专利名称：：新型α-半乳糖苷酶的制作方法
技术领域：
：本发明涉及新型a-半乳糖苷酶和使用该酶制造棉子糖的方法。
背景技术：
：近年来，随着饮食生活、社会生活多样化的发展，出于健康意识的提高，消费者对食品、食品材料等的关心程度也有所提高。其中，发现棉子糖具有改善肠内菌群等功能，因此作为食品、药品、香料等或者其原料而倍受关注。最近，已发现棉子糖具有免疫赋活作用、对特应性皮炎有用。现今，棉子糖是作为制造甜菜糖时的副产物回收的，而甜菜中的棉子糖含量不过是0.1%左右，棉子糖的生产量与主产物砂糖的生产量有关，所以棉子糖的增产有限。因此，为了稳定地以低成本向市场供给具有这样的有用特性的棉子糖，不仅需要来自天然的提取品，还需要来自低成本原料的合成品。作为迄今尝试的棉子糖的合成方法，可以举出利用cx-半乳糖苷酶的催化作用的方法，并且已经报道了以蔗糖为半乳糖受体，以蜜二糖为半乳糖供体来得到棉子糖的方法(例如参见专利文献1、非专利文献1、非专利文献2)。此外还报道了利用对硝基苯基-cc-D-吡喃半乳糖苷作为半乳糖供体的方法(例如，参见非专利文献3)、利用肌醇半乳糖苷作为半乳糖供体的方法(例如，参见专利文献2)、利用半乳二糖作为半乳糖供体的方法(例如，参见专利文献3)等。另外，还报道了一些可以利用低成本的蔗糖和半乳糖作为原料的例子。例如，公开了使用来源于朱红密孔菌(Pycnoporuscinnabarinus)的a-半乳糖苷酶得到棉子糖的方法(例如参见非专利文献4)，利用来源于葡酒色被孢霉(Mortierellavinacea)的a-半乳糖苷酶合成棉子糖的方法(例如参见非专利文献5)。专利文献l:日本特许第2688854号专利文献2:日本特开平10-84973专利文献3:日本特公平8-24592非专利文献1:Agric.BioLChem.，52(9)，2305-2311,1988非专利文献2:Biosci.Biotech.Biochem.,59(4),619-623，1995非专利文献3:Phytochemistry，18，35-38，1979非专利文献4:NipponShokuhinKogyoGakkaishi，38(8),722-728,1991非专利文献5:Carbohydr.Res.，185，139-146,1989
发明内容由于利用ct-半乳糖苷酶生成棉子糖的效率高，所以已经报道了利用蜜二糖、对硝基苯基-a-D-吡喃半乳糖苷、肌醇半乳糖苷、半乳二糖作为棉子糖合成原料的例子，但釆用这些方法的情况下，所使用的原料的价格高，难以在工业上制造棉子糖。另一方面，由于能够利用低成本原料蔗糖和半乳糖，所以使用来源于朱红密孔菌的oi-半乳糖苷酶得到棉子糖的方法或利用来源于葡酒色被孢霉的a-半乳糖苷酶合成棉子糖的方法是考虑工业性时非常有利的方法。但是，利用这些(x-半乳糖苷酶的情况下，在生成物中生成了目的棉子糖以外的杂三糖，所以需要从最终产品中分离出杂三糖，并且还产生了原料浪费的问题。将来源于朱红密孔菌的a-半乳糖苷酶用于棉子糖合成反应的情况下，生成的低聚糖中的棉子糖含有率低至40%;将来源于葡酒色被孢霉的(x-半乳糖苷酶用于棉子糖合成反应的情况下，生成的低聚糖中的棉子糖含有率低至60%，现有技术不能通过酶法选择性地制造棉子糖。基于这种情况，本发明的目的在于提供一种新的(x-半乳糖苷酶，其能够使用低成本的原料选择性地合成棉子糖，并且本发明还提供使用该酶的棉子糖的革新性制造方法。为了解决这些课题，本发明的发明人反复进行了深入研究，结果发现了一种能够选择性合成棉子糖的新酶，并发现了抑制目的棉子糖以外的杂质低聚糖的生成的棉子糖制造方法，从而完成了本发明。艮卩，本发明涉及下述的[1][20]所示的新型(X-半乳糖苷酶和棉子糖的制造方法等。一种a-半乳糖苷酶，具有下述特性(1)作用所述酶具有如下性质在以蔗糖和半乳糖为原料的脱水縮合反应中，生成的低聚糖中的棉子糖含有率为0.5%以上时，棉子糖的合成选择率为65%以上；(2)最适pH范围3'55.0;(3)稳定pH范围3.510.0;(4)分子量约80,000。如[l]所述的ct-半乳糖苷酶，其来源于属于凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)的微生物。如[2]所述的a-半乳糖苷酶，其中，所述凝结芽孢杆菌是凝结芽孢杆菌AKC003株、AKC004株(FERM-ABP10948)、AKC005株、AKC006株中的任意一种。一种凝结芽孢杆菌及其变异体，所述凝结芽孢杆菌属于凝结芽孢杆菌AKC003株、AKC004株(FERM-ABP10948)、AKC005株、AKC006株中任意一种。—种cc-半乳糖苷酶，其含有下述(a)、(b)或(c)中任意的氨基酸序列O)序列编号2表示的氨基酸序列；(b)序列编号2表示的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加了1个或几个氨基酸的氨基酸序列，其具有a-半乳糖苷酶活性；(c)与序列编号2表示的氨基酸序列具有60°/。以上的相同性的氨基酸序列，其具有a-半乳糖苷酶活性。—种a-半乳糖苷酶基因，其编码含有下述(a)、(b)或(c)中任意的氨基酸序列的a-半乳糖苷酶；(a)序列编号2表示的氨基酸序列；(b)序列编号2表示的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加了1个或几个氨基酸的氨基酸序列，其具有a-半乳糖苷酶活性；(c)与序列编号2表示的氨基酸序列具有60%以上的相同性的氨基酸序列，其具有a-半乳糖苷酶活性。—种a-半乳糖苷酶基因，其含有下述(a)或(b)的碱基序列(a)序列编号1表示的碱基序列；(b)序列编号1表示的碱基序列中缺失、取代和/或添加了1个或几个碱基的碱基序列，并且其编码具有(x-半乳糖苷酶活性的蛋白质。—种重组载体，其含有[6]或[7]所述的a-半乳糖苷酶基因。[9]一种转化体，其导入有[6]或[7]所述的a-半乳糖苷酶基因或[8]所述的重组载体。—种a-半乳糖苷酶，其是培养[9]所述的转化体而得到的。一种酶组合物，其含有[1][3]、[5]或[10]的任一项所述的ct-半乳糖苷酶。如[ll]所述的酶组合物，其中，该组合物还含有选自(x-葡糖苷酶、P-葡糖苷酶、卩-半乳糖苷酶、纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶、半乳聚糖酶、阿拉伯聚糖酶(arabinanase)、甘露聚糖酶、鼠李半乳糖醛酸酶、聚半乳糖醛酸酶、果胶甲酯酶、果胶裂解酶以及聚半乳糖醛酸裂解酶的至少一种以上的成分。—种棉子糖合成试剂，其含有[11]或[12]任一项所述的酶组合物。一种棉子糖的制造方法，其特征在于，该制造方法使用[1][3]、[5]或[10]的任一项所述的(x-半乳糖苷酶；[11]或[12]所述的酶组合物；或者[13]所述的棉子糖合成试剂。—种棉子糖的制造方法，其特征在于，该方法利用微生物催化剂，所述微生物催化剂是培养属于凝结芽孢杆菌的微生物而得到的。—种棉子糖的制造方法，其特征在于，该方法利用微生物催化剂，所述微生物催化剂是培养属于凝结芽孢杆菌AKC003株、AKC004株(FERM-ABP10948)、AKC005株、AKC006株中任意一种凝结芽孢杆菌和/或其变异体而得到的。—种棉子糖的制造方法，其特征在于，该方法利用微生物催化剂，所述微生物催化剂是培养[9]所述的转化体而得到的。如[14][17]中任一项所述的棉子糖的制造方法，其中，生成的低聚糖中的棉子糖含有率为65%以上。如[14][18]中任一项所述的棉子糖的制造方法，其中，该方法使用蔗糖和半乳糖作为原料。如[19]所述的棉子糖的制造方法，其中，原料中的蔗糖浓度为30%(w/v)90°/。(w/v)，原料中的半乳糖浓度为2%(w/v)45%(w/v)。通过釆用本发明，能够选择性地制造棉子糖。图1给出了由凝结芽孢杆菌AKC-004菌体提纯的(x-半乳糖苷酶的最适pH范围(实施例2)。图2给出了由凝结芽孢杆菌AKC-004菌体提纯的cc-半乳糖苷酶的稳定pH范围(实施例2)。图3给出了由凝结芽孢杆菌AKC-004菌体提纯的oc-半乳糖苷酶的最适温度范围(实施例2)。图4给出了由凝结芽孢杆菌AKC-004菌体提纯的a-半乳糖苷酶的稳定温度范围(实施例2)。图5给出了由凝结芽孢杆菌AKC-004菌体提纯的oi-半乳糖苷酶的SDS-PAGE(实施例2)的结果。图6给出了对使用由凝结芽孢杆菌AKC-004株提纯的(x-半乳糖苷酶的糖合成(实施例3)的反应液进行HPLC分析的结果。图7给出了对使用由重组大肠杆菌JM109株得到的a-半乳糖苷酶的糖合成(实施例5)的反应液进行HPLC分析的结果。图8给出了对使用培养凝结芽孢杆菌AKC-004株而得到的微生物催化剂的糖合成(实施例3)的反应液进行HPLC分析的结果。具体实施例方式下面对本发明进行具体说明。本发明的cx-半乳糖苷酶来源于属于凝结芽孢杆菌的微生物，作为该微生物，可以使用属于凝结芽孢杆菌的微生物中的任意微生物，并可以使用表达能够选择性合成棉子糖的oi-半乳糖苷酶的任意微生物。可以优选举出凝结芽孢杆菌AKC-003株、AKC-004株、AKC-005株、AKC-006株。另外，本发明中的微生物还可以是以属于凝结芽孢杆菌的微生物为母株得到的变异株。凝结芽孢杆菌AKC-003株、AKC-004株、AKC-005株、AKC-006株均在2006年(平成18年)ll月14日保藏在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(日本国茨城县筑波市东一丁目1番地1中央第6)。保藏编号如下。需要说明的是，AKC-004株于2008年(平成20年)l月30日以受理编号FERM-ABP10948以及保藏编号FERM-BP10948移交到国际保藏。AKC-003株(FERMP-21091)AKC-004株(FERMP-21092;FERM-ABP10948;FERM-BP10948)AKC-005株(FERMP-21093)AKC-006株(FE腹P-21094)本发明的cx-半乳糖苷酶具有下述特性。(1)作用所述酶具有如下性质在以蔗糖和半乳糖为原料的脱水縮合反应中，生成的低聚糖中的棉子糖含有率为0.5%以上时，棉子糖的合成选择率为65%以上；(2)最适pH范围3'55.0;(3)稳定pH范围3.510.0;(4)分子量约80,000。作为本发明的酶的具体例，可以举出在底物特异性和金属离子的影响方面具有下述性质的酶。底物特异性以对硝基苯基-(X-D-吡喃半乳糖苷作为底物的情况下，分解活性最高，其后依次为蜜二糖、棉子糖。另一方面，对硝基苯基-p-D-吡喃半乳糖苷、乳糖、蔗糖不发生分解。金属离子的影响添加钾离子、钙离子、镁离子、铬离子、锰离子、钴离子、铁(n)离子或铁(m)离子的各情况下，未见活性的降低。另一方面，添加镍离子或锌离子的各情况下，可见活性的降低，添加铜离子的情况下，活性降低最大。另外，作为本发明的酶的具体例，还可以举出具有下述特性的酶。(5)(正反应的)最适温度范围3550°C;(6)稳定温度范围45'C以下稳定。作为用于本发明的微生物的培养方法，采用常规的通气搅拌培养或者固体培养，并且可以采用通常进行的微生物培养方法。作为培养基，可以举出合成培养基或天然培养基，其中含有使该微生物生育良好且顺畅地生成微生物中的oc-半乳糖苷酶所必须的碳源、氮源、无机盐、必须的营养源等。例如，作为碳源，可以使用葡萄糖、甘油、蔗糖、半乳糖、乳糖、蜜二糖、棉子糖、水苏糖、纤维素二糖、吡喃葡糖基蔗糖、有机酸、淀粉、橄榄油、大豆油等。作为氮源，例如可以举出硫铵、硝铵、脲、氨基酸、胺类、氨、各种无机酸或有机酸的铵盐、其他含氮化合物、蛋白胨、胰化蛋白胨、聚胨、肉汤、酵母提取液、棉籽粕、玉米桨和大豆粕等。另外，作为无机盐类，可以举出磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸锰、硫酸铜、硫酸铁、碳酸转等。从微生物的生育性的方面考虑，培养温度优选为2580°C，更优选为4065°C，进一步优选为4055°C。另外，培养基的pH可在较宽范围进行选择，但从微生物的生育性的方面考虑，优选pH3.09.0，更优选pH3.58.5，进一步优选pH4.08.0。本发明的a-半乳糖苷酶的分离、提纯例如可以如下实施。用上述的培养基培养凝结芽孢杆菌AKC-004株，通过离心分离、过滤等公知的方法将所得到的培养液分离成菌体和滤液。如此得到的菌体中含有a-半乳糖苷酶，通过使用溶菌酶、超声波破碎机、弗氏压碎器等进行菌体破碎，得到a-半乳糖苷酶的粗提取液。根据培养条件等，有时在培养上清液中含有(x-半乳糖苷酶的活性，这种情况下，可以将培养上清液直接作为a-半乳糖苷酶的粗提取液用于下面的提纯，也可以对培养上清液进行浓縮等操作，然后作为(x-半乳糖苷酶的粗提取液用于下面的提纯。将如此得到的粗提取液通过常规的蛋白质提纯法(例如离子交换色谱法、疏水性色谱法、凝胶过滤色谱法、羟基磷灰石色谱法、盐析等的组合)来进行分离，由此可以提纯oc-半乳糖苷酶。无论上述操作的顺序如何，各操作均可进行1次或2次以上。另外，优选在以各柱洗脱试样前，通过透析等使试样液与适当的缓冲液交换。另外，还可以在各个阶段对试样液进行浓縮。优选提纯的各阶段中，对分离的各级分中所含有的a-半乳糖苷酶活性进行测定，将活性高的级分集中起来，供下一阶段使用。对于测定a-半乳糖苷酶活性的方法，例如在含有6mM对硝基苯基陽a-D-卩比喃半乳糖苷的450pL乙酸钠缓冲液(100mM，pH5.0)中混合150fiL酶液，在4(TC进行530分钟左右的反应后，将反应液添加到lmL碳酸钠水溶液(1M)中，使酶失活，停止反应。测定所得到的溶液在波长420nm的吸收(所得到的溶液的着色度)，使用以各浓度的对硝基苯酚制作的校准曲线计算出浓度。另外，酶活性的单位如下以在上述条件下1分钟游离出lpmol对硝基苯酚的酶量为1U。经提纯的a-半乳糖苷酶的提纯度的确认和分子量的测定可以通过电泳或凝胶过滤色谱法等进行。另外，酶学性质可以如下进行研究改变反应温度或者反应pH，测定酶活性；或者将各种酶抑制剂或金属离子等添加到反应液中，测定残存活性。另外，通过将a-半乳糖苷酶在各种pH条件下或温度条件下放置一定时间后再测定酶活性，由此能够考察稳定pH范围和稳定温度范围。另外，通过改变底物浓度来进行反应，能够求出a-半乳糖苷酶对各底物的米氏常数(Km)、最大速度(VmJ。本发明的a-半乳糖苷酶基因可通过例如下述方法获得。用上述的培养基培养凝结芽孢杆菌AKC-004株，通过离心分离、过滤等公知的方法将所得到的培养液分离成菌体和滤液。使用溶菌酶、超声波破碎机、弗氏压碎器等对如此得到的菌体进行菌体破碎，分离染色体DNA。用各种限制性内切酶对如此得到的染色体DNA进行消化，得到DNA碎片。使用如此得到的染色体DNA碎片，通过利用鸟枪克隆法、反向PCR法等公知的手段获得含有a-半乳糖苷酶基因的全长或一部分的DNA碎片。此处得到的含有cc-半乳糖苷酶基因的DNA碎片的碱基序列可通过利用DNA测序仪等的公知方法进行解析，并明确其碱基序列。另外，仅知道a-半乳糖苷酶基因的部分碱基序列的情况下，可以以该碱基序列为基础，再次获得含有ct-半乳糖苷酶基因的DNA碎片。并且，通过重复该操作，能够解明a-半乳糖苷酶基因全长的碱基序列。可以以如上解读的a-半乳糖苷酶基因的碱基序列为基础，通过PCR法或使用限制性内切酶的公知方法来得到含有(x-半乳糖苷酶基因的全长的DNA碎片。如此，根据所解读的a-半乳糖苷酶基因的碱基序列，可以确定a-半乳糖苷酶的氨基酸序列。序列编号2举出了本发明的a-半乳糖苷酶的氨基酸序列，但只要含有该氨基酸序列的蛋白质具有a-半乳糖苷酶活性，该氨基酸序列可以具有缺失、取代、添加至少1个氨基酸等的变异，或者可以是与该氨基酸序列具有60%以上的相同性的氨基酸序列。即，本发明的a-半乳糖苷酶是含有下述(a)、(b)或(c)中任意的氨基酸序列的(x-半乳糖苷酶。(a)序列编号2表示的氨基酸序列；(b)序列编号2表示的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加了1个或几个氨基酸的氨基酸序列，其具有a-半乳糖苷酶活性；(c)与序列编号2表示的氨基酸序列具有60%以上的相同性的氨基酸序列，其具有cc-半乳糖苷酶活性。另夕卜，根据本发明，提供一种编码含有下述(a)、(b)或(c)中任意的氨基酸序列的cc-半乳糖苷酶的ct-半乳糖苷酶基因。(a)序列编号2表示的氨基酸序列；(b)序列编号2表示的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加了1个或几个氨基酸的氨基酸序列，其具有oi-半乳糖苷酶活性；(c)与序列编号2表示的氨基酸序列具有60%以上的相同性的氨基酸序列，其具有a-半乳糖苷酶活性。上述(b)中的"1个或几个氨基酸"通常是指150个氨基酸，优选为130个氨基酸，更优选为120个氨基酸，进一步优选为110个氨基酸，特别优选为15个氨基酸。上述(C)中的"具有60%以上的相同性的氨基酸序列"通常是指具有60%以上(优选70%以上、更优选为80%以上、进一步优选为卯％以上、再进一步优选为95%以上、特别优选为99°/。以上)的相同性的氨基酸序列。作为本发明的a-半乳糖苷酶基因的具体例，可以举出含有下述(a)或(b)的碱基序列的a-半乳糖苷酶基因。(a)序列编号1表示的碱基序列；(b)序列编号1表示的碱基序列中缺失、取代和/或添加了1个或几个碱基的碱基序列，并且其编码具有oc-半乳糖苷酶活性的蛋白质。上述(b)中的"1个或几个碱基"通常是指1150个碱基，优选l90个碱基，更优选为160个碱基，进一步优选为130个碱基，进一步优选为120个碱基，进一步优选为115个碱基，进一步优选为lIO个碱基，特别优选为15个碱基。本发明的a-半乳糖苷酶基因可通过公知的基因操作方法进行不损害原本的催化反应的性质的肽的变异，这样的变异基因是指通过基因工学的方法由本发明的(x-半乳糖苷酶基因制作的人工变异基因，该人工变异基因可通过使用部位特异的变异法、用人工变异DNA取代目的基因的特定DNA碎片的方法等各种基因工学方法来得到。g卩，作为使a-半乳糖苷酶中的氨基酸发生缺失、取代、添加等变异的方法，可以利用PCR法、错配PCR法、DNA改组法、制作融合酶的方法等公知的方法。可以将如此得到的含有完整的a-半乳糖苷酶结构基因的DNA碎片插入大肠杆菌用表达载体(例如pBluescriptIIKS(+))的多克隆位点并连接，构成新的重组质粒。对于该质粒载体，由于导入有能在大肠杆菌中将作为外来基因而连接的基因有效表达的lac启动子，所以通过培养在大肠杆菌中导入重组质粒所得到的转化体，能够大量表达ct-半乳糖苷酶。另外，除上述以外，还可以利用各种宿主微生物、载体来大量表达a-半乳糖苷酶，例如通过培养桥石短小芽孢杆菌(Brevibacilluschoshinensis)的转化体，能够大量表达a-半乳糖苷酶。更详细地说，作为导入本发明的(x-半乳糖苷酶基因的载体，适合的有由能够在宿主微生物体内自律繁殖的噬菌体或质粒制成的用于基因重组的载体，作为噬菌体载体，例如以属于大肠杆菌的微生物作为宿主微生物的情况下，可以使用人gt，人C、Xgf人B等。另外，作为质粒载体，例如以大肠杆菌作为宿主微生物的情况下，可以使用质粒pET-3a、pET-lla、pET-32a等pET载体(Novagen)或pBR322、pBR325、pACYC184、pUC12、pUC13、pUC18、pUC19、pUC118、pINI、BluescriptKS+;以枯草菌作为宿主的情况下，可以使用pWH1520、pUB110、pKH300PLK;以放线菌为宿主的情况下，可以使用pIJ680、pIJ702;以酵母特别是酿酒酵母作为宿主的情况下，可以使用YRp7、pYCl、YEpl3等。将这样的载体用限制性内切酶切断，使生成的末端与以用于切断本发明的a-半乳糖苷酶基因的限制性内切酶生成的DNA末端相同，从而制成载体碎片，利用DNA连接酶依照常规方法使本发明的(x-半乳糖苷酶基因碎片和载体碎片结合，由此能够将编码本发明的a-半乳糖苷酶基因的DNA导入目的载体。作为导入质粒的宿主微生物，只要重组DNA能够稳定且自律地增殖即可，例如宿主微生物是属于大肠杆菌的微生物的情况下，可以利用大肠杆菌BL21、大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌BL21trxB、大肠杆菌Rosetta(DE3)、大肠杆菌Rosetta、大肠杆菌Rosetta(DE3)pLysS、大肠杆菌Rosetta(DE3)pLacl、大肠杆菌RosettaBhie、大肠杆菌Rosetta画gami、大肠杆菌Origami、大肠杆菌Origami、大肠杆菌Tuner、大肠杆菌DH1、大肠杆菌JM109、大肠杆菌W3110、大肠杆菌C600等。另外，微生物宿主是属于芽胞杆菌属的微生物的情况下，可以利用枯草芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌等；微生物宿主是属于放线菌的微生物的情况下，可以利用变铅青链酶菌TK24等；微生物宿主是属于酿酒酵母的微生物的情况下，可以利用酿酒酵母INVSC1等。另外，通过转化微生物制造本发明的(x-半乳糖苷酶时，用营养培养基培养该转化微生物，在菌体内或培养液中产生本发明的a-半乳糖苷酶，培养结束后，通过过滤或离心分离等方法由所得到的培养物采集菌体，接下来，用机械方法或溶菌酶等酶的方法破坏该菌体，或者根据需要添加EDTA和域适当的表面活性剂等，浓縮本发明的a-半乳糖苷酶的水溶液或不进行浓縮而直接通过硫铵分级、凝胶过滤、亲和色谱法等吸附色谱法、离子交换色谱法进行处理，由此可以得到纯度好的本发明的a-半乳糖苷酶。关于转化微生物的培养条件，选择培养条件时考虑其营养生理性质即可，通常通过液体培养进行培养，工业上进行深部通气搅拌培养是有利的。作为培养基的营养源，可以广泛地使用微生物培养中通常使用的营养源。培养温度可以在微生物能够繁殖且能生产本发明的a-半乳糖苷酶的范围适当变化，以大肠杆菌为例，培养温度优选为1045'C左右，进一步优选为203(TC左右。根据情况，培养条件多少有些不同，但只需预期本发明的(x-半乳糖苷酶达到最高产率的时期，在适当的时期结束培养即可，以大肠杆菌为例，通常培养时间为1248小时左右。培养基pH可以在细菌能够繁殖且能生产本发明的a-半乳糖苷酶的范围适当变化，以大肠杆菌为例，培养基pH优选为pH68左右。根据本发明，使用所述酶时，只要不抑制本发明的酶的作用，对提纯程度等并没有特别限定，除了使用经提纯的本发明的酶之外，也可以使用含有该酶的混合物。根据本发明，提供了含有上述的本发明的a-半乳糖苷酶的酶组合物。上述酶组合物可以进一步含有例如选自a-葡糖苷酶、(3-葡糖苷酶、|3-半乳糖苷酶、纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶、半乳聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、甘露聚糖酶、鼠李半乳糖醛酸酶、聚半乳糖醛酸酶、果胶甲酯酶、果胶裂解酶以及聚半乳糖醛酸裂解酶的至少一种以上的成分。根据本发明，提供了含有上述的酶组合物的棉子糖合成试剂。本发明中，作为微生物催化剂，除了凝结芽孢杆菌AKC-004株之外，还可以使用上述的转化体。本发明中，作为用于制造棉子糖的微生物催化剂，可以利用通过常规进行的培养方法得到的微生物本身，而无需从微生物提纯a-半乳糖苷酶。另外，有时可以利用微生物培养液、微生物培养上清液。另一方面，也可以根据需要在用水或缓冲液等对通过培养法得到的微生物进行清洗后再加以利用。例如，可以使用经培养的微生物的培养液；或通过离心分离、用缓冲液进行清洗等而得到的微生物悬浮液；悬浮或溶解有微生物或微生物的处理物(例如微生物的破碎物等)的水溶液；用包埋法、交联法或者载体结合法而固定的微生物或者微生物处理物。作为进行固定化时的固定化载体的例子，可以举出玻璃珠、硅胶、聚氨酯、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、角叉菜胶、藻酸等，但并不限于这些。根据本发明，提供了一种棉子糖的制造方法，该方法使用上述的本发明的a-半乳糖苷酶、含有ct-半乳糖苷酶的酶组合物、棉子糖合成试剂或微生物催化剂。作为原料，例如可以使用蔗糖和半乳糖。利用蔗糖和半乳糖作为原料时，例如，从利用a-半乳糖苷酶进行脱水縮合反应的性质方面出发，优选原料浓度高，但半乳糖浓度过高时，半乳糖的分子间縮合抑制了蔗糖与半乳糖之间的脱水縮合反应，蔗糖浓度优选设定在30%(w/v)90%(w/v)，更优选为35%(w/v)80%(w/v)，进一步优选为40°/。(w/v)70%(w/v)。半乳糖浓度优选设定为2%(w/v)45%(w/v)，更优选为5%(w/v)35%(w/v)，进一步优选为7%(w/v)30°/。(w/v)。另外，优选制备成原料中的蔗糖和半乳糖均可溶的浓度。使用本发明的ot-半乳糖苷酶、含有ct-半乳糖苷酶的酶组合物、含有酶组合物的棉子糖合成试剂或微生物催化剂制造棉子糖时，从反应速度、酶的稳定性的方面考虑，反应温度优选为1090°C，更优选为2070°C，进一步优选为3060°C。反应pH可在较宽范围进行调整，从酶的稳定性的方面考虑，优选pH2.010.0，更优选pH3.07.5，进一步优选为3.56.0。反应时间根据酶的用量而有所不同，考虑到工业上的利用时，通常优选为为20分钟200小时，更优选为6小时80小时。但是，本发明并不限于以上的反应条件和反应形态，可以适当地进行选择。本发明中，在使用oc-半乳糖苷醇、含有ot-半乳糖苷酵的酶组合物或含有酶组合物的棉子糖合成试剂的棉子糖合成反应中，棉子糖在反应溶液中累积0.5%以上时，生成的低聚糖中的棉子糖含有率可以提高到65%以上，在更优选的条件下，可以提高到80%以上。在反应溶液中累积棉子糖达到0.75%以上、进而1.0%以上时，可以实现本发明中生成的低聚糖中的棉子糖高含有率。另外，使用微生物本身的棉子糖合成反应中，通常由于杂酶的影响，生成的低聚糖中的棉子糖含有率低，而使用本发明的微生物催化剂的棉子糖合成反应中，生成的低聚糖中的棉子糖含有率高。本发明得到的生成的低聚糖中的棉子糖含有率可通过下述方法测定。棉子糖合成反应结束后，将反应液稀释25倍，在99"保持10分钟，由此停止反应。反应停止后，通过离心分离除去微生物，用高速液相色谱法(HPLC)对所得到的反应溶液进行定量。测定使用Thermoelectron社制造的Hypercarb柱，检测器使用RI。生成的低聚糖中的棉子糖含有率根据在HPLC分析谱图中检测到的各个峰的面积比通过(棉子糖的峰面积)/(生成的低聚糖的峰面积)x100来计算。作为对通过本发明的方法制造的棉子糖进行提纯、分离的方法，可以利用通常采用的提纯处理方法。即，例如可通过离心分离、利用MF(微滤)膜或UF(超滤)膜等的膜处理、压滤机等除去微生物催化剂；通过阳离子交换色谱法、阴离子交换色谱法等色谱处理或透析等脱盐处理来除去由缓冲液、培养基等带入的盐类等；以及通过阳离子交换色谱法、阴离子交换色谱法、高速液相色谱法、活性炭色谱法等色谱处理或利用溶解度差等的结晶化处理、其他常规方法进行oc-低聚半乳糖的分离、提纯。色谱处理可以单独使用这些方法，也可以组合使用这些方法，并可以适当利用移动床方式、模拟移动床方式、多成分分离模拟移动床方式、多成分分离循环方式等。这些棉子糖的提纯、分离处理方法可以分批式进行，也可以利用柱等连续进行。下面通过实施例具体进行说明，但本发明并不受这些实施例的任何限制。实施例实施例1将凝结芽孢杆菌AKC-004株(保藏编号FERMP-21092(移交为FERM-ABP10948);保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心)用TBAB(胰蛋白胨血琼脂基础，TryptoseBloodAgarBase)培养板(Difco)在55"C培养l天，形成菌落。将30rnL调整到pH7.2的表1所示的培养基装入150mL的三角烧瓶中，用接种环从上述培养板接种菌落，在50。C、180rpm进行25小时旋转振荡培养，以此作为罐培养种子。培养基组成<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>接着，将6L调整到pH7.2的表1所示的培养基放入10L的发酵罐，移植15mL上述的罐培养种子，以50。C、200rpm、0.2vvm的条件通气搅拌培养48小时。接着，将该培养液在4"C进行10，000gx30分钟的离心分离，除去上清液，回收菌体。测定所得到的菌体的a-半乳糖苷酶的活性，该活性为261U。将该菌体用含有50mMTris-HCl、20mMEDTA、50mM葡萄糖的Lysis缓冲液(pH8.0)悬浮，并定量到150mL。将该悬浮液在4匸进行10,000gx30分钟的离心分离，除去上清液，回收菌体。将用Lysis缓冲液清洗后的菌体再次悬浮在上述Lysis缓冲液中，定量为150mL。在其中添加0.02n/。的溶菌酶(Sigma社制造，来自蛋白)，以37°C、120rpm的条件振荡13小时，进行菌体破碎。将菌体破碎后的溶液在4'C进行10，000gx30分钟的离心分离，除去菌体残渣，回收上清液。在该上清液中加入硫酸铵，并达到37.5%饱和，在4'C放置一夜，生成沉淀。在4。C进行10，000gx30分钟的离心分离，除去该沉淀，回收上清液。在该上清液中加入硫酸铵，并达到54.5%饱和，在4。C放置一夜，生成沉淀。在4'C进行10,000gx30分钟的离心分离，回收该沉淀，并将其溶解到pH7.0的20mM磷酸缓冲液中，在4i:对与上述相同的磷酸缓冲液进行一夜透析。使通过透析得到的上清吸附在用与上述相同的磷酸缓冲液平衡化后的"DEAESepharoseFF"(GEHealthcareBio-Sciences株式会社)上后，通过含有00.4M氯化钠的pH7.0的20mM磷酸缓冲液的浓度梯度法将酶洗脱出来。收集上述洗脱出的活性级分，使用平均分级分子量10,000的超滤膜进行浓縮，使其吸附在用含有2M氯化钠的pH7.0的20mM磷酸缓冲液平衡化后的"HiTrapPhenylFF(highsub)"(GEHealthcareBio-Sciences株式会社)后，通过含有2，00M氯化钠的pH7.0的20mM磷酸缓冲液的浓度梯度法将酶洗脱出来。收集上述洗脱出的活性级分，使用平均分级分子量10,000的超滤膜进行浓縮，使其吸附在用pH7.0的20mM磷酸缓冲液平衡化后的"MonoQ5/50GL"(GEHealthcareBio-Sciences株式会社)后'通过含有00.4M氯化钠的pH7.0的20mM磷酸缓冲液的浓度梯度法将酶洗脱出来。收集上述洗脱出的活性级分，使用平均分级分子量10,000的超滤膜进行浓縮，使其填充在用pH7.0的20mM磷酸缓冲平衡化后的"HiLoad16/60Superdex200"(GEHealthcareBio-Sciences株式会社)中后，用相同的缓冲液进行洗脱。收集上述洗脱出的活性级分，使用平均分级分子量IO，OOO的超滤膜进行浓縮，制成提纯(x-半乳糖苷酶。活性收率为15%，活性为270U/mL。使用实施例1得到的提纯a-半乳糖苷酶，进行关于其作用的实验。(l)最适pH范围在150|iL溶解有6mM对硝基苯基-a-D-吡喃半乳糖苷的各pH的lOOmM缓冲液中混合50pL经100倍稀释的本发明的提纯酶液，在40°C反应5分钟。反应后，通过对游离的对硝基苯酚进行定量来测定活性，求出设最大活性为100时的相对活性。其结果见图1。需要说明的是，所使用的缓冲液是甘氨酸-HCl缓冲液(pH2.53.5)、乙酸钠缓冲液(pH3.56.0)、磷酸钠缓冲液(pH6.08.5)、甘氨酸-NaOH缓冲液(pH8.510.0)。(2)稳定pH范围使用pH4.010.0的范围的10mM缓冲液，在各pH于45。C进行140分钟加热处理，测定其残存活性，与上述同样地求出设最大活性为100时的相对活性。其结果见图2。需要说明的是，所使用的各pH的缓冲液的种类与上述相同。(3)最适温度范围在l卯pL溶解有4.7mM对硝基苯基-(x-D-吡喃半乳糖苷的pH4.5的乙酸钠缓冲液中混合1OjliL经20倍稀释的本发明的提纯酶液，在2060。C的范围反应5分钟。反应后，对游离的对硝基苯酚进行定量，由此测定活性，求出设最大活性为IOO时的相对活性。其结果见图3。(4)稳定温度范围使用pH4.5的100mM乙酸钠缓冲液，在3055。C的各温度进行20分钟的加热处理，测定其残存活性，与上述同样地求出设最大活性为100时的相对活性。其结果见图4。C5)分子量使用分离凝胶浓度为10%的"k亍V—f/PJ"(日本Bio-RadLaboratories株式会社)，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳求出分子量。其结果见图5。分子量约为80,000，这与由氨基酸序列推定的分子量83,122大致一致。(7)底物特异性在150pL含有10mM各种底物的pH4.5的100mM乙酸钠缓冲液中混合50^iL经100倍稀释的本发明的提纯酶液，在4(TC进行20分钟反应。但是，对于使用对硝基苯基-a-D-吡喃半乳糖苷作为底物的反应，将反应时间设定为5分钟。反应后，对游离的对硝基苯酚定量、或者使用"ShodexSUGAR"(昭和电工株式会社)柱通过高速液相色谱法进行分析，对分解的底物进行定量，求出设最大活性为100时对各底物的相对活性。该结果见表2。另外，对于其中能够作为底物的物质，测定反应速度，其结果见表3。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>cc-半乳糖苷酶的反应速度常数<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>(8)抑制因子在溶解有6mM对硝基苯基-a-D-吡喃半乳糖苷的pH4.5的乙酸钠缓冲液中添加各种金属离子，使最终浓度为lmM，并定量到150pL，混合50pL经100倍稀释的本发明的提纯酶液，在40'C反应20分钟。反应后，对游离的对硝基苯酚进行定量，由此测定活性，求出设最大活性为100时的相对活性。该结果见表4。[表4:金属对a-半乳糖苷酶的抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>实施例3取0.5U实施例1所述的提纯a-半乳糖苷酶，将其添加到装在1.5mL聚丙烯制管中的200pL糖液(pH5.0的100mM乙酸钠缓冲液中含有73%蔗糖、12%半乳糖)中并混合，在6(TC、1，200rpm进行反应。反应开始45小时后，采集反应液之中的20^L，用480pL蒸馏水进行稀释后，在99'C处理10分钟，由此使酶热失活。将热失活后的稀释糖液降温到常温，使用"Hypercarb"(Thermoelectron社制造)柱，通过高速液相色谱法进行分析。其结果见图6。生成的低聚糖中的棉子糖含有率为82%，反应液中的棉子糖浓度为1.67重量％。实施例4(1)染色体DNA的制备通过常规方法制备凝结芽孢杆菌AKC-004株的染色体DNA。对60mL以实施例1所述的方法取得的凝结芽孢杆菌AKC-004株的培养液进行离心分离，回收菌体。将所得到的菌体悬浮在Lysis缓冲液(50mMTris-HCl(pH8.0)、20mMEDTA、50mM葡萄糖)中，充分清洗。进行离心分离，回收菌体后，再次悬浮于Lysis缓冲液中，在其中加入溶菌酶，在37。C培养45分钟。接着，添加SDS和RNase，在37。C培养45分钟。其后，添加蛋白酶K，在5(TC缓慢振荡60分钟。将此处得到的溶液用苯酚-氯仿和氯仿处理后，用乙醇沉淀，将析出的核酸缠在玻璃移液管上，进行回收。该核酸用70%乙醇清洗后，进行干燥，并再次溶解在TE中。通过该操作，制备出约lmg的染色体DNA。(2)a-半乳糖苷酶基因的分离根据上述(l)制备的染色体DNA设计用于扩增a-半乳糖苷酶基因碎片的PCR引物并进行合成。可以基于源自公知的几种微生物的a-半乳糖苷酶基因的序列分析结果来进行引物的设计，作为上游引物合成具有5'-GAAGTITACGGITTYAGYYTTGTITACAGYGG-3'(序列编号3)序列的低聚DNA，作为下游引物合成具有5'-CCAAACCAICCRTCRTCIARIACRAA-3'(序列编号4)序列的低聚DNA。需要说明的是，序列中，I表示肌苷，Y表示C或T，R表示A或G。使用此处得到的PCR引物，以上述(l)中制备的染色体DNA为模板，通过PCR法进行a-半乳糖苷酶基因碎片的扩增，得到含有380个碱基对的a-半乳糖苷酶基因碎片。使用DNA测序仪，对此处得到的基因碎片的碱基序列进行解析。为了基于解析得到的a-半乳糖苷酶基因碎片的碱基序列获得含有a-半乳糖苷酶基因全长的DNA碎片，设计并合成了反向PCR用PCR引物。作为上游弓i物合成具有5'-TGATCAACAACTGGGAAAGCGACCT-3'(序列编号5)序列的低聚DNA，作为下游引物合成具有5'-GAACTGGTCCTGCTGCACAATTCC-3'(序列编号6)序列的低聚DNA。接着，制备用于反向PCR的模板。将上述(l)中制备的染色体DNA用限制性内切酶HindIII消化后，将所得到的DNA碎片用T4DNALigase进行自身环化，制成反向PCR的模板。对于该模板，使用如上合成的反向PCR用引物，通过PCR法进行含有a-半乳糖苷酶基因的DNA碎片的扩增，得到含有a-半乳糖苷酶基因的全序列的由4500个碱基对构成的PCR产物。(3)碱基序列的解析使用DNA测序仪，由(2)中得到的PCR产物确定a-半乳糖苷酶基因的碱基序列。结果解读到具有从序列编号1所示的5'末端开始的DNA碱基序列的2190个碱基对的a-半乳糖苷酶的结构基因。该序列是迄今未被发现的新型基因。另外，由该DNA碱基序列类推的凝结芽孢杆菌AKC-004株生产的oc-半乳糖苷酶含有730个氨基酸，具有序列编号2所示那样的从N末端开始的氨基酸序列。数据库检索的结果如下该氨基酸序列与来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)的a-半乳糖苷酶(AgaN)具有.57%的相同性，与来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌的a-半乳糖苷酶(AgaA)具有56°/。的相同性，与来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌的a-半乳糖苷酶(AgaB)具有56%的相同性，与来源于棉子糖乳球菌(Lactococcusraffinolactis)的a-半乳糖苷酶具有56%的相同性，表明其编码新型oc-半乳糖苷酶。(4)a-半乳糖苷酶基因的表达质粒载体的构建和转化基于(3)中得到的a-半乳糖苷酶基因的序列，设计并合成用于扩增含有a-半乳糖苷酶基因的SD序列、结构基因、终止密码子的区域的PCR引物。基于(2)中得到的含有4500个碱基对的PCR产物的碱基序列进行PCR引物的设计，作为上游引物合成具有5'-TAAGGTAAAGCAGATGTGCCATT-3'(序列编号7)序列的低聚DNA，作为下游引物合成具有5'-TTACTCGTACACCGCCTC-3'(序歹U编号8)序列的低聚DNA。以(2)中得到的含有4500个碱基对的PCR产物作为模板，使用合成的PCR引物，通过PCR法进行扩增，得到含有2325个碱基对的PCR产物。对此处得到的PCR产物进行末端平滑化、磷酸化。用限制性内切酶EcoRV对pBluescriptIIKS(+)载体进行消化并进行脱磷酸化，在该载体上连接上述得到的经末端平滑化、磷酸化的PCR产物，制成新的质粒载体pBlue/agaA。该质粒载体中导入有能够在大肠杆菌中有效表达作为外来基因而连接的基因的lac启动子，能够有效地表达、制造a-半乳糖苷酶。通过热激，将所得到的质粒载体转化到利用氯化钙法制备的大肠杆菌JM109株感受态细胞中，制作重组微生物。(5)转化体的培养和a-半乳糖苷酶的表达将(4)中制作的重组大肠杆菌JM109-pBlue/agaA用含有100mg/L氨苄青霉素的30mLLB培养基在37'C振荡培养24小时。培养后，进行离心分离来回收重组大肠杆菌。菌体用10OmM乙酸钠缓冲液(pH5.0)清洗后，再次悬浮于同样的缓冲液中，用超声波破碎机进行破碎。通过上述方法测定该破碎液的a-半乳糖苷酶活性，结果为19.9U/培养液(mL)。实施例5取l.OU实施例4所述的通过培养重组体所得到的a-半乳糖苷酶，将其添加到装在1.5mL聚丙烯制管中的200|aL糖液(pH5.0的100mM乙酸钠缓冲液含有73%蔗糖、12%半乳糖)中并混合，在6(TC、1，200rpm进行反应。反应开始16小时后，采集反应液之中的20(iL，用480pL蒸馏水进行稀释后，在99'C进行10分钟处理，由此使酶热失活。将热失活后的稀释糖液降温到常温后，使用"Hypercarb"(Thermoelectron社制造)柱，通过高速液相色谱法进行分析。其结果见图7。生成的低聚糖中的棉子糖含有率为82%，反应液中的棉子糖浓度为1.20重量％。实施例6将凝结芽孢杆菌AKC-004株(保藏编号FERMP-21092(移交为FERM-ABP10948);保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心)用TBAB(胰蛋白胨血琼脂基础)培养板(Difco)在55。C培养1天，形成菌落。将1接种环培养物接种到分装在150mL三角烧瓶中的30mL表1所述的培养基中，在55"C以150rpm培养2天。该培养2天后，将10mL量的培养菌体回收到15mL管中。将回收有培养液的15mL管以lOOOOrpm离心后，除去上清液。接着，添加lmL的100mM乙酸钠缓冲液(pH5.0)，再次悬浮后，将悬浮液移入2mL的聚丙烯制管中。再次对管进行离心，除去上清液后，添加300pL糖液(含62.5%蔗糖、12.5%半乳糖的100mM乙酸钠缓冲液(pH5.0))，用涡流搅拌器使菌体充分悬浮，开始糖合成反应。该糖合成反应在反应温度60°C、转速1200rpm的条件下进行。糖合成反应开始16h后，回收40pL反应液，将其与960pL蒸馏水充分混合，在99。C对酶进行10分钟的热失活。将该稀释糖液的温度降到常温后，使用"Hypercarb"(Thermoelectron社制造)柱，通过高速液相色谱法进行分析，其结果见图8。生成的低聚糖中的棉子糖含有率为80%(反应液中的棉子糖浓度为0.70重量％)。将凝结芽孢杆菌AKC-003株(保藏编号FERMP-21091;保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心)用TBAB(胰蛋白胨血琼脂基础)培养板(Difco)在55。C培养1天，形成菌落。将1接种环培养物接种到分装在150mL三角烧瓶中的30mL表1所述的培养基中，在55。C以150rpm培养2天。该培养2天后，将lOmL量的培养菌体回收到15mL管中。将回收有培养液的15mL管以10000rpm离心后，除去上清液。接着，添加lmL的100mM乙酸钠缓冲液(pH5.0)，再次悬浮后，将悬浮液移入2mL的聚丙烯制管中。再次对管进行离心，除去上清液后，添加300|iL糖液(含62.5%蔗糖、12.5%半乳糖的100mM乙酸钠缓冲液(pH5.0))，用涡流搅拌器使菌体充分悬浮，开始糖合成反应。该糖合成反应在反应温度60°C、转速1200rpm的条件下进行。糖合成反应开始38h后，回收40pL反应液，将其与960(iL蒸馏水充分混合，在99'C对酶进行10分钟的热失活。将该稀释糖液的温度降到常温后，使用"Hypercarb"(Thermoelectron社制造)柱，通过高速液相色谱法进行分析，此时，生成的低聚糖中的棉子糖含有率为80°/。(反应液中的棉子糖浓度为0.76重量％)。实施例8将凝结芽孢杆菌AKC-005株(保藏编号FERMP-21093;保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心)用TBAB(胰蛋白胨血琼脂基础)培养板(Difco)在55。C培养1天，形成菌落。将1接种环培养物接种到分装在150mL三角烧瓶中的30mL表1所述的培养基中，在55'C以150rpm培养2天。该培养2天后，将10mL量的培养菌体回收到15mL管中。将回收有培养液的15mL管以10000rpm离心后，除去上清液。接着，添加lmL的100mM乙酸钠缓冲液(pH5.0)，再次悬浮后，将悬浮液移入2mL的聚丙烯制管中。再次对管进行离心，除去上清液后，添加300(iL糖液(含62.5°/。蔗糖、12.5%半乳糖的lOOmM乙酸钠缓冲液(pH5.0))，用涡流搅拌器使菌体充分悬浮，开始糖合成反应。该糖合成反应在反应温度6CTC、转速1200rpm的条件下进行。糖合成反应开始38h后，回收40jiL反应液，将其与960pL蒸馏水充分混合，在99'C对酶进行10分钟的热失活。将该稀释糖液的温度降到常温后，使用"Hypercarb"CThermodectron社制造)柱，通过高速液相色谱法进行分析，此时，生成的低聚糖中的棉子糖含有率为91%(反应液中的棉子糖浓度为0.32重量％)。实施例9将凝结芽孢杆菌AKC-006株(保藏编号FERMP-21094;保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心)用TBAB(胰蛋白胨血琼脂基础)培养板(Difco)在55'C培养1天，形成菌落。将1接种环培养物接种到分装在150mL三角烧瓶中的30mL表1所述的培养基中，在55'C以150rpm培养2天。该培养2天后，将10mL量的培养菌体回收到15mL管中。将回收有培养液的15mL管以10000rpm离心后，除去上清液。接着，添加lmL的lOOmM乙酸钠缓冲液(pH5.0)，再次悬浮后，将悬浮液移入2mL的聚丙烯制管中。再次对管进行离心，除去上清液后，添加300pL糖液(含62.5%蔗糖、12.5%半乳糖的lOOmM乙酸钠缓冲液(pH5.0))，用涡流搅拌器使菌体充分悬浮，开始糖合成反应。该糖合成反应在反应温度60°c、转速1200rpm的条件下进行。糖合成反应开始38h后，回收40(iL反应液，将其与960mL蒸馏水充分混合，在99'c对酶进行10分钟的热失活。将该稀释糖液的温度降到常温后，使用"Hypercarb"(Thermoelectron社制造)柱，通过高速液相色谱法进行分析，此时，生成的低聚糖中的棉子糖含有率为76%(反应液中的棉子糖浓度为0.86重量％)。产业上的可利用性通过使用本发明，能够提供使用低成本的原料选择性制造棉子糖的方法。权利要求1、一种α-半乳糖苷酶，其具有下述特性(1)作用所述酶具有如下性质在以蔗糖和半乳糖为原料的脱水缩合反应中，在生成的低聚糖中的棉子糖含有率为0.5％以上时，棉子糖的合成选择率为65％以上；(2)最适pH范围3.5～5.0；(3)稳定pH范围3.5～10.0；(4)分子量约80,000。2、如权利要求1所述的(x-半乳糖苷酶，其来源于属于凝结芽孢杆菌的微生物。3、如权利要求2所述的a-半乳糖苷酶，其中，所述凝结芽孢杆菌是凝结芽孢杆菌AKC003株、AKC004株(FERM-ABP10948)、AKC005株、AKC006株中的任意一种。4、一种凝结芽孢杆菌及其变异体，所述凝结芽孢杆菌属于凝结芽孢杆菌AKC003株、AKC004株(FERM-ABP10948)、AKC005株、AKC006株中的任意一种。5、一种(X-半乳糖苷酶，其含有下述(a)、(b)或(c)中任意的氨基酸序列(a)序列编号2表示的氨基酸序列；(b)在序列编号2表示的氨基酸序列中，缺失、取代和/或添加了l个或几个氨基酸的氨基酸序列，其具有a-半乳糖苷酶活性；(c)与序列编号2表示的氨基酸序列具有60%以上的相同性的氨基酸序列，其具有a-半乳糖苷酶活性。6、一种a-半乳糖苷酶基因，其编码含有下述(a)、(b)或(c)中任意的氨基酸序列的a-半乳糖苷酶(a)序列编号2表示的氨基酸序列；(b)在序列编号2表示的氨基酸序列中，缺失、取代和/或添加了l个或几个氨基酸的氨基酸序列，其具有a-半乳糖苷酶活性；(c)与序列编号2表示的氨基酸序列具有60%以上的相同性的氨基酸序列，其具有a-半乳糖苷酶活性。7、一种a-半乳糖苷酶基因，其含有下述(a)或(b)的碱基序列(a)序列编号1表示的碱基序列；(b)在序列编号1表示的碱基序列中，缺失、取代和/或添加了1个或几个碱基的碱基序列，并且其编码具有a-半乳糖苷酶活性的蛋白质。8、一种重组载体，其含有权利要求6或7所述的(x-半乳糖苷酶基因。9、一种转化体，其导入有权利要求6或7所述的a-半乳糖苷酶基因或权利要求8所述的重组载体。10、一种cc-半乳糖苷酶，其是培养权利要求9所述的转化体而得到的。11、一种酶组合物，其含有权利要求13、5或10的任一项所述的a-半乳糖苷酶。12、如权利要求ll所述的酶组合物，其中，该组合物还含有选自a-葡糖苷酶、(3-葡糖苷酶、p-半乳糖苷酶、纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶、半乳聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、甘露聚糖酶、鼠李半乳糖醛酸酶、聚半乳糖醛酸酶、果胶甲酯酶、果胶裂解酶以及聚半乳糖醛酸裂解酶的至少一种以上的成分。13、一种棉子糖合成试剂，其含有权利要求11或12任一项所述的酶组合物。14、一种棉子糖的制造方法，其特征在于，该制造方法使用权利要求13、5或10的任一项所述的a-半乳糖苷酶；权利要求11或12所述的酶组合物；或者权利要求13所述的棉子糖合成试剂。15、一种棉子糖的制造方法，其特征在于，该方法利用微生物催化剂，所述微生物催化剂是培养属于凝结芽孢杆菌的微生物而得到的。16、一种棉子糖的制造方法，其特征在于，该方法利用微生物催化剂，所述微生物催化剂是培养属于凝结芽孢杆菌AKC003株、AKC004株(FERM-ABP10948)、AKC005株、AKC006株中任意一种凝结芽孢杆菌和/或其变异体而得到的。17、一种棉子糖的制造方法，其特征在于，该方法利用微生物催化剂，所述微生物催化剂是培养权利要求9所述的转化体而得到的。18、如权利要求1417中任一项所述的棉子糖的制造方法，其中，生成的低聚糖中的棉子糖含有率为65%以上。19、如权利要求1418中任一项所述的棉子糖的制造方法，其中，该方法使用蔗糖和半乳糖作为原料。20、如权利要求19所述的棉子糖的制造方法，其中，原料中的蔗糖浓度为30%(w/v)90%(w/v)，原料中的半乳糖浓度为2%(w/v)45%(w/v)。全文摘要本发明的目的在于提供一种能够选择性合成棉子糖的新型α-半乳糖苷酶。通过本发明，提供具有如下性质的α-半乳糖苷酶在以蔗糖和半乳糖为原料的脱水缩合反应中，生成的低聚糖中的棉子糖含有率为0.5％以上时，棉子糖的合成选择率为65％以上。文档编号C12P19/18GK101657544SQ20088000539公开日2010年2月24日申请日期2008年2月19日优先权日2007年2月19日发明者今津晋一,小西一诚申请人:旭化成化学株式会社