专利名称：：合成谷胱甘肽的梭菌及其构建方法与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及合成谷胱甘肽的梭菌及其构建方法与应用。
背景技术：
：丁醇是一种重要的化工原料，主要用于制造增塑剂、溶剂、萃取剂等。近年来发现丁醇的热值、辛烷值与汽油相当，且能与汽油以任意比混合，可以使用现有的石油管道运输方式，丁醇已成为被世界各国企业和研究机构强烈关注的一种极具潜力的新型生物燃料。通过生物炼制方法生产丁醇已有悠久的历史，从优良菌种的选育到生产工艺和提取工艺的改进，都进行了大量的研究。但是现有菌株的生产性能(包括转化率、产量、生产强度和耐极端环境的能力)还难以满足工业生产的要求。1861年巴斯德首次发现细菌能够产生丁醇，1912年魏兹曼(Weizmann)发现了一种梭菌C7os^2'W層ace&toO^&咖能够将淀粉转化为丙酮、丁醇及乙醇。迄今，用于丙酮丁醇发酵生产的最主要的两株野生菌为C3ce"to^h'c鹏ATCC824及C力e力'en'77ch7NCIMB8052。美国伊利诺大学Ezeji等对CZeX/er^cAiiNCIMB8052进行化学诱变，筛选获得丁醇耐受性提高的C6w7er^7ch7BA101菌株，在简单、便宜的培养基中生长较好，适于工业应用。而且该菌株具有良好的传代稳定性，适宜连续生产。菌株BA101与出发菌株8052相比，葡萄糖利用率提高明显，批式发酵总溶剂浓度达到3.3%，其中丁醇产量17-21g/L(USPatent6,358,717)，是目前国际上报道的丁醇分批发酵的最高产量。决定丁醇成本的核心问题是丁醇的产量、丁醇对底物的转化率、以及底物的价格。因此，对菌株遗传改造的研究主要围绕提高底物的转化率、提高生产菌株对溶剂的耐受性及选择更廉价的底物进行。谷胱甘肽(GSH)是(微)生物中最主要的非蛋白巯基化合物，几乎在所有的真核生物的细胞内(除了不含线粒体或叶绿体的细胞)都含有GSH，而在原核生物中，只有少数几种能够合成GSH。在细菌细胞内，GSH的生理浓度在0.l-10raM，除了其具有的典型的抗氧化和维持胞内含巯基蛋白的氧化还原平衡功能外，还有报道GSH具有保护其它外界环境对细胞的胁迫作用，包括低pH、含氯化合物、高的渗透压等，并利用对蛋白质的谷胱甘肽化作用，参与翻译后修饰，改变蛋白质功能。一般GSH的合成是分为两步进行L-Glu+L-Cys+ATP—Y-Glu-Cys+ADP+Pi①Glu-Cys+Gly+ATP—GSH+ADP+Pi②GSH在细菌细胞中具有重要的生理功能，除具有抗氧化和维持胞内巯基的氧化还原平衡外，还提供细胞的耐受、耐含氯化合物和耐受高渗透压的功能。另外，提供蛋白质的翻译后修饰功能。在冗coh'中，反应①和②的两个酶分别是由^s/^和^s力顺个基因编码。另外，在少数h'We2^3spp.和6Yr印"coccwsspp.中具有双功能的基因g^F，即通过一个酶的催化完成两步反应，生产GSH。但是相当一部分细菌不能自身合成GSH，许多基因组数据分析表明这些细菌只是含有g^^的同源基因，在丙酮丁醇梭菌中同样只含有GSH合成的第一个同源基因gWA
发明内容本发明的目的是提供一种合成谷胱甘肽的梭菌及其构建方法与应用。本发明所提供的构建合成谷胱甘肽的梭菌的方法，是将含有谷胱甘肽合成相关蛋白的编码基因的DNA分子导入梭菌中构建重组菌。其中，所述含有谷胱甘肽合成相关蛋白的编码基因的DNA分子自上游至下游依此包括硫解酶启动子和谷胱甘肽合成相关蛋白的编码基因；所述硫解酶启动子的核苷酸序列具体可如序列表中的序列2所示。所述含有谷胱甘肽合成相关蛋白的编码基因的DNA分子还经过甲基化修饰。所述梭菌为丙酮丁醇梭菌或拜氏梭菌。所述谷胱甘肽合成相关蛋白的编码基因具体可为如下l)至4)中任一所述的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列l;2)其核苷酸序列是序列表中序列3;3)在严格条件下可与序列表中序列l)或3)限定的DNA序列杂交且编码谷胱甘肽合成相关蛋白的DNA分子；4)与1)或3)的基因具有90%以上的同源性，且编码谷胱甘肽合成相关蛋白的DNA分子。所述丙酮丁醇梭菌为丙酮丁醇梭菌SMB-1CGMCCN2.2287。由所述方法构建的重组梭菌也属于本发明的保护范围。所述重组梭菌为丙酮丁醇梭菌(TC7osz^io7咖aceto/wz^h'c鹏JSMB-1(pITG-B)CGMCCNo.2797。本发明的另一个目的是提供一种生产丁醇的方法。本发明所提供的生产丁醇的方法，是发酵培养所述的重组梭菌生产丁醇。所述发酵培养的培养基为质量百分含量为5-10%的玉米淀粉，所述发酵培养为在435-39'C静置培养48-72小时。本发明构建合成谷胱甘肽的梭菌的方法通过将来源于Ecoh'的^s力"基因在丙酮丁醇梭菌中表达，合成GSH，提高梭菌抗氧化能力，同时提高利用淀粉能力，增加丁醇生产量和生产强度。该方法构建的重组丙酮丁醇梭菌利用玉米醪能力较强，发酵结束，发酵液澄清，残渣较少，有效提高下游处理，提高丁醇生产强度。将5^A9基因导入拜氏梭菌中也能够获得同样的效果。图1为重组表达载体pITG-B的结构示意图。图2为SDS-PAGE检测重组蛋白的表达。图3为丙酮丁醇梭菌(C7o5^ri力'腿ace"/wz^h'c〃/)SMB-1(pITG-B)CGMCCNo.2797与对照菌丙酮丁醇梭菌^7os^7'o7咖aceto/wz^h'c咖y)SMB-l(pIMPl)CGMCCNo.2800发酵液的比较。具体实施例方式下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。下述实施例以丙酮丁醇梭菌为例阐明本发明的合成谷胱甘肽的梭菌及其构建方法与应用。下述实施例中的实验结果均为三次重复实验的平均值。酵母粉购自英国0X0ID公司(目录号1023098)，蛋白胨购自英国0X0ID公司(目录号594566)，牛肉膏购自北京双旋微生物培养基制品厂，玉米淀粉(普通超市购买)。每升强化梭菌培养基(RCM)含酵母粉3.0g，蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，葡萄糖5.0g，淀粉10.0g，乙酸钠3.0g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，pH6.8。玉米淀粉培养基每100mL水中加入8.0g玉米淀粉，加热糊化。实施例l、构建合成谷胱甘肽的丙酮丁醇梭菌釆用细菌基因组提取试剂盒提取对数生长中后期的Acoh'JM109的染色体DNA，以此为模板，用以下引物进行PCR扩增gshB-F:5，-UcagaggatccATGATCAAGCTCGGCATCGTG-3，(化线部分为BamHI识别位点)；gshB-R:5，-aaggcgaattcTTACTGCTGCTGTAAACGTGCTTC-3，(划线部分为EcoRI识别位点)。采用TaKaRa公司的高效保真酶Primerstart进行PCR扩增，其PCR扩增程序为95°C3min;98。C10s、55°C15s、72°C1min，30个循环；72°C10min。将所得的PCR产物采用PCR产物回收试剂盒纯化，随后用Fermetas公司的BaraHI和EcoRI对纯化的PCR产物进行双酶切，37。C静置4h后，用DNA回收试剂盒纯化酶切后的PCR产物，与用同样酶双酶切的pIMPl-Pthl载体在T4DNA连接酶作用下连接，连接产物，转化A"WJM109的高效感受态细胞，在含氨苄青霉素的LB平板上筛选。菌落PCR验证阳性克隆子。阳性克隆子划线分离，并取单菌落用于富集培养，进行测序，测序结果表明PCR扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列1所示，将构建得到的重组表达载体命名为pITG-B(图l)。pIMP1-Pthl载体按照如下方法获得采用溶菌酶、SDS等试剂破坏细胞壁的常规细菌基因组提取方法，提取丙酮丁醇梭菌(67oWn'o7咖sceti"z^"'c鹏)ATCC824(美国典型培养物保藏中心，美国专利US7432090)的基因组DNA，按照常规PCR方法，使用高保真DNA聚合酶Pfu扩增硫解酶启动子区域(Pthl)。表l.引物的核苷酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>将PCR扩增硫解酶启动子区域的产物克隆到pMD18-T载体中，获得pMD18-T-Pthl载体，测序，测序结果表明Pthl的核苷酸序列如序列表中序列2所示。5"WI和^MHI酶切扩增得到的硫解酶启动子区域(Pthl)与经过同样酶切的pIMPl载体(Mermelstein,L.D.，N.E,Welker，G.N.Bennett,andE.T.P叩outsaMs.(1992).ExpressionofclonedhomologousfermentativegenesinClostridiumacetobutylicumATCC824.Bio/Technology.10:190-195)(中国科学院微生物研究所)连接构建载体pIMPl-Pthl。pITG-B质粒转化到Ecoh'ER2275coh'ER2275含质粒pANl，pANl含来自枯草芽孢杆菌的①3T甲基化酶基因)(Me匿lstein，L.D.andE.T.Papoutsakis(1993).〃InvivomethylationinEscherichiacolibytheBacillussubtilisphagephi3TImethyltransferasetoprotectplasmidsfromrestrictionupontransformationofClostridiumacetobutylicumATCC824."Appl.Environ.Microbiol.59(4):1077-1081.)(中国科学院微生物研究所)中，并将转化后细胞涂布于含有氨苄青霉素和氯霉素的LB平板上，挑取单菌落富集培养，菌落PCR验证阳性克隆子，阳性克隆中pITG-B质粒即是甲基化的pITG-B质粒。厌氧环境下，取强化梭菌培养基(RCM)培养的对数生长中后期的丙酮丁醇梭菌(C7ostWo7咖ace"/wt7h'c鹏)SMB-1CGMCCNa.2287(中国专利200810102673.2)培养液冰浴放置IOrain，4°C、4000rpra离心10min，厌氧环境下，去上清，加入足量的预冷的电转缓冲液(270mM蔗糖，5mMNaH2P04，pH7.4)，洗涤两次，并用电转缓冲液重悬，然后转入0.4cm的电转杯，放置在冰浴中冷却，加入甲基化的pITG-B质粒，冰浴放置2min，2.0kv脉冲电压和25yF的电容进行电转化，随后将电转液加到RCM培养基中37。C复活培养4h，离心收集细胞，并将所得细胞涂布于含红霉素抗性的RCM琼脂培养基中，培养24-36h后，获得重组菌含有甲基化的pITG-B质粒丙酮丁醇梭菌，命名为丙酮丁醇梭菌".ace"/w^^ic鹏J6￥S-7(pITG-B)。用含红霉素(50ug/ml)的RCM培养基培养丙酮丁醇梭菌"aceto/w^"'c柳JS您-7(pITG-B)至对数生长中后期，离心收集细胞，并将细胞直接用于SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳。SDS-PAGE结果如图2所示，目的蛋白大小约为36kDa，对36kDa的目的蛋白质进行纯化后，进行二级质谱鉴定，质谱鉴定结果表明该蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。图2中，泳道1-4分别代表蛋白分子量标准、丙酮丁醇梭菌(C7osfri^'顺sc"o/w0^ic,朋)SMB-1CGMCC渔.2287、丙酮丁醇梭菌(67oWWJi〃历3ceto/wz^7icwz)SMB—1(pIMPl)禾口丙嗣丁酉享梭菌(t7o5^rio7,朋sceto/wt/yicw//')smb-1CGMCCNq.2287(pITG-b)。用碧云天生物技术研究所的GSH和GSSG检测试剂盒测定对数中后期的丙酮丁醇梭菌(67o5"^rio7Mzace"/wz^^'cMZ7)SMB-1(pITG-B)、丙酮丁醇梭菌(〃afnWi〃迈ace^/wO^J'c咖)SMB-1CGMCCN2.2287胞内谷胱甘肽含量。以转化pIMPl载体的丙酮丁醇梭菌(6Vo^nW鹏ace"to^h'c鹏)SMB-1，命名为丙酮丁醇梭菌(C2o"rW咖acefo/wWic咖)SMB-1(pIMPl)作为对照。测定结果表明，对数中后期的丙酮丁醇梭菌Cace"to^"'c咖J5￥S-7(pITG-B)胞内谷胱甘肽含量在2.8-4.5mM之间(由于生长的0D,不同)，而丙酮丁醇梭菌(67oWn.力.歷3ce"/wz^^'c咖)SMB-1CGMCCNa.2287(中国专利:200810102673.2)和对照菌株的GSH检测结果均在0.8-0.9mM之间。实施例2、利用丙酮丁醇梭菌(67ostrjViMzacez^Zwt/h'c鹏)SMB-1(pITGHB)发酵产丁醇丙酮丁醇梭菌(C7ostWo7鹏acetoZwz^h'c鹏)SMB-1(pITG-B)在RCM培养基中37"C静置培养至对数期，作为发酵种子液l。发酵种子液1按照体积百分比为5%的量接种到装有3L玉米淀粉培养基的7L发酵罐中进行发酵，发酵温度为分别为35'C，37°C，39°C，发酵方式为静止发酵；发酵时间为36小时。以丙酮丁醇梭菌(67asfn'd/2'咖3ce"Zwz^h'c咖)SMB-1(pIMPl)作为对照。发酵后的发酵液用液相色谱检测，结果如表l所示。液相色谱检测条件为样品前处理12000rpm离心lmin，取上清液，用0.22wm滤膜过滤；色谱条件Agilent1200液相色谱仪，示差检测器；BioRadAminexHPX-87H有机酸柱(300*7.8咖)，柱温15。C;上样量10ul;流动相为0.05mMH2S04，流速O.5ml/min。丁醇标准品购自Sigma公司(目录号4C006217);在如上色谱条件下标准品的保留时间为40.9分钟。表2.液相色谱检测36小时发酵液的结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>重组菌丙酮丁醇梭菌sce&Zwfyh'c)SMB-1(pITG-B)中的一株菌已于2008年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo.2797。丙酮丁醇梭菌(67osz^z'o^咖ace"Zw^^z'c咖)SMB-1(pIMPl)于2008年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo.2800。丙酮丁醇梭菌(C2o^ric^鹏acez^Zwz^h'cwyz)SMB-1(pITG-B)CGMCCNo.2797在RCM培养基中37"C静置培养至对数期，作为发酵种子液2。发酵种子液2按照体积百分比为5%的量分别接种到装有3L玉米淀粉培养基的7L发酵罐中37。C静止发酵。以丙酮丁醇梭菌(67asz^'o7鹏acez^/wO^'c鹏)SMB-1(pIMPl)CGMCCNo.2800作为对照。发酵36或48小时后用液相色谱检测发酵液中丁醇的产量，结果如表2所示。表3.丙酮丁醇梭菌SMB-1(pITG-B)及对照菌株丁醇产量<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>发酵种子液2按照体积百分比为5%的量分别接种到含10mL玉米淀粉培养基的20mL试管中进行厌氧静置培养，培养温度为37"C。培养36h时试管中发酵液的性状分别如图3中B所示，丙酮丁醇梭菌(67a^rid/i鹏3cetoZw^^'c哪)SMB-1(pITG-B)CGMCCNo.2797的发酵液比较澄清，可得到更多的发酵滤液，有助于丁醇的回收，提高生产强度。图3中A:对照菌丙酮丁醇梭菌SMB-1(pIMPl)CGMCCNo.2800;B:丙酮丁醇梭菌SMB-1(pITG-B)CGMCCNo.2797。序列表<110〉中国科学院微生物研究所〈120>合成谷胱甘肽的梭菌及其构建方法与应用〈130〉CGGNARW82069〈160〉3<210>1〈211〉951<212>腿<213〉大肠杆菌(^Esc/7eA7'c/7/'aco//〈400〉1atgatc^gctcggcatcgtgatggaccccatcgcaaacaga^gattcc60agttttgctatgttgctggaagcacagcgtcgtggttacgtatgg卿tg120ggcgat:ctgtatctgatcaatggtgaagcccgcgcccatacccgcacgct180cagaactacg3卿g"tggttttcgttcgtcggtg纖鄉atctgccgctggccgatctc240gatgtgatxctgatgcgtaaagacccgccgtttgataccgagtttatctacgcgacctat300attctggaacgtgccg卿aga卿ggatcgctgatcgttaacaagccgcagagcctgcgc360gactgtaacgtaccgcctggttctctgacttaacgccagaaacgctgg"tt420acgcgcaMaaagcgcagctaa^agcgttcacagcgacatcattcttaag■ccgctggacgg城gggcggcgcgtcgat"tttccgcgtgaaagaaggcgatccaaacctx540ggcgtgattgccgaaaccctgactgagcatggcactcgctactgcatggcgca^a^ttac600ctgccagccattaaagatggcgacaaacgcgtgctggtggtgg3tggCg3gccggtaccg660tactgcctggcgcgtattccgcaggggggcgaaacccgtggc犯tctggc"tgccggtggt720cgcggtg認ctxgtccgctgacggaaagtgactggaaaatcgcccgtcagatcgggccg780acgctgaaagaa^agggctgatttttgttggtctggat3tcatcggcgaccgtctgact840gaaattaacgtcaccagcccaacctgtattcgtg卿ttg犯gC3gdg"tttccggtgtcg900atcaccggaatgtta^tggatgccatcgaagcacgtttacagcagcagtaa951<210〉2<211>150<212〉DNA〈213〉丙酮丁醇梭菌(67ostrW咖ac"。紐Wc咖)<400〉2tatattgatatagtgggtataattaagttgttagagaaaacgtataaatt60agggataaactatggaactt3tga^tag3ttgaaatggtttatctgttaccccgtatca120aaatttaggaggtt:agttag犯tga^gaa150〈210〉3〈m〉150〈212〉腿〈213〉大肠杆菌^Esc/7er/c//a<400>3ttgatatgacaMacttgattctcttaaagtctccggaaa60cttttattttctggtcatt"ttggtttggaatccgtgtaacttctgatgga120aaactggctcttacgcctcatccagctatttttggaccaaaagaagata^tccatacatt180t"ttcgga肌gcc肌a/ttga^atgattactcttcgattgac240gatgtatataactggcttgaaaacctccataMattgtttctttacgttc300C"ttCt"ttggCcttctagcaa1xcgccaattttgcctgcggtcctattgct360gaatataa^acgccagacagtCC3g3t3g3aaatatcgcga3C3tttagcgcaaggttat420tccaattattatctgg3atttttcat"tcccagaagcgtta■attgatgggctttatgatgagatcagtcttcctaMgaatcgaagcgcgac111aaaaat540cgcttatactta^agtagcatgaa^a^cgttggttgctcatttattta600g"tcctgtttatcttgctgatccaaacaggaagagaaactt660cgcgatggtagcagcgctcttcacgacggaatttcccttcgtaacagtaatgctggatat720aatcactttacgttgattacaattcatttgatgcttacatttcgagtatc780tcaaactacattg犯gcgggt^La^ttga^敏atgcgcgaat111atcccg3taaga840tta^aa^acgcacatactgaccaaactgttga^gtttagcg肌gcatggcgtggaatat900ttagaaattcgttccattgatttaaatccscttgaaccaaatggaatttctaMgaggcg960cttcattttattcacctattggtttactgtcagaagaccgcgagctatgc1020g^aac^iccaacagttagctgatga^aacttgcactaaatggtctttcg1080a^cca^gc^tt^a^ax:tgtgacaacgaagaaatggcccttgcagacgctggactcttg1140gaattagalatttcatccaaagcttacgtccagaagacacctatttccaa1200<image>imageseeoriginaldocumentpage12</image>权利要求1、构建合成谷胱甘肽的梭菌的方法，是将含有谷胱甘肽合成相关蛋白的编码基因的DNA分子导入梭菌中构建重组菌。2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述含有谷胱甘肽合成相关蛋白的编码基因的DNA分子自上游至下游依次包括硫解酶启动子和谷胱甘肽合成相关蛋白的编码基因；所述硫解酶启动子的核苷酸序列如序列表中的序列2所示。3、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述含有谷胱甘肽合成相关蛋白的编码基因的DNA分子还经过甲基化修饰。4.根据权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于所述梭菌为丙酮丁醇梭菌或拜氏梭菌。5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述谷胱甘肽合成相关蛋白的编码基因为如下l)至4)中任一所述的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列1;2)其核苷酸序列是序列表中序列3;3)在严格条件下可与序列表中序列1或3限定的DNA序列杂交且编码谷胱甘肽合成相关蛋白的DNA分子；4)与l)或2)的基因具有90%以上的同源性，且编码谷胱甘肽合成相关蛋白的DNA分子。6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述丙酮丁醇梭菌为丙酮丁醇梭菌SMB-1CGMCCNe,2287。7、由权利要求1至6中任一所述方法构建的重组梭菌。8、根据权利要求7所述的重组梭菌，其特征在于所述重组梭菌为丙酮丁醇梭菌(67oWW力'咖ace^Zwz^7ic柳)SMB-1(pITG-B)CGMCCNo.2797。9、一种生产丁醇的方法，是发酵培养权利要求7或8所述的重组梭菌生产丁醇。10、根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述发酵培养的培养基含有质量百分含量为5-10%的玉米淀粉，所述发酵培养为在35-39'C静置培养。全文摘要本发明公开了一种合成谷胱甘肽的梭菌及其构建方法与应用。构建合成谷胱甘肽的梭菌的方法，是将含有谷胱甘肽合成相关蛋白的编码基因的DNA分子导入梭菌中构建重组菌。所述含有谷胱甘肽合成相关蛋白的编码基因的DNA分子自上游至下游依此包括硫解酶启动子和谷胱甘肽合成相关蛋白的编码基因。本发明还公开了一种生产丁醇的方法，是发酵培养由所述合成谷胱甘肽的梭菌的方法构建的重组菌生产丁醇。本发明构建的合成谷胱甘肽的丙酮丁醇梭菌发酵生产丁醇的产量12.8g/L，产率最高可达到0.35g/L/h。文档编号C12N15/54GK101423814SQ200810239559公开日2009年5月6日申请日期2008年12月12日优先权日2008年12月12日发明者张延平,朱林江,寅李申请人:中国科学院微生物研究所