来自丙酸梭菌的丙酰辅酶a转移酶的突变体和使用该突变体制备pla或pla共聚物的方法

专利名称：：来自丙酸梭菌的丙酰辅酶a转移酶的突变体和使用该突变体制备pla或pla共聚物的方法
技术领域：
：本发明涉及一种来自丙酸梭菌(Clostridiumpropionicum)的丙酰辅酶A转移酶的突变体，其能够在使用微生物制备聚乳酸酯(PLA)或PLA共聚物的方法中高效地将乳酸酯转化成乳酰辅酶A。
背景技术：
：聚乳酸酯(PLA)是一种源自乳酸酯的常见生物可降解聚合物，其极大地应用于商业和生物医学领域中。目前，虽然PLA的制备涉及微生物发酵制得的乳酸酯的聚合，但是通过乳酸酯的直接聚合仅仅制得具有大约10005000道尔顿的低分子量的PLA。为了合成具有100，000道尔顿以上分子量的PLA，可以使用链偶联剂聚合由乳酸酯的直接聚合制得的具有低分子量的PLA。然而，在该方法中，由于不容易除去的有机溶剂或链偶联剂的加入，使整个过程变得复杂。目前，制备高分子量PLA的商业上可用的方法可包括将乳酸酯转化成交酯并利用交酯环的开环縮聚作用合成PLA。在通过乳酸酯的化学合成来合成PLA时，PLA均聚物容易获得，但是由多种类型的单体组成的PLA共聚物难以合成并且是商业上无法利用的。同时，聚羟基链烷酸酯(PHA)是一种在如磷(P)、氮(N)、镁(Mg)和氧(0)等的其它营养物质缺乏而碳源过量时由微生物储藏作为能量或碳源的聚酯。由于PHA与通常来自石油的合成聚合物具有相似的物理性质，并且呈现出完全的生物降解性，所以其被认为是常规合成塑料的替代品。为了使用微生物生产PHA，需要将微生物代谢产物转化成PHA单体的酶和使用PHA单体合成PHA聚合物的PHA合酶。当使用微生物合成PLA和PLA共聚物时，需要相同的体系，并且除了用于提供羟酰辅酶A(其为PHA合酶的最初底物)的酶以外，还需要用于提供乳酰辅酶A的酶。因此，为了提供乳酰辅酶A，本发明人使用来自丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶和来自假单胞菌属(Pseudomonas)sp.6-19的使用丙酰辅酶A转移酶作为底物的PHA合酶的突变体，由此如在韩国专利申请第10-2006-0116234中所公开的那样能够成功地合成PLA和PLA共聚物。然而，已报道，当用非常强的启动子在大肠杆菌中高表达来自丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶(作为用于提供乳酰辅酶A的酶)时，会出现严重的代谢紊乱，由此抑制细胞生长(Selmer等人在Eur.J.Biochem.269:372，2002中报道)。此外，因为编码来自丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶的基因的密码子选择与大肠杆菌的完全不同，所以正常表达丙酰辅酶A转移酶会是非常困难的。因此，为了比常规系统更加有效地合成PLA和PLA共聚物，非常重要的是，引入平稳地提供乳酰辅酶A并且在不会极大地抑制细胞生长的情况下充分表达的丙酰辅酶A转移酶。
发明内容技术问题本发明旨在一种通过提供能够有效地供应乳酰辅酶A的提供单体的酶而高效地制备聚乳酸酯(PLA)或PLA共聚物的方法。技术方案本发明人发现，在使用来自丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶的突变体时，通过在不会极大地抑制细胞生长的情况下有效地提供乳酰辅酶A而可以高效地制备PLA或PLA共聚物。这一发现致使他们完成本发明。因此，本发明提供了一种用作提供乳酰辅酶A的酶的丙酰辅酶A转移酶的突变体和编码该突变体的基因，该突变体具有其中突变为T78C、T669C、A1125G和T1158C的SEQIDNO:3的基因序列。本发明还提供了一种用作提供乳酰辅酶A的酶的丙酰辅酶A转移酶的突变体和编码该突变体的基因，该突变体具有其中突变为A1200G的SEQIDNO:3的基因序列。本发明还提供了一种用作提供乳酰辅酶A的酶的丙酰辅酶A转移酶的突变体和编码该突变体的基因，该突变体具有其中突变为A1200G的SEQIDNO:3的基因序列和其中突变为Gly335Asp的对应于SEQIDNO:3的氨基酸序列。本发明还提供了一种用作提供乳酰辅酶A的酶的丙酰辅酶A转移酶的突变体和编码该突变体的基因，该突变体具有其中突变为T669C、A1125G和T1158C的SEQIDNO:3的基因序列和其中突变为Asp65Gly的对应于SEQIDNO:3的氨基酸序列。本发明还提供了一种用作提供乳酰辅酶A的酶的丙酰辅酶A转移酶的突变体和编码该突变体的基因，该突变体具有其中突变为T669C、A1125G和T1158C的SEQIDNO:3的基因序列和其中突变为Asp65Asn的对应于SEQIDNO:3的氨基酸序列。本发明还提供了一种用作提供乳酰辅酶A的酶的丙酰辅酶A转移酶的突变体和编码该突变体的基因，该突变体具有其中突变为T669C、A1125G和T1158C的SEQIDNO:3的基因序列和其中突变为Thrl99Ile的对应于SEQIDNO:3的氨基酸序列。本发明还提供了一种用作提供乳酰辅酶A的酶的丙酰辅酶A转移酶的突变体和编码该突变体的基因，该突变体具有其中突变为A1200G的SEQIDNO:3的基因序列和其中突变为Ala243Thr的对应于SEQIDNO:3的氨基酸序列。本发明还提供了一种用作提供乳酰辅酶A的酶的丙酰辅酶A转移酶的突变体和编码该突变体的基因，该突变体具有其中突变为A1200G的SEQIDNO:3的基因序列和其中突变为Asp257Asn的对应于SEQIDNO:3的氨基酸序列。本发明还提供了一种用作提供乳酰辅酶A的酶的丙酰辅酶A转移酶的突变体和编码该突变体的基因，该突变体具有其中突变为T78C、T669C、A1125G和T1158C的SEQIDNO:3的基因序列和其中突变为Vall93Ala的对应于SEQIDNO:3的氨基酸序列。本发明还提供了一种用于合成聚乳酸酯(PLA)或PLA共聚物的重组载体，该载体包含上述基因中的任一种。优选地，所述用于合成聚乳酸酯(PLA)或PLA共聚物的重组载体包含上述任一种编码丙酰辅酶A转移酶的突变体的基因和SEQIDN0:4的聚羟基链烷酸酯(PHA)合酶基因(phaClPs6—19300)，该合酶能够使用乳酰辅酶A作为底物合成PLA或PLA共聚物。6本发明还提供了一种用上述重组载体中的一种转化的细胞或植物。在这种情况下，通过用一种上述重组载体转化不含有丙酰辅酶A转移酶的基因的细胞或植物获得的细胞或植物也在本发明的范围内。本发明还提供了一种制备聚乳酸酯(PLA)或PLA共聚物的方法，该方法包括培养上述细胞或植物或者使上述细胞或植物生长。为了制备PLA共聚物，可以在包含羟基链烷酸酯的环境中进行细胞或植物的培养和生长。所述羟基链烷酸酯可为选自3-羟丁酸酯、3-羟戊酸酯、4-羟丁酸酯、具有614个碳原子的中链长(D)-3-羟基羧酸、2-羟基丙酸、3_羟基丙酸、3-羟基己酸、3-羟基庚酸、3-羟基辛酸、3-羟基壬酸、3-羟基癸酸、3-羟基十一烷酸、3-羟基十二烷酸、3-羟基十四烷酸、3-羟基十六烷酸、4-羟基戊酸、4-羟基己酸、4_羟基庚酸、4-羟基辛酸、4-羟基癸酸、5-羟基戊酸、5-羟基己酸、6-羟基十二烷酸、3-羟基_4-戊烯酸、3-羟基-4-反式-己烯酸、3-羟基-4-顺式-己烯酸、3-羟基-5-己烯酸、3-羟基-6-反式-辛烯酸、3-羟基-6-顺式-辛烯酸、3-羟基-7-辛烯酸、3-羟基-8-壬烯酸、3_羟基-9-癸烯酸、3-羟基-5-顺式-十二烯酸、3-羟基-6-顺式-十二烯酸、3-羟基_5-顺式-十四烯酸、3-羟基-7-顺式_十四烯酸、3-羟基-5，8-顺式-顺式-十四烯酸、3-羟基-4-甲基戊酸、3-羟基-4-甲基己酸、3-羟基-5-甲基己酸、3-羟基-6-甲基庚酸、3-羟基-4-甲基辛酸、3-羟基-5-甲基辛酸、3-羟基-6-甲基辛酸、3-羟基-7-甲基辛酸、3-羟基-6-甲基壬酸、3-羟基-7-甲基壬酸、3-羟基-8-甲基壬酸、3-羟基-7-甲基癸酸、3-羟基-9-甲基癸酸、3-羟基-7-甲基_6-辛烯酸、苹果酸、3-羟基琥珀酸-甲酯、3-羟基己二酸_甲酯、3-羟基辛二酸-甲酯、3-羟基壬二酸-甲酯、3-羟基癸二酸-甲酯、3-羟基辛二酸_乙酯、3-羟基癸二酸-乙酯、3-羟基庚二酸-丙酯、3-羟基癸二酸-苄酯、3-羟基-8-乙酰氧基辛酸、3-羟基-9-乙酰氧基壬酸、苯氧基-3-羟基丁酸、苯氧基-3-羟基戊酸、苯氧基-3-羟基庚酸、苯氧基-3-羟基辛酸、对氰基苯氧基-3-羟基丁酸、对氰基苯氧基_3-羟基戊酸、对氰基苯氧基-3-羟基己酸、对硝基苯氧基-3-羟基己酸、3-羟基-5-苯基戊酸、3-羟基-5-环己基丁酸、3，12-二羟基十二烷酸、3，8-二羟基-5-顺式-十四烯酸、3-羟基-4，5-环氧癸酸、3-羟基-6，7-环氧十二烷酸、3-羟基-8，9-环氧-5，6-顺式-十四烷酸、7_氰基-3-羟基庚酸、9-氰基-3-羟基壬酸、3-羟基-7-氟庚酸、3-羟基-9-氟壬酸、3-羟基-6-氯己酸、3-羟基-8-氯辛酸、3-羟基-6-溴己酸、3-羟基-8-溴辛酸、3-羟基-ll-溴十一烷酸、3-羟基-2-丁烯酸、6-羟基-3-十二烯酸、3-羟基-2-甲基丁酸、3-羟基-2-甲基戊酸和3-羟基-2，6-二甲基-5-庚烯酸中的至少一种。然而，本发明不限于此。所述羟基链烷酸酯可为选自3-羟丁酸酯、4-羟丁酸酯、2-羟基丙酸、3-羟基丙酸、具有614个碳原子的中链长(D)-3-羟基羧酸、3-羟戊酸酯、4-羟基戊酸和5-羟基戊酸中的至少一种。更优选地，而且是非必需地，所述羟基链烷酸酯可为3-羟丁酸酯(3-HB)(参见图1)。因此，本发明的PLA或PLA共聚物可为聚乳酸酯、聚(羟基链烷酸酯_共_3_乳酸酯)、聚(羟基链烷酸酯_共_羟基链烷酸酯_共_乳酸酯)、聚(羟基链烷酸酯_共_羟基链烷酸酯_共_聚羟基链烷酸酯_共_乳酸酯)等，但本发明不限于此。例如，所述PLA共聚物可为聚(4-羟丁酸酯-共-乳酸酯)、聚(4-羟丁酸酯_共_3-羟基丙酸酯_共_乳酸酯)、聚(3-羟丁酸酯_共-4-羟丁酸酯_共_乳酸酯)、聚(3-羟丁酸酯-共-3-羟基丙酸酯-共-4-羟丁酸酯-共-乳酸酯)、聚(中链长(MCL)3-羟基链烷酸酯-共-乳酸酯)、聚(3-羟丁酸酯-共-MCL3-羟基链烷酸酯-共-乳酸酯)、聚(3-羟丁酸酯_共-3-羟戊酸酯-共-乳酸酯)、聚(3-羟丁酸酯-共-3-羟基丙酸酯-共-乳酸酯)、聚(3-羟基丙酸酯-共-乳酸酯)等，但本发明不限于此。在本发明中，载体指的是一种包含DNA序列的DNA构件，该DNA序列可操作地连接至能够在适合的宿主内表达DNA的适合控制序列上。载体可为质粒、噬菌体颗粒或者简单地潜在的基因组插入片段。当将载体转化到适合的宿主中时，载体能够不顾宿主基因组而自我复制或者运行，或者在某些情况下，载体可整合到宿主基因组中。因为质粒是目前最常见类型的载体，所以在本发明中有时可以交替地使用"质粒"和"载体"。但是，本发明还包括其它类型的本领域技术人员已知的载体或者那些具有相同功能的载体。术语"表达控制序列"指的是用于在特定宿主中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。这种控制序列包括转录所需的启动子；用于控制转录的任意操纵基因序列；编码适合的mRNA核糖体结合位点(RBS)的序列；和用于控制转录和翻译终止的序列。例如，适合原核生物的控制序列包括启动子、任意操纵基因序列和RBS。适合真核生物的控制序列包括启动子、多腺苷酸化信号和增强子。在质粒中，启动子是对基因的表达量具有最大影响的一个因素。可以使用SRa启动子或巨细胞病毒的启动子作为高表达启动子。为了表达本发明的DNA序列，各种表达控制序列中的任何一种都可以用在载体中。例如，表达控制序列可为SV40或腺病毒的早期和后期启动子、lac体系、trp体系、tac体系、trc体系、T3和T7启动子、A噬菌体的主要操纵基因和启动子区域、fd编码蛋白的控制区域、3-磷酸甘油酸酯激酶或其它糖解酶的启动子、例如Pho5的磷酸酶的启动子、酵母a交配系统的启动子、其它已知控制原核生物或真核生物细胞或它们的病毒的表达的具有不同的结构或起源的序列及它们的各种组合。当将核酸置入与其它核酸序列的功能关系中时，其被可操作地连接至该核酸序列。适合的分子(例如转录激活蛋白)可为基因和控制序列，二者以在与控制序列结合时能够使基因表达的方式连接。例如，当前序列或分泌前导的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白时，其可操作地连接至该多肽的DNA;当启动子或者增强子影响编码序列的转录时，其可操作地连接至该编码序列；当RBS影响编码序列的转录时，其可操作地连接至该编码序列；或者当设置RBS以便有利于翻译时，其可操作地连接至编码序列。总体而言，"可操作地连接"指的是被连接的DNA序列为毗邻的，而且在分泌前导的情况下，是毗邻的且在阅读框内。但是，增强子不是必须靠近编码序列。这些序列间的连接可通过合适的限制性内切酶酶切位点的连接实现。但是，在不存在限制性内切酶酶切位点的情况下，则可以根据常规方法使用合成的寡核苷酸接头或者连接体。在本发明中，术语"表达载体"指的是向其中插入了异源DNA片段的重组载体，其中，所述DNA片段通常是双链DNA片段。这里，所述异源DNA指的是不是在宿主细胞中天然产生的异型DNA。一旦将该表达载体引入到宿主细胞中，其可以不顾宿主基因组DNA而进行复制，从而可产生几个拷贝的载体和插入它们中的(异源)DNA。如本领域技术人员所知的，为了提高宿主细胞中转染的基因的表达水平，相应的基因必须可操作地连接至在选择的表达宿主中起转录和翻译作用的表达控制序列上。优选地，将表达控制序列和基因包含在单一表达载体中，所述载体同时包含细菌筛选标记和复制起点。当表达宿主是真核细胞时，表达载体必须进一步包含在真核生物表达宿主中可用的表达标记。在本发明中，可以采用包括质粒载体、噬菌体载体、粘粒载体和酵母人工染色体(YAC)载体的各种载体作为重组载体。为了本发明的目的，可以使用质粒载体作为重组载体。用于本发明目的的典型质粒载体包含(a)复制起点，用于有效复制以使各宿主细胞包含几百个质粒载体；(b)抗生素抗性基因，用于筛选用质粒载体转化后的宿主细胞；和(c)限制性内切酶酶切位点，其中可以插入外源DNA片段。即使在没有适合的限制性内切酶酶切位点的情况下，根据常规方法使用合成的寡核苷酸接头或者连接体可以容易地连接载体与外源DNA。根据本发明的重组载体可以使用常规方法转化到适当的宿主细胞中。宿主细胞可为细菌、酵母或真菌等，但本发明不限于此。优选地，宿主细胞可为例如大肠杆菌的原核细胞。适合的原核宿主细胞的例子可以包括大肠杆菌菌株JM109、大肠杆菌菌株DH5a、大肠杆菌菌株JM101、大肠杆菌K12菌株294、大肠杆菌菌株W3110、大肠杆菌菌株X1776、大肠杆菌XL-lBlue(Stratagene)、大肠杆菌B等。然而，还可以使用例如FMB101、NM522、NM538和NM539的其它大肠杆菌菌株和其它原核细胞种属。除了上述大肠杆菌以外，还可以使用例如土壤杆菌(Agrobacterium)A4的土壤杆菌属菌株、例如枯草杆菌(Bacillussubtilis)的杆菌属菌株、例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)或粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)的其它肠细菌和各种假单胞菌属菌株作为宿主细胞。但是，本发明不限于上述实例。另外，真核细胞的转化可以使用根据描述在Sambrook等人(supra)的章节1.82中的氯化钙法容易地进行。或者，也可以使用电穿孔法(Ne咖a皿等人，EMBOJ.，1:841(1982))来转化这些细胞。为了制备含有根据本发明的转化酶的基因和合酶的基因的植物，可以使用土壤杆菌、病毒载体等通过常规方法进行植物的转染。例如，用含有根据本发明的基因的重组载体转化土壤杆菌属微生物，并且转化后的土壤杆菌属微生物可以感染目标植物的组织，从而得到转染的植物。更具体而言，转染植物的制备可包括(a)预培养目标植物的外植体和共培养该外植体与转化的土壤杆菌以转染外植体；(b)在诱导愈伤组织的培养基中培养转染的外植体以得到愈伤组织；和(c)切割并在芽诱导培养基中培养得到的愈伤组织以得到芽。在本发明中，术语"外植体"指的是从植物上切下的组织块并包括子叶或胚轴。可以使用子叶或胚轴作为本发明的方法所用的植物的外植体。可以优选使用通过消毒和清洗植物的种子并在Murashige和Skoog(MS)培养基中使该种子发芽而得到的子叶。在本发明中，要被转染的目标植物可为烟草、番茄、辣椒、豆子、水稻作物、玉米等，但本发明不限于此。此外，本领域技术人员已知的是，即使转化所用的植物是可有性再生的，通过组织培养可以使其无性再生。有益效果如上所述，通常，在大肠杆菌中表达丙酰辅酶A转移酶是困难的，因此阻碍了乳酰辅酶A的有效提供。然而，根据本发明，将来自丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶的突变体弓|入重组大肠杆菌中以促进乳酰辅酶A的提供，从而高效地制备聚乳酸酯(PLA)和PLA共聚物。图1为使用葡萄糖、3HB和乳酸酯在细胞内合成乳酸酯共聚物(聚(3HB-共-乳酸酯))的途径的示意图。图2为根据本发明的实施例制备包含来自假单胞菌属sp.6-19的聚羟基链烷酸酯(PHA)合酶基因和来自丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶的突变体基因的重组表达载体的方法的示意图。具体实施例方式在下文中，将通过实施例详细描述本发明。对本领域技术人员来说，显而易见的是，提供的实施例仅仅用来详细说明本发明，而本发明并不限于实施例。根据本发明人的在先发明韩国专利申请第10-2006-0116234号公开的内容，为了提供作为合成聚乳酸酯(PLA)和PLA共聚物所需的单体的乳酰辅酶A，现将更加详细地描述操纵子型持续表达系统的构建，在该系统中，来自丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶(CP-PCT)和聚羟基链烷酸酯(PHA)合酶一起被表达。实施例1-1:来自假单胞菌属sp.6-19的PHA合酶基因的克隆以及表达载体的制备为了从本发明中所用的假单胞菌属sp.6-19(KCTC11027BP)中分离PHA合酶(phaClPs6—19)基因，提取假单胞菌属sp.6-19的总DNA，根据phaClPs6—19基因的序列(Ae-jinSong，Master'sThesis,DepartmentofChemicalandBiomolecularEngineering,KAIST，2004)制备碱基序列为SEQIDNO:5和SEQIDNO:6的引物，并且进行聚合酶链式反应(PCR)得到phaC1^—19基因。SEQIDNO:5:5'—GAGAGACAATCAAATCATGAGTAACAAGAGTAACG—3'SEQIDNO:6:5'-CACTCATGCAAGCGTCACCGTTCGTGCACGTAC-3'对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果，确认了对应于phaC1^—19基因的1.7kbp基因片段。用BamHI/EcoRI从pSYL105载体(Lee等人，Biotech.Bioeng.，1994，44:1337-1347)中切下含有来自富养罗尔斯通氏菌(Ralstoniaeutropha)H16的产生PHB的操纵子的DNA片段，并将其插入到pBluescriptII(Stratagene)的BamHI/EcoRI识别位点，由此制备pReCAB重组载体。用PHB操纵子启动子持续表达PHA合酶(phaCKE)和提供单体的酶(phaAKE和phaBKE)的pReCAB载体也有效地在大肠杆菌中运行(Lee等人，Biotech.Bioeng.，1994，44:1337-1347)，这是已知的。用BstBI/Sbfl酶切pReCAB载体以除去富养罗尔斯通氏菌H16PHA合酶(phaCKE)，并且将phaClPs6—19基因插入到BstBI/Sbfl识别位点，由此制备pPs619Cl-ReAB重组载体。为了产生只在任一端具有BstBI/Sbfl识别位点的phaClPs6—19合酶基因片段，在没有改变氨基酸的情况下，使用定点诱变(SDM)去除内源BstBI位点，并且使用SEQIDNO:7和SEQIDN0:8、SEQIDNO:9禾卩SEQIDNO:10禾卩SEQIDNO:11禾卩SEQIDN0:12的引物进行重叠PCR从而加入BstBI/Sbfl识别位点。SEQIDNO:7:5'-ATGCCCGGAGCCGGTTCGAA-3'SEQIDNO:8:5'SEQIDNO:9:5'SEQIDNO:10:5'SEQIDNO:11:5'SEQIDNO:12:5'-CGTTACTCTTGTTACTCATGATTTGATTGTCTCTC-3'-GAGAGACAATCAAATCATGAGTAACAAGAGTAACG-3'_CACTCATGCAAGCGTCACCGTTCGTGCACGTAC-3'-GTACGTGCACGAACGGTGACGCTTGCATGAGTG-3'-AACGGGAGGGAACCTGCAGG—3'通过序列测定确认了制备的pPs619Cl-ReAB重组载体的phaClPs6—19基因的碱基序列并且用SEQIDN0:13表示，而用SEQIDNO:14表示由此编码的氨基酸序列。基因序列相似性分析结果显示，phaClPs6—19基因与来自假单胞菌属sp.菌株61-3的phaCl(Matsusaki等人，J.Bacteriol.，180:6459，1998)具有84.3%的同源性以及88.9%的氨基酸序列同源性。因此，证实了这两种合酶是非常相似的酶。结果，证实了根据本发明得到的phaClPs6—19合酶是II型PHA合酶。实施例1-2:来自假单胞菌属sp.6-19的PHA合酶的底物特异性突变体的制备在各种PHA合酶中，II型PHA合酶已知为用于聚合具有相对较多个碳原子的底物的中链长PHA(MCL-PHA)合酶，并且预期MCL-PHA合酶十分适用于PLA共聚物的生产。尽管来自假单胞菌属sp.61-3的phaCl合酶是II型PHA合酶，其与根据本发明得到的phaClPs6—19合酶具有高度同源性，但是已报道，PhaCl合酶的底物特异性的范围相对较宽(Matsusaki等人，J.Bacteriol.，180:6459，1998)，并且也报道了对适合生产短链长PHA(SCL-PHA)的突变体的研究结果(Takase等人，Biomacromolecules,5:480,2004)。基于上述研究，本发明人通过氨基酸序列比对分析发现了影响SCL激活的三个氨基酸位点，并且使用表1中所示的引物(SEQIDN0:15SEQIDNO:20)通过SDM方法制得了phaClPs6—19合酶的突变体。表l重组载体核酸置换氨基酸置换引物pPs619C1200-ReABAGC—ACCS325TSEQIDNOs15/16CAG—ATGQ481MSEQIDNOs17/18pPs619C1300陽ReABGAA—GATE130DSEQIDNOs19/20AGC—ACCS325TSEQIDNOs15/16CAG—ATGQ481MSEQIDNOs17/18SEQIDNO:15SEQIDNO:16SEQIDNO:17SEQIDNO:18SEQIDNO:19SEQIDNO:20实施例1-3:来在该实施例中，:5'_CTGACCTTGCTGGTGACCGTGCTTGATACCACC-3':5'_GGTGGTATCAAGCACGGTCACCAGCAAGGTCAG-3':5'_CGAGCAGCGGGCATATCATGAGCATCCTGAACCCGC-3':5'-GCGGGTTCAGGATGCTCATGATATGCCCGCTGCTCG-3':5'_ATCAACCTCATGACCGATGCGATGGCGCCGACC-3':5'_GGTCGGCGCCATCGCATCGGTCATGAGGTTGAT-3'自丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶的突变体库的制备和筛选为了提供作为用于合成PLA和PLA共聚物所需的单体的乳酰辅酶11A，使用来自丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶(CP-PCT)并且用SEQIDNO:3表示它的序列。使用SEQIDNO:21和SEQIDNO:22的引物对丙酸梭菌的染色体DNA进行PCR得到的片段用作CP-PCT。在这种情况下，使用S匿去除野生型CP-PCT中存在的Ndel位点以有助于克隆。SEQIDNO:21:5'-GGAATTCATGAGAMGGTTCCCATTATTACCGCAGATGA-3'SEQIDNO:22:5'_GCTCTAGATTAGGACTTCATTTCCTTCAGACCCATTMGCCTTCTG-3'此外，使用SEQIDNO:23和SEQIDNO:24的引物进行重叠PCR，从而加上Sbf1/Ndel识别位点。SEQIDNO:23:5'_aggcctgcaggcggataacaatttcacacagg_3'SEQIDNO:24:5'_gcccatatgtctagattaggacttcatttcc_3'用Sbfl/Ndel酶切包含phaClPs6—19300(即为phaClPs6—19合酶的SCL突变体)的pPs619C1300-ReAB载体以移除来自富养罗尔斯通氏菌H16的提供单体的酶(phaAKE和phaBKE)，并且将PCR克隆的CP-PCT基因插入到Sbfl/Ndel识别位点，从而制备pPs619C1300-CPPCT重组载体。实施例2:来自丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶的突变体库的制备和筛选已知，当在大肠杆菌中高表达CP-PCT时，其会引起严重的代谢紊乱并显示出毒性。通常，在使用tac启动子或T7启动子的异丙基-!3-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的蛋白质产生系统(其被广泛用于表达重组蛋白)中加入诱导物的同时，重组大肠杆菌死亡。由于这一原因，使用弱表达但是随着微生物的生长持续表达基因的组成型表达系统进行PLA或PLA共聚物的合成。为了向CP-PCT引入随机突变，使用在韩国专利申请第10-2006-0116234号中公开的pPs619C1300-CPPCT作为模板，并且在加入Mn"和dNTP间浓度不同的条件下使用SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的引物进行易错PCR(参见图2)。SEQIDN0:1:5'_cgceggcaggectgcagg_3'SEQIDN0:2:5'_ggcaggteageccatatgtc_3'此后，为了扩增含有随机突变的PCR片段，使用SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的引物在通常条件下进行PCR。用Sbfl/Ndel酶切含有phaClPs6—19300(即为phaClPs6—19合酶的SCL突变体)的pPs619C1300-CPPCT载体以除去野生型CP-PCT，并且将扩增的突变的PCR片段插入到Sbfl/Ndel识别位点以产生连接混合物。将该连接混合物引入大肠杆菌JM109中，从而制备具有大约10'5的等级的CP-PCT库(参见图2)。使制备的CP-PCT库在聚合物检测培养基(LuriaBertani(LB)琼脂，葡萄糖20g/L，3HBlg/L，尼罗红O.5yg/ml)中生长3天并筛选证实是否产生聚合物，从而初级选择80个候选者。在聚合物产生条件下使候选者在液体培养基(LB琼脂，葡萄糖20g/L，3HBlg/L，氨苄青霉素100mg/L，37°C)中生长4天，并且使用荧光激活细胞分选(FACS)分析，从而选出最终的两个样品。此外，从大肠杆菌中重新获得包含突变体的重组表达载体并且再次引入到大肠杆菌JM109中以证实聚合物产率。因此，证实了与用具有野生型CP-PCT的重组载体转化的大肠杆菌相比，用具有CP-PCT的突变体的重组载体转化的大肠杆菌显示出更好的性能。实施例3:使用来自丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶的突变体制备PLA共聚物为了定量分析实施例2中最终选出的突变体的激活，将用如图2中所示的含有突12变体的重组表达载体转化的大肠杆菌JM109在37°C的温度下于包含含有葡萄糖(20g/L)和3HB(2g/L)的LB培养基的烧瓶中培养4天。通过离心重新获得培养细胞沉淀物并且在IO(TC的温度下在干燥器中干燥24小时。其后，进行气相色谱来评价细胞中合成的聚合物含量，如表2中所示。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>气相色谱分析的结果可以看出，根据本发明制备的包含CP-PCT的突变体的重组表达载体的PLA-共聚物合成活性是含有野生型CP-PCT的pPs619C1300-CPPCT载体的PLA-共聚物合成活性的大约28倍。这是因为CP-PCT的突变体比野生型CP-PCT更加有效地提供了聚合物合成单体(即乳酰辅酶A和3HB-辅酶A)。为了找到制备的CP-PCT突变体的突变位置，对CP-PCT突变体进行基因测序，并且结果示于表3中表3<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>作为CP-PCT突变体的基因测序结果，在突变体512中发生一个核苷酸的置换，而在突变体522中发生四个核苷酸的置换。然而，已证实，所有的核酸置换均为不引起氨基酸置换的同义突变。就是说，根据本发明制备的CP-PCT突变体的提供单体的能力的提高不是由于酶的氨基酸置换而引起的活性提高的结果，而是由于在大肠杆菌中酶表达的改变的结果。因此，分析在典型的大肠杆菌中野生型CP-PCT和根据本发明制备的CP-PCT突变体的基因序列的密码子选择，如表4中所示。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>如表4中所示，除了突变体522中存在的A1125G以外的所有核酸置换均对大肠杆菌的密码子选择是有利的。就是说，由于核酸置换对大肠杆菌的密码子选择是有利的，根据本发明制备的CP-PCT突变体提高了活化酶的表达，而由此显示出更高的生产PLA共聚物所需的提供单体的能力。实施例4:使用来自丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶的突变体制备PLA共聚物以与实施例2中相同的方式，对实施例2中最终选出的突变体(512和522)进行随机诱变，从而得到以下CP-PCT突变体531-537和540。为了定量分析CP-PCT突变体，将用含有CP-PCT突变体531-537和540的重组表达载体转化的大肠杆菌JM109在37t:的温度下于包含含有葡萄糖(20g/L)和3HB(2g/L)的富含P的甲基红(MR)培养基的烧瓶中培养4天。通过离心重新获得培养细胞沉淀物并且在保持在IO(TC的温度的干燥器中干燥24小时。其后，进行气相色谱来评价细胞中合成的聚合物含量。对CP-PCT突变体进行基因测序找到CP-PCT突变体的突变位置，其结果示于表5中，以及细胞中合成的聚合物含量示于表6中。在上述实验中，每升富含P的MR由22g的KH2P04、3g的(NH4)2HP04、0.8g的柠檬酸盐、0.7g的MgS047H20和5mL的微量金属溶液形成，并且每升微量金属溶液由10g的FeS04*7H20、2.25g的ZnS04*7H20、lg的CuS04*5H20、0.5g的MnS04*5H20、2g的CaCl2*2H20、0.23g的Na2B4077H20、0.lg的(NH4)6Mo7024和10mL的35%HC1形成。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>如表6中所示，与野生型CP-PCT相比，根据本发明制备的CP-PCT突变体显著地提高了乳酸酯的摩尔％。此外，已证实，与包含野生型CP-PCT的载体相比，包含突变体531、533、535、537和540的重组表达载体显示出更好的PLA-共聚物合成活性。虽然已经参照本发明的一些实施例展示和说明了本发明，本领域技术人员将理解的是，在没有偏离所附权利要求书所限定的本发明的实质和范围的情况下可以进行各种形式和细节的变化。权利要求一种提供乳酰辅酶A的丙酰辅酶A转移酶的突变体，该突变体具有其中突变为T78C、T669C、A1125G和T1158C的SEQIDNO3的基因序列。2.—种提供乳酰辅酶A的丙酰辅酶A转移酶的突变体，该突变体具有其中突变为A1200G的SEQIDNO:3的基因序列。3.—种提供乳酰辅酶A的丙酰辅酶A转移酶的突变体，该突变体具有其中突变为A1200G的SEQIDNO:3的基因序列和其中突变为Gly335Asp的对应于SEQIDNO:3的氨基酸序列。4.一种提供乳酰辅酶A的丙酰辅酶A转移酶的突变体，该突变体具有其中突变为T669C、A1125G和T1158C的SEQIDNO:3的基因序列和其中突变为Asp65Gly的对应于SEQIDNO:3的氨基酸序列。5.—种提供乳酰辅酶A的丙酰辅酶A转移酶的突变体，该突变体具有其中突变为T669C、A1125G和T1158C的SEQIDNO:3的基因序列和其中突变为Asp65Asn的对应于SEQIDNO:3的氨基酸序列。6.—种提供乳酰辅酶A的丙酰辅酶A转移酶的突变体，该突变体具有其中突变为T669C、A1125G和T1158C的SEQIDNO:3的基因序列和其中突变为Thrl99Ile的对应于SEQIDNO:3的氨基酸序列。7.—种提供乳酰辅酶A的丙酰辅酶A转移酶的突变体，该突变体具有其中突变为A1200G的SEQIDNO:3的基因序列和其中突变为Ala243Thr的对应于SEQIDNO:3的氨基酸序列。8.—种提供乳酰辅酶A的丙酰辅酶A转移酶的突变体，该突变体具有其中突变为A1200G的SEQIDNO:3的基因序列和其中突变为Asp257Asn的对应于SEQIDNO:3的氨基酸序列。9.一种提供乳酰辅酶A的丙酰辅酶A转移酶的突变体，该突变体具有其中突变为T78C、T669C、A1125G和T1158C的SEQIDNO:3的基因序列和其中突变为Vall93Ala的对应于SEQIDNO:3的氨基酸序列。10.—种编码根据权利要求19中任一项所述的丙酰辅酶A转移酶的突变体的基因。11.一种用于合成聚乳酸酯(PLA)或PLA共聚物的重组载体，其包含根据权利要求IO所述的基因。12.根据权利要求ll所述的重组载体，其进一步包含SEQIDN0:4的聚羟基链烷酸酯(PHA)合酶基因(phaClPs6—^300)，该酶能够使用乳酰辅酶A作为底物合成PLA或PLA共聚物。13.—种用根据权利要求11所述的重组载体转化的细胞或植物。14.一种用根据权利要求12所述的重组载体转化的细胞或植物。15.—种制备聚乳酸酯(PLA)或PLA共聚物的方法，该方法包括培养根据权利要求13所述的细胞或植物或者使根据权利要求13所述的细胞或植物生长。16.—种制备聚乳酸酯(PLA)或PLA共聚物的方法，该方法包括培养根据权利要求14所述的细胞或植物或者使根据权利要求14所述的细胞或植物生长。17.根据权利要求15所述的方法，其中，在包含羟基链烷酸酯的环境中进行所述培养或生长。18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述羟基链烷酸酯为选自3-羟丁酸酯、3-羟戊酸酯、4-羟丁酸酯、具有614个碳原子的中链长(D)-3-羟基羧酸、2-羟基丙酸、3-羟基丙酸、3_羟基己酸、3-羟基庚酸、3-羟基辛酸、3-羟基壬酸、3-羟基癸酸、3-羟基十一烷酸、3_羟基十二烷酸、3-羟基十四烷酸、3-羟基十六烷酸、4-羟基戊酸、4-羟基己酸、4_羟基庚酸、4-羟基辛酸、4-羟基癸酸、5-羟基戊酸、5-羟基己酸、6-羟基十二烷酸、3-羟基_4-戊烯酸、3-羟基-4-反式-己烯酸、3-羟基-4-顺式-己烯酸、3-羟基-5-己烯酸、3-羟基-6-反式-辛烯酸、3-羟基-6-顺式-辛烯酸、3-羟基-7-辛烯酸、3-羟基-8-壬烯酸、3_羟基-9-癸烯酸、3-羟基-5-顺式-十二烯酸、3-羟基-6-顺式-十二烯酸、3-羟基_5-顺式_十四烯酸、3-羟基-7-顺式-十四烯酸、3-羟基-5，8-顺式-顺式-十四烯酸、3-羟基-4-甲基戊酸、3-羟基-4-甲基己酸、3-羟基-5-甲基己酸、3-羟基-6-甲基庚酸、3-羟基-4-甲基辛酸、3-羟基-5-甲基辛酸、3-羟基-6-甲基辛酸、3-羟基-7-甲基辛酸、3-羟基-6-甲基壬酸、3-羟基-7-甲基壬酸、3-羟基-8-甲基壬酸、3-羟基-7-甲基癸酸、3-羟基-9-甲基癸酸、3-羟基-7-甲基-6-辛烯酸、苹果酸、3-羟基琥珀酸-甲酯、3-羟基己二酸-甲酯、3-羟基辛二酸-甲酯、3-羟基壬二酸-甲酯、3-羟基癸二酸-甲酯、3-羟基辛二酸_乙酯、3-羟基癸二酸-乙酯、3-羟基庚二酸-丙酯、3-羟基癸二酸-苄酯、3-羟基-8-乙酰氧基辛酸、3-羟基-9-乙酰氧基壬酸、苯氧基-3-羟基丁酸、苯氧基-3-羟基戊酸、苯氧基-3-羟基庚酸、苯氧基-3-羟基辛酸、对氰基苯氧基-3-羟基丁酸、对氰基苯氧基_3-羟基戊酸、对氰基苯氧基-3-羟基己酸、对硝基苯氧基-3-羟基己酸、3-羟基-5-苯基戊酸、3-羟基-5-环己基丁酸、3，12-二羟基十二烷酸、3，8-二羟基-5-顺式-十四烯酸、3-羟基-4，5-环氧癸酸、3-羟基-6，7-环氧十二烷酸、3-羟基-8，9-环氧-5，6-顺式-十四烷酸、7_氰基-3-羟基庚酸、9-氰基-3-羟基壬酸、3-羟基-7-氟庚酸、3-羟基-9-氟壬酸、3-羟基-6-氯己酸、3-羟基-8-氯辛酸、3-羟基-6-溴己酸、3-羟基-8-溴辛酸、3-羟基-11-溴十一烷酸、3-羟基-2-丁烯酸、6-羟基-3-十二烯酸、3-羟基-2-甲基丁酸、3-羟基_2-甲基戊酸和3-羟基-2，6-二甲基-5-庚烯酸中的至少一种。19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述羟基链烷酸酯为选自3-羟丁酸酯、4-羟丁酸酯、2-羟基丙酸、3-羟基丙酸、具有614个碳原子的中链长(D)-3-羟基羧酸、3-羟戊酸酯、4-羟基戊酸和5-羟基戊酸中的至少一种。20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述羟基链烷酸酯为3-羟丁酸酯。21.根据权利要求16所述的方法，其中，在包含羟基链烷酸酯的环境中进行所述培养或生长。22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述羟基链烷酸酯为选自3-羟丁酸酯、3-羟戊酸酯、4-羟丁酸酯、具有614个碳原子的中链长(D)-3-羟基羧酸、2-羟基丙酸、3-羟基丙酸、3_羟基己酸、3-羟基庚酸、3-羟基辛酸、3-羟基壬酸、3-羟基癸酸、3-羟基十一烷酸、3_羟基十二烷酸、3-羟基十四烷酸、3-羟基十六烷酸、4-羟基戊酸、4-羟基己酸、4_羟基庚酸、4-羟基辛酸、4-羟基癸酸、5-羟基戊酸、5-羟基己酸、6-羟基十二烷酸、3-羟基_4-戊烯酸、3-羟基-4-反式-己烯酸、3-羟基-4-顺式-己烯酸、3-羟基-5-己烯酸、3-羟基-6-反式-辛烯酸、3-羟基-6-顺式-辛烯酸、3-羟基-7-辛烯酸、3-羟基-8-壬烯酸、3_羟基-9-癸烯酸、3-羟基-5-顺式-十二烯酸、3-羟基-6-顺式-十二烯酸、3-羟基_5-顺式-十四烯酸、3-羟基-7-顺式-十四烯酸、3-羟基-5，8-顺式-顺式-十四烯酸、3-羟基-4-甲基戊酸、3-羟基-4-甲基己酸、3-羟基-5-甲基己酸、3-羟基-6-甲基庚酸、3-羟基-4-甲基辛酸、3-羟基-5-甲基辛酸、3-羟基-6-甲基辛酸、3-羟基-7-甲基辛酸、3-羟基-6-甲基壬酸、3-羟基-7-甲基壬酸、3-羟基-8-甲基壬酸、3-羟基-7-甲基癸酸、3-羟基-9-甲基癸酸、3-羟基-7-甲基_6-辛烯酸、苹果酸、3-羟基琥珀酸-甲酯、3-羟基己二酸_甲酯、3-羟基辛二酸-甲酯、3-羟基壬二酸-甲酯、3-羟基癸二酸-甲酯、3-羟基辛二酸_乙酯、3-羟基癸二酸-乙酯、3-羟基庚二酸-丙酯、3-羟基癸二酸-苄酯、3-羟基-8-乙酰氧基辛酸、3-羟基-9-乙酰氧基壬酸、苯氧基-3-羟基丁酸、苯氧基-3-羟基戊酸、苯氧基-3-羟基庚酸、苯氧基-3-羟基辛酸、对氰基苯氧基-3-羟基丁酸、对氰基苯氧基_3-羟基戊酸、对氰基苯氧基-3-羟基己酸、对硝基苯氧基-3-羟基己酸、3-羟基-5-苯基戊酸、3-羟基-5-环己基丁酸、3，12-二羟基十二烷酸、3，8-二羟基-5-顺式-十四烯酸、3-羟基-4，5-环氧癸酸、3-羟基-6，7-环氧十二烷酸、3-羟基-8，9-环氧-5，6-顺式-十四烷酸、7_氰基-3-羟基庚酸、9-氰基-3-羟基壬酸、3-羟基-7-氟庚酸、3-羟基-9-氟壬酸、3-羟基-6-氯己酸、3-羟基-8-氯辛酸、3-羟基-6-溴己酸、3-羟基-8-溴辛酸、3-羟基-11-溴十一烷酸、3-羟基-2-丁烯酸、6-羟基-3-十二烯酸、3-羟基-2-甲基丁酸、3-羟基_2-甲基戊酸和3-羟基-2，6-二甲基-5-庚烯酸中的至少一种。23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述羟基链烷酸酯为选自3-羟丁酸酯、4-羟丁酸酯、2-羟基丙酸、3-羟基丙酸、具有614个碳原子的中链长(D)-3-羟基羧酸、3-羟戊酸酯、4-羟基戊酸和5-羟基戊酸中的至少一种。24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述羟基链烷酸酯为3-羟丁酸酯。全文摘要本发明提供了一种来自丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶的突变体，其能够在使用微生物制备聚乳酸酯(PLA)或PLA共聚物的方法中高效地将乳酸酯转化成乳酰辅酶A。与传统的在大肠杆菌中弱表达的丙酰辅酶A转移酶不同，在将来自丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶的突变体引入重组大肠杆菌中时，可以非常平稳地提供乳酰辅酶A，因此确保了聚乳酸酯(PLA)和PLA共聚物的高效制备。文档编号C12N15/54GK101784665SQ200880102864公开日2010年7月21日申请日期2008年7月25日优先权日2007年8月14日发明者姜惠玉,朴时载,李恩政,李相贤,梁宅镐,金泰完申请人:Lg化学株式会社