丁醇标准品的检测图谱如图2所示(A表示丁醇)。 重组蓝藻SMB-100培养液的上清的检测图谱如图3所示(A表示丁醇)。 实验设3次重复，结果取平均数。结果表明，工程藻SMB-100生产丁醇的能力为
0. 27g/L培养液。 实施例2、色球藻科聚球藻属海水蓝藻聚球藻7002的重组构建 本实施例中使用的出发蓝藻为海水蓝藻聚球藻7002 (Synechococcus
sp.PCC7002)。 —、向出发菌中导入丁醇合成相关基因 导入基因的序列及导入方法均与实施例1中一所述一致。转入空载体pAM2770的重组蓝藻命名为PCC 7002/pAM2770。 二、用梭菌丁醇合成途径中adhe基因替换蓝藻Synechocystis sp. PCC 6803中 PHB合成酶基因 方法均与实施例1中二所述一致。 既导入空载体pAM2770又导入空载体pUC18的蓝藻命名为PCC7002/pAM2770/pUC，
作为对照；向蓝藻PCC 7002中转入空载体pUC18的蓝藻命名为PCC 7002/pUC。 将得到的含有adhe基因和crt操纵子的重组蓝藻命名为SMB-lOl。 三、蓝藻SMB-101的验证及目标产物丁醇的检测 (l)基因水平鉴定 鉴定方法与实施例1中三所述一致。 结果如图4A所示，在SMB-101中用引物crtF、crtR扩增得到4. 7kb的DNA片段，大 小与crt操纵子一致；在对照组中用引物crtF、crtR没有扩增到条带，表明上述丁醇合成途 径所需酶的编码基因crt操纵子已成功转入蓝藻SMB-101中。结果如图4B所示，在SMB-101 中，用引物phb700F、 phb700R扩增得到5. 3kb的DNA片段，大小与up-adhe-Cm-down —致； 在对照组中用引物phb700F、phb700R扩增到3. 4kb片段，该片段为PHB合成酶基因(2kb)及 其上下游700bp这表明adhe基因已成功转入蓝藻SMB-101中，并且adhe基因已通过同源重 组成功取代PHB合成酶基因。(图4中，A为crt操纵子导入重组蓝藻SMB-101的鉴定，1 : DNA Maker ADNA/Hindlll ;2 :SMB-lOl ;3 :对照组PCC 7002/pAM2770， 4 :对照组PCC 7002/ pUC，5 :对照组PCC 7002/pAM2770/pUC ;B为adhe基因整合到SMB-101基因组的鉴定，1 :DNA Maker ADNA/Hindlll ;2 :SMB-lOl ;3 :对照组PCC 7002/pAM2770， 4 :对照组PCC 7002/pUC， 5 :对照组PCC 7002/pAM2770/pUC)。 phb700F :5' -TACAACATTTTTCTGTAGGC-3， ， phb700R : 5， -ATGTCGCCTATCAACTGTTGA-3，。
(2)重组蓝藻SMB-101生产丁醇性能的检测 将重组蓝藻SMB-101接种于不含铜的Medium 957培养基中，在30 °C 、 60 molm—2s—1光照、振荡的条件下培养至对数生长后期，使其细胞密度达到0D73。 = 1. 5 ;向 培养液中加入2 M CuS04使铜诱导启动子petE启动adhe基因和crt操纵子的表达，进而 诱导丁醇合成；在铜诱导48小时后，取培养液进行液相色谱检测。
色谱检测方法及条件同实施例1中三一致。
实验设3次重复，结果取平均数。结果表明，工程藻SMB-101生产丁醇的能力为
0. 22g/L培养液。 序列表 〈210>1 〈211>4736 〈212>DNA 〈213〉梭菌属丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) 〈400〉 1atgg皿cteaacaatgtcatg皿ggte皿gttgctgtegtteccatteac603gaccte皿gcatteaatgcgatecacte3ttetgttete120ggtg腿ttgcgaagtecttgcagteatttteactggagc180tcatttgtegC3gg3gC3g3tetttctgagtgaateccattg皿ggt卿240tecttgga皿teaagtgttt3g皿gattegaacttcttgaa皿gcctgte300ategcagctgtteatggttttgcttteggaggcggatgcga皿tegctetgtcttgtgat360ateag皿tegcttcaagcaacgcaagatttggtc皿ccag皿gteggtctcgg皿teac3420cctggttttggtggtecac3aagactttcaagattegttgg皿tgggratggC皿3gC3g■cttetetttectgcac皿皿tete皿ggcateag皿tcggacttgteaat540皿ggtegteg皿cctegtga600agcaatgctccagtegctgtteagtteagc皿3caggctetteategagg皿tgcagtgt660gatettgatectgctttegcatttgaatcag皿gcatttggag皿tgctt720gatc皿皿ggagctttcategag皿皿g皿780卿tegg郷tggatttteattteac皿gategteagac3840gatggtt卿gaatttgctggC3gC3g皿3ttgatga皿c■皿tgggtragtetggtetgatgggaattcc960gagtetggtggcgc郷tggagatgtettetcgccgttga1020gg皿ttetca皿ggtttgcggtectecaggagttettctttcagcacatecatcactttg1080tgcttcatte3tggtec3gategteccttt1140agcte皿ggtgtgcttetggCC3皿tgC3gg皿cagattc1200tgg3gC3C皿ctgtecttga12603cteatggaggagttgc卿tecttttgttatetttgcaa1320tetcagcattteteateg皿aaggtttctc1380agcttgg皿ttcaacaactgaacttgtett1440tg皿gatetgategteccaggattggte皿g皿gg皿皿ggcttccctet1500actcttgatggagg皿g皿ttggtetegcagctcaagcttteggtetegc1560tg皿ggtgctc皿gagctteC3tg皿gg3gttgg皿g皿g1620ccttgacaaattccaaggtcttgcatggatgatggc卿t3tgg3tgtegctetegaatc1680agctegatet皿gc3gcategcaggacttccatecacagt1740tgatgctgca3gagcteagcttcatgctgca皿tgtegc3atggatgteac皿cteaggc1800agtec皿ttetttggtggatacggatetecg皿tgatgag1860
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15
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GlyPheLysAsnArg260〈210>4〈211>378〈212>PRT〈213〉梭菌属丙酮丁酉享梭菌(Clostridium acetobutylicum)〈400>4MetAspPheAsnLeuThrArgGluGin GluLeu Val ArgGinMet Val151015
ArgGluPheAlaGluAsnGluValLys Prolie Ala AlaGlulie Asp202530GluThrGluArgPheProMetGluAsn ValLys Lys MetGlyGin Tyr354045GlyMetMetGlylieProPheSerLys GluTyr Gly GlyAlaGly Gly505560AspValLeuSerTyrlielieAlaVal GluGlu Leu SerLysVal Cys65707580GlyThrThrGlyVallieLeuSerAla HisThr Ser LeuCysAla Ser859095
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20
〈400>5MetAsnlieValValCysLeuLys Gin ValPro Asp Thr Ala GluVal151015ArglieAspProValLysGlyThr Leu lieArg Glu Gly ValProSer202530lielieAsnProAspAspLysAsn Ala LeuGlu Glu Ala LeuValLeu354045LysAspAsnTyrGlyAlaHisVal Thr Vallie Ser Met GlyProPro505560GinAlaLysAsnAlaLeuValGlu Ala LeuAla Met Gly AlaAspGlu65707580
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MetAsnLysAla AspTyrLysGly ValTrpValPheAlaGluGinArg151015AspGlyGluLeuGinLysValSerLeuGluLeuLeu Gly LysGlyLys202530GluMetAlaGluLysLeuGlyValGluLeuThrAlaValLeuLeuGly354045HisAsnThrGluLysMetSerLysAspLeuLeuSerHisGlyAlaAsp505560LysValLeuAlaAlaAspAsnGluLeuLeuAlaHisPheSerThrAsp65707580
GlyTyrAlaLysVallieCysAspLeuValAsnGluArgLysProGlu859095lieLeuPhelieGlyAlaThrPhelieGlyArgAspLeuGlyProArg100105110lieAlaAlaArgLeuSerThrGlyLeuThrAlaAspCysThrSerLeu115120125AsplieAspValGluAsnArgAspLeuLeuAlaThrArgProAlaPhe130135140GlyGlyAsnLeulieAlaThrlieValCysSerAspHisArgProGin145150155160
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22
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权利要求
一种重组蓝藻，是通过包括如下步骤的方法得到的重组蓝藻向蓝藻中导入如下1)、2)或3)中所述的丁醇合成相关基因1)所述丁醇合成相关基因包括如下酶的编码基因电子转移黄素蛋白A亚基、烯酰水合酶、丁酰辅酶A脱氢酶、乙醇脱氢酶；2)所述丁醇合成相关基因包括如下酶的编码基因电子转移黄素蛋白B亚基、烯酰水合酶、丁酰辅酶A脱氢酶、乙醇脱氢酶；3)所述丁醇合成相关基因包括如下酶的编码基因电子转移黄素蛋白A亚基、电子转移黄素蛋白B亚基、烯酰水合酶、丁酰辅酶A脱氢酶、乙醇脱氢酶。
2. 根据权利要求1所述的重组蓝藻，其特征在于所述丁醇合成相关基因包括如下酶的编码基因3-羟丁酰辅酶A脱氢酶和/或乙酰辅酶A乙酰转移酶和/或丁醇脱氢酶。
3. 根据权利要求1或2所述的重组蓝藻，其特征在于所述方法包括灭活所述蓝藻中的至少一个聚-e羟基丁酸酯合成相关基因的步骤。
4. 根据权利要求2或3所述的重组蓝藻，其特征在于所述灭活的方法为用至少一个的所述丁醇合成相关基因替换至少一个的所述聚-e羟基丁酸酯合成相关基因。
5. 根据权利要求4所述的重组蓝藻，其特征在于所述聚-|3羟基丁酸酯合成相关基 因为聚-P羟基丁酸酯合成酶的编码基因；所述灭活的方法为用所述乙醇脱氢酶的编码基因替换所述聚-e羟基丁酸酯合成酶的编码基因。
6. 根据权利要求3-5中任一所述的重组蓝藻，其特征在于所述灭活的方法是通过同源重组实现的。
7. 根据权利要求1-6中任一所述的重组蓝藻，其特征在于 所述烯酰水合酶为如下1)或2)所述的蛋白质1) 由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2) 将序列表中序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/ 或添加且具有烯酰水合酶功能的由1)衍生的蛋白质；所述丁酰辅酶A脱氢酶为如下a)或b)所述的蛋白质a) 由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b) 将序列表中序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/ 或添加且具有丁酰辅酶A脱氢酶功能的由a)衍生的蛋白质；所述电子转移黄素蛋白B亚基为如I或II所述的蛋白质 I由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；II将序列表中序列5的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有电子转移黄素蛋白B亚基功能的由I衍生的蛋白质； 所述电子转移黄素蛋白A亚基为如下i或ii所述的蛋白质 i由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；ii将序列表中序列6的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有电子转移黄素蛋白A亚基功能的由i衍生的蛋白质； 所述3-羟丁酰辅酶A脱氢酶为如下①或②所述的蛋白质① 由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；② 将序列表中序列7的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有3_羟丁酰辅酶A脱氢酶功能的由①衍生的蛋白质； 所述丁醇脱氢酶为如下A或B所述的蛋白质A. 由序列表中序列8所示的氨基酸序列组成的蛋白质；B. 将序列表中序列8的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/ 或添加且具有丁醇脱氢酶功能的由A衍生的蛋白质；所述乙醇脱氢酶为如下A)或B)所述的蛋白质A) 由序列表中序列9所示的氨基酸序列组成的蛋白质；B) 将序列表中序列9的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/ 或添加且具有乙醇脱氢酶功能的由A)衍生的蛋白质；所述乙酰辅酶A乙酰转移酶为如下(1)或(2)所述的蛋白质(1) 由序列表中序列10所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(2) 将序列表中序列10的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和 /或添加且具有乙酰辅酶A乙酰转移酶功能的由(1)衍生的蛋白质。
8.根据权利要求1-7中任一所述的重组蓝藻，其特征在于所述烯酰水合酶的编码基因为如下1)、2)或3)所述的基因1) 其核苷酸序列为序列表中序列1自5'末端第1-786位核苷酸的DNA分子；2) 在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；3) 与1)限定的DNA序列有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子； 所述丁酰辅酶A脱氢酶的编码基因为如下a)、b)或c)所述的基因a) 其核苷酸序列为序列表中序列1自5'末端第800-1939位核苷酸的DNA分子；b) 在严格条件下与a)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；c) 与a)限定的DNA序列有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子； 所述电子转移黄素蛋白B亚基的编码基因为如I、 II或III所述的基因I其核苷酸序列为序列表中序列1自5'末端第1958-2737位核苷酸的DNA分子； II在严格条件下与I限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子； III与I限定的DNA序列有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子； 所述电子转移黄素蛋白A亚基的编码基因为如下i、 ii或iii所述的基因 i其核苷酸序列为序列表中序列1自5'末端第2756-3766位核苷酸的DNA分子； ii在严格条件下与i限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子； iii与i限定的DNA序列有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子； 所述3-羟丁酰辅酶A脱氢酶的编码基因为如下①、②或③所述的基因① 核苷酸序列为序列表中序列1自5'末端第3871-4719位核苷酸的DNA分子；② 在严格条件下与①限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；③ 与①限定的DNA序列有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子； 所述乙醇脱氢酶的编码基因为如下A、 B或C所述的基因A. 其核苷酸序列为序列表中序列2自5'末端第610-3186位核苷酸的DNA分子；B. 在严格条件下与A限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；C. 与A限定的DNA序列有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子； 所述丁醇脱氢酶的编码基因为如下(A)、 (B)或(C)所述的基因(A) 其核苷酸序列为序列表中序列11所示的DNA分子；(B) 在严格条件下与(A)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；(C) 与(A)限定的DNA序列有90X以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子； 所述乙酰辅酶A乙酰转移酶的编码基因为如下(1)、 (2)或(3)所述的基因(1) 其核苷酸序列为序列表中序列12所示的DNA分子；(2) 在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；(3) 与(1)限定的DNA序列有90X以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子。
9. 根据权利要求1-8中任一所述的重组蓝藻，其特征在于所述蓝藻为色球藻科蓝藻。
10. 根据权利要求1-9中任一所述的重组蓝藻，其特征在于所述重组蓝藻为蓝藻集胞 藻SMB-100CGMCC No. 2795.和聚球藻SMB-101CGMCC No. 2794。
全文摘要
本发明公开了一种重组蓝藻。该重组蓝藻，是通过包括如下步骤的方法得到的重组蓝藻向色球藻科蓝藻中导入如下1)或2)中所述的丁醇合成相关基因1)所述丁醇合成相关基因包括如下酶的编码基因电子转移黄素蛋白A亚基、烯酰水合酶、丁酰辅酶A脱氢酶、乙醇脱氢酶；2)所述丁醇合成相关基因包括如下酶的编码基因电子转移黄素蛋白B亚基、烯酰水合酶、丁酰辅酶A脱氢酶、乙醇脱氢酶。本发明实现了利用蓝藻将地球上取之不尽的太阳能和温室气体二氧化碳转化为能源产品丁醇，避免了能源再生过程中对粮食等其它有机物的浪费，同时又有利于环境保护。因此，利用本发明重组蓝藻来生产丁醇是实现可再生清洁能源持续、健康发展的理想途径之一。
文档编号C12N9/00GK101748069SQ200810239558
公开日2010年6月23日 申请日期2008年12月12日 优先权日2008年12月12日
发明者周杰, 张延平, 李寅, 解鹃, 高成华 申请人:中国科学院微生物研究所