一种生物传感器及其应用的制作方法

专利名称：：一种生物传感器及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种生物传感器及其应用。
背景技术：
：丁醇是一种重要的化工原料，有多种用途，如用于制造邻苯二甲酸二丁酯和脂肪族二元酸丁酯类增塑剂，用于各种塑料和橡胶制品的生产。丁醇还可用来生产丁酸、丁酸、丁胺和醋酸丁酯，它们可用作树脂、油漆、粘接剂的溶剂，也可用作油脂、药物和香料的萃取剂及醇酸树脂涂料的添加剂。近年来美国科学家的研究表明，丁醇还是一种极具潜力的新型生物燃料。与甲醇和乙醇相比，丁醇在性能上与汽油更为接近，这就更加引起了研究者和企业对其的研究开发兴趣。丁醇可由化学合成法和发酵法生产。化学合成法主要包括两条路线，一是以丙烯为原料，经羰基合成法生成正、异丁醛，加氢后分馏得到正丁醇；二是以乙醛为原料，经醇醛縮合成丁醇醛，脱水生成丁烯醛，再经加氢后得到正丁醇。丙烯和乙醛主要来自于石油等不可再生资源，不利于节约资源，因此，化学合成法的推广受到了资源限制。进入21世纪后，随着全球石油等不可再生资源的价格迅速上涨以及绿色化学理念的提出，发酵法生产丁醇工艺由于原料来源广泛等优点又重新受到重视。目前工业中用于发酵生产丁醇的菌的生产能力和耐受性还都比较低，需要筛选出新型高产的产丁醇微生物。目前检验微生物产丁醇的能力一般需要扩大培养，再进行气相或液相检测，这一系列过程都很繁琐，耗时耗力。因此，筛选产丁醇微生物的关键是建立一套快速、有效检测丁醇存在的技术。全细胞传感器是一种利用完整活细胞为载体，能够连续检测和分析细胞在外界刺激下的生理性能，定性定量测定物质信息(如确定该类物质的存在与否以及浓度大小等)的检测器。与酶传感器相比，全细胞传感器应用范围更广，检测标准和提供的信息更多，更能准确地反应被分析物的信息；其次，全细胞是一个严谨调控的系统，能够稳定修复整合酶活性，产生的信号强而且重复性好；另外，全细胞传感器在环境毒性化合物检测方面弥补了气相和液相等传统检测方法的不足；尤为重要的是，全细胞传感器的检测酶为胞内酶，不存在酶的纯化、酶活性保持以及失活等问题。因此，全细胞传感器在有机化合物检测方面得到了更为迅速的发展。微生物全细胞传感器的最大特点就是能够检测天然环境中可供生物利用的痕量物质。
发明内容本发明的一个目的是提供一种DNA片段。本发明所提供的DNA片段，其自上游至下游依次为调节基因、丁醇特异性启动子和报告蛋白的编码基因；所述调节基因为编码如下(a)或(b)所示蛋白的基因(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(a)衍生的蛋白质；所述报告蛋白为如下(1)或(2)所示的蛋白-(1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(2)将序列表中序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。为了使上述(a)或(1)中的蛋白便于纯化，可在由序列表中序列2或序列l所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表l所示的标签。表l、标签的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>上述(a)、(b)、(1)或(2)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白的编码基因可通过将序列表中序列3所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到；上述(2)中的蛋白的编码基因可通过将序列表中序列4所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。本发明所提供的DNA片段中，所述调节基因可为如下(c)、(d)或(e)所示的基因(c)其核苷酸序列是序列表中序列4所示DNA分子；(d)在严格条件下与(c)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；(e)与(c)限定的DNA序列有9(W以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子；所述报告蛋白的编码基因可为如下(3)、(4)或(5)所示的基因(3)其核苷酸序列是序列表中序列3所示DNA分子；(4)在严格条件下与(3)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；(5)与(3)限定的DNA序列有90。/。以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子；所述丁醇特异性启动子的核苷酸序列可为如下I、II、III或IV所示I至少含有序列表中序列5中自5'末端第148-198位核苷酸的DNA分子；II其核苷酸序列是序列表中序列5所示DNA分子；III在严格条件下与I或II限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；IV与I或II限定的DNA序列有90%以上同源性且具有相同功能的DNA分子。所述严格条件可为在O.lxSSPE(或O.lxSSC)，0.1。/。SDS的溶液中，在65°C下杂交，并用该溶液洗膜。含有上述任一所述DNA片段的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也属于本发明的保护范围。本发明的另一个目的是提供一种生物传感器。本发明所提供的生物传感器，包括含有上述任一所述DNA片段的重组菌或转基因细胞系。一般情况下，本发明的生物传感器与荧光显微镜等物理器件联合使用。其中，所述菌可为大肠杆菌、枯草芽胞杆菌。上述生物传感器在检测丁醇中的应用也属于本发明的保护范围。具体可用于环境样品(如土壤、污水等)中丁醇的定性和定量检测。上述生物传感器在筛选丁醇产生菌中的应用也属于本发明的保护范围，如可应用于从环境样品中筛选能产生丁醇的菌株、从经诱变等处理的突变菌株库中筛选产丁醇能力比出发菌株强的菌株等。本发明的最后一个目的是提供一种报告蛋白及其编码基因。本发明所提供的蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(a)衍生的蛋白质。上述报告蛋白在制备生物传感器中的应用及上述报告蛋白的编码基因在制备生物传感器中的应用也属于本发明的保护范围。本发明是将本发明报告蛋白的编码基因与丁醇特异性表达基因的启动子序列相连，得到融合基因，再将融合基因导入宿主菌中，得到生物传感器，该传感器能特异的检测丁醇。在实际应用中，还可以将本发明报告蛋白的编码基因与其它对某物质具有特异性表达的基因的启动子相连，从而制备检测该物质的生物传感器。生物传感器通常采用绿色荧光蛋白作为报告蛋白，这种传感器适用于单细胞检测，而且表型更为直观。然而绿色荧光蛋白形成生色团过程严格需要辅因子分子氧参与，这种缺陷就制约了生物传感器在厌氧条件下的应用。本发明的来源于尸se"A/z/朋i'a尸WiA的报告蛋白，其在厌氧和好氧条件下均能依赖黄素单核苷酸产生荧光，因此，由其所构建的传感器即使在厌氧条件下也能保证荧光信号分子的产生。实验证明，本发明的生物传感器，在厌氧条件下能高效、特异和灵敏地检测丁醇，既可定性又可半定量，而且即使在有其它物质(如丙酮、乙醇)存在的情况下，也不影响其对丁醇的检测效果；本发明生物传感器借助流式细胞仪、荧光显微镜以及酶标仪等仪器，实现了从大量微生物样品中高通量筛选产丁醇微生物或产丁醇能力强微生物，縮短和简化了筛选过程，解决了目前丁醇检测手段的费时、繁琐等缺点，有利于迅速扩充现有的产丁醇微生物资源，获得新型、高效产丁醇微生物，从而有效提高丁醇工业发酵的产量。图1为重组载体pUC18//Ptot/FbFP的结构示意图。图2为生物传感器荧光活性检测。具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从生物公司购买。恶臭假单胞菌(尸sewofe历o/^a.A/z^VaKT2440)购自DSMZ。酵母粉购自英国0X0ID公司(目录号1023098)，蛋白胨购启英国0X0ID公司(目录号594566)，牛肉膏购自北京双旋微生物培养基制品厂；pUC18购自宝生物工程(大连)有限公司。本实验通过对67a^n'力'咖ace"Zwz^h'c咖响应丁醇浓度的生理和分子机制的认识，克隆受丁醇诱导特异表达基因的启动子区和调节基因，将其与报告蛋白FbFP[flavinmononucleotide(F丽)-basedfluorescentproteins]编石马基因在大肠杆菌中融合表达，构建检测丁醇的生物传感器。实施例l、生物传感器的制备一、融合基因的制备特异性启动子的获得根据丙酮丁醇梭菌(67oWr^7咖ace^Z^^ic鹏)ATCC824(US2007020740(A1))中丁醇诱导表达基因的启动子区(Genbank中的CAC1485)，设计如下引物CGCGGATCCCAGAAACGGTTAAATTTGAA、TAGTACACCTACTTTGATAAGAGTTTTGCGTTGATCAT，以Csce"Zw^h'cMzATCC824的基因组DNA为模板，PCR扩增，得到PCR扩增产物，测序验证，表明得到序列正确的特异性启动子(命名为P，其核苷酸序列如序列表中序列5所示；报告蛋白编码基因的获得根据恶臭假单胞菌(/^ewo^w/7^.尸w^Ws)的序歹!j(Genbabk号AE015451)，设计如下弓l物ATGATCAACGCAAAACTC、CCGGAATTCTCAGTGCTTGGCCTGG，以恶臭假单胞菌(/^ew/oMMia.A/OW3)的基因组DNA为模板，PCR扩增，得到PCR扩增产物，测序验证，结果表明，得到序列正确的报告蛋白编码基因(命名为FbFP)，其核苷酸序列如序列表中序列3所示，该核苷酸序列编码的氨基酸序列如序列表中序列1所示；调节基因序列的获得根据丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)ATCC824中丁醇诱导表达基因的调节基因的序列(Genbank中的CAC1493)，设计如下引物CCCAAGCTTATGCCAAATGTGAAGTCTAT、AACTGCAGCTAAAATGTGCTTACACAAT，以C.acefoZw^h'c鹏ATCC824的基因组DNA为模板，PCR扩增，得到PCR扩增产物，测序验证，结果表明，得到序列正确的调节基因序列(命名为力Wi)，其核苷酸序列如序列表中序列4所示，该核苷酸序列编码的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示；调节基因、特异性启动子序列与报告蛋白编码基因的融合分别通过PCR扩增上述特异性启动子和报告基因，然后利用融合PCR进行连接，得到启动子和报告基因的融合片段P^/fbFP;用限制性内切酶HindIII和PstI酶切pUC18，回收大片段，将上述调节基因PCR产物与回收的大片段连接，得到含有调节基因的重组载体pUC18/to^;用限制性内切酶BamHI和EcoRI酶切重组载体pUC18/^/M，同时用限制性内切酶BamHI和EcoRI酶切融合片段Pto,/FbFP，将酶切产物连接，得到含有调节基因、特异性启动子序列与报告蛋白编码基因的融合基因的重组载体，将其命名为pUC18/Zw"/P紐/FbFP。将重组载体pUC18/P紐/FbFP转化至大肠杆菌，筛选阳性克隆，提取质粒，进行测序验证，结果表明阳性质粒的结构和序列正确，其中的调节基因、特异性启动子、报告基因的核苷酸序列正确，其连接顺序也正确，即得到序列正确的融合基因，融合基因的核苷酸序列如序列表中序列6所示。含有融合基因的重组载体pUC18//Pto/FbFP的结构示意图如图1所示。图1中，A表示抗性基因(Ws);B表示co^5V复制起点(oricWi57);C表示调节基因(;D表示受丁醇诱导特异表达基因即被调节基因的启动子(P^);E表示报告蛋白编石马基因(reporterproteingene)。二、生物传感器的制备将上述阳性重组载体pUC18//wM/P紐/FbFP转化至大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌；将重组大肠杆菌接种至含有终浓度为100mg/L的氨苄青霉素的LB培养基中进行筛选培养，挑取单克隆接入液体培养基中进行培养，然后进行菌液PCR验证和测序验证，得到阳性克隆，即为生物传感器。实施例2、生物传感器的应用一、检测样品中丁醇浓度将实施例1制备的生物传感器分别接种至含有不同终浓度的丁醇、丙酮、乙醇、乙酸和丁酸的CGM培养基中，各物质在培养基中的不同终浓度为0.01%、0.05%、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、1.0%、1.2%(v:v);在厌氧条件下培养大肠杆菌0、1、2、4、6、8、10h;采用荧光显微镜检测报告蛋白FbFP荧光活性。以接种不含任何质粒的大肠杆菌作为阴性对照。实验设3次重复，结果，传感器接种6h后，在丁醇浓度为O.1-0.7%(v:v)的培养基中有明显的荧光产生(图2)，而不同浓度的丙酮、乙醇、乙酸和丁酸均未引发传感器产生荧光，接种不含任何质粒的大肠杆菌的培养基中也均未产生荧光。表明，实施例l中的传感器可用来检测含有O.1-0.7%(V:V)丁醇的样品，即可对样品中的丁醇进行半定量检测。二、利用传感器筛选丙酮丁醇梭菌突变文库本实验是用生物传感器筛选产丁醇能力强的菌株。出发菌为C.acetototyh'cu/SMB-1(CGMCCNs.2287，中国微生物菌种保藏中心)(CN101250496)。诱变处理将菌种接入RCM培养基中，置于363S。C厌氧培养3648h，等菌体生长至对数中期时，取出离心，用生理盐水离心洗涤两次，最后一次取沉淀加入pH7.0的磷酸盐缓冲液，用终浓度为0.51%硫酸二乙酯诱变1030min，用硫代硫酸钠终止反应，离心，用生理盐水洗涤两次，去除剩余的诱变剂。将诱变剂处理过的C.ace"Zw^h'c咖突变文库涂布于固体培养基上，在温度37°C、相对湿度为60%的厌氧培养箱内进行培养，培养24h后，挑取单菌落接种于装有液体CGM培养基的96孔板内，同时对该菌落做备份；厌氧培养60h后，分别接种生物传感器于96孔板内，混合培养12h，利用荧光酶标仪检测每个孔板的荧光强度，以未经任何诱变的出发菌株作为对照。选择荧光强度高于未经任何诱变的出发菌株的处理，即为产丁醇能力强的菌株。再利用液相色谱对其备份菌株产丁醇性能进行鉴定。液相色谱方法及条件样品前处理取发酵液，12000rpm离心lmin，取上清液，用0.22um滤膜过滤；色谱条件Agilent1200液相色谱仪，示差检测器；BioRadAminexHPX-87H有机酸柱(300*7.8画)，柱温15。C;上样量10yl;流动相为0.05mMH2S04，流速0.5ml/min。丁醇标准品购自Sigma公司(目录号4C006217);在如上色谱条件下标准品的保留时间为40.9分钟。固体培养基组成蛋白胨，10g/L;牛肉膏，10g/L;酵母粉，3g/L;葡萄糖,5g/L;可溶性淀粉，10g/L;NaCl，5g/L;Cys-HC1，0.5g/L;醋酸钠，3g/L，琼脂粉，15g/L，溶剂为水。CGM培养基:KH2P04，0.75g/L;K2HP04,3H200.75g/L;MgSO"H20，0.4g/L;FeSO7H20，0.01g/L;NaCl，1.0g/L;天冬酰胺，2.0g/L;酵母粉，5.0g/L;(NH4)2S04，2.0g/L;葡萄糖，50g/L，溶剂为水。RCM培养基组成每升培养基含酵母粉3.0g，蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，葡萄糖5.0g,淀粉10.0g，乙酸钠3.0g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，pH6.8。培养温度为37°C。实验设3次重复，结果取平均数，结果见表2。结果表明，利用本发明传感器进行检测，得到的荧光强度与菌株实际产生丁醇的能力成正比，表明本发明传感器可以用于高通量筛选诱变后的产丁醇能力强的菌株。表2、筛选菌株产丁醇性能的鉴定<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>三、实施例1中制备的生物传感器用于筛选环境样品中丁醇生产菌取北京郊区土豆地土壤，分别以io倍浓度递减方式对土壤悬浮液进行稀释。然后从稀释后的样品中筛选生产丁醇的菌株。筛选方法及所用的培养基等均同实验二中所述一致。实验设3次重复，结果如表3所示。结果表明，能够产生丁醇的菌株均可以通过本发明生物传感器检测出，表明，本发明生物传感器可用于环境样品中能生产丁醇的菌株的筛选。表3、环境微生物产丁醇性能鉴定<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>序列表<110>中国科学院微生物研究所〈120〉一种生物传感器及其应用<130〉CGGNARC82062<160>6<210〉1<211〉148<212>PRT<213〉假单胞菌属恶臭假单胞菌(Pset/ctomoA7/ap〃f/Qfa)<400〉1MetlieAsnAlaLysLeuLeuGinLeuMetValGluHisSerAsnAsp151015GlylieValValAlaGluGinGluGlyAsnGluSerlieLeulieTyr202530ValAsnProAlaPheGluArgLeuThrGlyTyrCysAlaAspAsplie354045LeuTyrGinAspAlaArgPheLeuGinGlyGluAspHisAspGinPro505560GlylieAlalielieArgGluAlalieArgGluGlyArgProCysCys65707580GinValLeuArgAsnTyrArgLysAspGlySerLeuPheTrpAsnGlu859095LeuSerlieThrProValHisAsnGluAlaAspGinLeuThrTyrTyr100105110lieGlylieGinArgAspValThrAlaGinValPheAlaGluGluArg115120125ValArgGluLeuGluAlaGluValAlaGluLeuArgArgGinGinGly130135140GinAlaLysHis145〈210〉2<211〉142<212〉PRT<213〉梭菌属丙酮丁醇梭菌(67osW(/2'mzacef。紐Wc咖)〈400〉2MetProAsnValLysSerlieLeuAsnHislieGluLysLeuProLeu1015GinGinLysGluGinlieLeuSerThrLeuGluGlulieLeuValLeu202530GlySerGinValSerGinValGluGinGluValLysGluPheArgPhe354045SerLysGlyLysValCysProlieCysGlySerGluThrlieSerArg505560AsnSerLysTyrAsnGlyLysGinGlyTyrlieCysLysSerCysLys65707580LysSerPheThrAspPheThrAsnSerAlaThrTyrLysSerLysLys859095ThrLeuAspLysTrpLeuLysTyrAlaLysCysMetValAsnGlyTyr100105110SerlieArgLysSerAlaLysValValGlulieAsnlieAlaThrSer115120125PhePheTrpArgHisLyslieLeuAspCysValSerThrPhe130135140〈210>3<211〉447〈212〉DNA〈213〉假单胞菌属恶臭假单胞菌(Pseucfomon/apuf,'da)<400〉3atgatcaacggccgagcaggaccggctactcacgaccagccaggtgctgcccggtgcacagcgc3agt3tcggcagcaggC3333CtCCtgcgccgscg3cgggcatcgcgcaactaccgscgsggcggatcgccgaggagccaggccaagcaactgatggagcatcctttsttctctstaattatccgccaaagacggcccagctgaccsagggttcgcgcactgagtcgaacattaXctacgtcacaggactgccgaggcgatcc3gcctgttcttsctscstcggagctggaggccaacgatggacccggccttgttttcttcsgcgaaggccgggaacgagttgcatccagcgctgaagtggccatcgttgtccgsgcgcctggggcgaggstcccctgctgcgtccatcacacgatgtcacsggsactgcgc6012018024030036〇420447〈210〉4<211>429〈212〉DNA<213〉梭菌属丙酮丁醇梭菌(Wo9tn'力'鄉sc"o力"0^z'c鹏)〈400〉4atgccaaatgC333t3Ct3tcaagaagttasagtccttt3tggcttaaattgaagtctatc33cttt3g3aagaatttagctgscttcacatgctaagtgattawbcatagaaattcttsttttccaaggtataatggttsattctgcacatggttaataagtttctttattgaaaagtgtcctaggttaaacaaggatggatattctatggagacatataccattacacacaagtaaggcccaatttgatatctgcaatcaggaagagccaagtagaatggttctgaagtcttgtaa_3attagstsagtgctaaagttttgtgtaagc42960120180240300360420<210〉5<211〉339<212〉DNA<213〉梭菌属丙酮丁醇梭菌(Gosz^rio7zMacez^力wt7乃'cMH)〈400〉5cagaaacggttaaatttgaaagtttataataaaatacggtatttcaacaagtaaagtctgcggctttttgttttaaaaacttgttatgcattgtgaattatattattgatataatcagcttgaattttgtgattatagtcatattaaataatatcgatactagtattaatgatattttatgtagacaactgtgtaaaatagacattaaatgtctaataaagttgaataaaatatatscaaactggcgtatttttttaaaatatcaaattttatcasagtaggtgtactaaagtcgtagattaggaaaggtttWtt333agataaaaaa6012018024〇300339〈210〉6〈211〉1233<212〉腿〈220〉〈223〉<400〉6aagcttatgcgtagaacsagtctgaaactatgtasaaagtgataagtggcaaagttgtaggtttstsatagaattttgtgatattttatgccattacsgccssgtsagccccwtttgtg3tctgc3agtaggasgagtgattcttgattcaaatgtgaassgttaaagatatcaagaaaccttt3Ctg己tt333tstgctttagctgcsa33t3cggtstgttstgc3tattatagtcat己gac33Ctggtgtactaataagtagaacagttctgaaaccttgtaaaaatagataagtgctaaagttgtgtgtaagcacgtctatsttatttagasgaaatttagattttagcasgtatcttcactaattasgtgcstgggtcgsctcttgtgaattatctggcgtattgccaaatgtgaa_tacta_tcaaga3gtt333gtcctttactgcttaaatatagaaattaatattttaggaawtcststtgsttcttgtcctccsaggggatctgcaacctgttaatggatttcttttggaagaggatcccagtcgtagagtaggaaaggtat3t3C3gttgaatttsgatgscttC3Ct3gctaagtgcaatagcaacaattca33agttacctaggttcscaaagtatgccc3ttct3tcsgsgaaacggtttaaagtctgcattattgatatatcgatscttttttaaaataaatttcttgttttccaagggataatggtaaattctgcasctggttaatgggtttcttttgattac3gcsgaatttgtggtctgcaagtctgaaaacattagaagsgtgcttcttgsttgtggctttttgttaatcagcttagt3ttaatgtctaataaag3tC333tttttgaaaagttacctsggttcactataaaagt3t3ttCt3tCgagacataas1233601201802403003604204805406006607207808409009601020108011401200权利要求1、一种DNA片段，其自上游至下游依次为调节基因、丁醇特异性启动子和报告蛋白的编码基因；所述调节基因为编码如下(a)或(b)所示蛋白的基因(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(a)衍生的蛋白质；所述报告蛋白为如下(1)或(2)所示的蛋白(1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(2)将序列表中序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。2、根据权利要求1所述的DNA片段，其特征在于所述调节基因为如下(c)、(d)或(e)所示的基因(c)其核苷酸序列是序列表中序列4所示DNA分子；(d)在严格条件下与(c)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；(e)与(c)限定的DNA序列有90。/Q以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子；所述报告蛋白的编码基因为如下(3)、(4)或(5)所示的基因(3)其核苷酸序列是序列表中序列3所示DNA分子；(4)在严格条件下与(3)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的咖A分子；(5)与(3)限定的DNA序列有90。/。以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子；所述丁醇特异性启动子的核苷酸序列为如下I、II、III或IV所示I至少含有序列表中序列5中自5'末端第148-198位核苷酸的DNA分子；II其核苷酸序列是序列表中序列5所示DNA分子；III在严格条件下与I或II限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；IV与I或II限定的DNA序列有90%以上同源性且具有相同功能的DNA分子。3、含有权利要求1或2所述DNA片段的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒。4、一种生物传感器，包括含有权利要求1或2所述DNA片段的重组菌或转基因细胞系。5、权利要求4所述生物传感器在检测丁醇中的应用。6、权利要求4所述生物传感器在筛选产丁醇的菌中的应用。7、一种蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(a)衍生的蛋白质。8、权利要求7所述蛋白的编码基因。9、权利要求7所述蛋白在制备生物传感器中的应用。10、权利要求8所述编码基因在制备生物传感器中的应用。全文摘要本发明公开了一种生物传感器及其应用。本发明提供的一种DNA片段，其自上游至下游依次为调节基因、丁醇特异性启动子和报告蛋白的编码基因；所述调节基因为编码如下(a)或(b)所示蛋白的基因(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(a)衍生的蛋白质。实验证明，本发明的传感器，在厌氧条件下能高效、特异和灵敏地检测丁醇，既可定性又可半定量，借助流式细胞仪、荧光显微镜以及酶标仪等仪器，实现了从大量微生物样品中高通量筛选产丁醇微生物或产丁醇能力强微生物，缩短和简化了筛选过程，解决了目前丁醇检测手段的费时、繁琐等缺点。文档编号C12Q1/04GK101418295SQ20081023947公开日2009年4月29日申请日期2008年12月11日优先权日2008年12月11日发明者张延平,寅李,贾开志申请人:中国科学院微生物研究所