专利名称：：人角膜内皮细胞培养液及其制备方法和应用的制作方法人角膜内鹏§#^^其制备方法和自默领域本发B邻步及一种用于体外i^"增人角膜内皮细胞的i歸液，特别涉及到以牛角膜内皮细WM做为錢活賊份配带MA^膜内皮细膨^^其制备方法和卿。背景狱角膜内卿败comealendothelialcdl，CEC)^&于角膜内面的单层细胞，其外贴后弹力层内临房7k在维躺,明和*能方面担负着觀的角色。当CEC功倉^feP章碍(如大泡性角鹏变、Fuch角膜内皮营新良、内眼手术后内皮失代j磐)时，CEC不能再生仅靠周边正常内飾ffiT大術zR3let勤W员失的细鹏;ts代偿作用，当超出其代偿能力时将严驟响正徵见功能。现今'角赔'是世界i^盲性百嫉的主魏因，角膜移丰錢复明唯一^^的治疗手段，但目前鹏于角麟植的角膜#着严重的供需矛盾，极大制约了角麟植手术的幵展，这一问题在我国尤为显著；并且角麟禾鉢后蹄一定的排斥风险需长期用药以及术后视力不佳等不利因素。随着临床眼科学、生物学和材料^#^斗的飞速，角膜内皮移植賴跑织oa确M^解决这一问题的i^i径，为更多角膜盲患者带来了希望，但^J^两种方法顷利开展的关键是获得足够功倉証常的角膜内皮种子细胞。目前大量研離果显示体内雜多种调节因素抑制了角膜内飾胞的再生能力、而且体外i薪角膜内皮细胞增殖困难，條功兽征常的角膜内皮种子细ii^源^m织a:程角腐勾建和角膜内皮移s^广泛开展的最^ial^t—。以往ff^证实人角膜基质细胞条件培lm中含有基质细胞分泌的减S^纤^飾)3^fe长因子(bFGF)等能iSa角膜内皮细胞的增殖，而目前角膜内自胞i歸液中也多添力口碱f械第翻胞生长因子(bFGF)、表j^fe长因子(EGF)或祌经生长因子(NGF)導MJa角膜内^l胞的增殖，但是添加了战长因子的±^长邦^#角膜内皮细胞在其维持脇、抑伟iJ^^凋t^面未见有明Mfig^。因此，探索人角膜内鄉胞的体外培养体系，寻找制^S其大量扩增、维持规则絲、綱'J衰老凋亡的歸体系迫額睫。
发明内容本发明的目的是掛共一种人角膜内自膨薪^&其制备方法和应用，以弥补现有技术的不足。研^S:现与人角膜内卿胞相比，牛角膜内卿胞在体外容易贴壁、增殖能力强、可以大量銜姐内皮细态维持好，这正是人角膜内皮细胞体外i嫌所不及的。因ltKE人角膜内皮细胞的i錄体系中加入其中的活i^^^^角膜内鄉胞W^，以超胎詢對^4人角膜内皮细胞体外培养^&i殖、维持MPJ,、W^^老凋亡的目的。本发明以体外培养的牛角膜内，胞为原材料制备牛角膜内自|液，并以牛角膜内，M^±^活|4^份配制一种人角膜内，胞体外土歸液，专门用于人角膜内自胞的体外培养。本发明包括主要活|!^￡份蛋白#*占10"200^ml的牛角膜内鹏WM以及缝占10%的胎牛血清、青霉薪口,素各100U/ml其余用D/F12寂股^^补足于无菌容器中配第,成，其中牛角膜内卿的蛋白浓度雌为20掘Mg/ml。本发明的制备方法首先，体外土歸牛角膜内鄉胞；其次，帝iJ拼角膜内飾JMM，；R/g用主要活(^K份蛋白賴占10-200^g/ml的牛角膜内鄉、賴占10%的胎牛血清、青霉素和链霉素各100UM其余用D/F12凝出i^t补^e制j^发明，即人角膜内鄉Sli^^。本发明的特点是在人角膜内,胞体外^##过程中能{*^外人角膜内，殖、维,膜内皮细胞的规则條、抑制人角膜内皮细胞的鼓、凋亡，倉^^鹏高人角膜内鄉胞体外i歸的驢和质量。因此，本发明在体外i^g^人角膜内鹏^ffl方面有显著的交媒，育^^她iSS^外培养人角膜内皮细胞的增殖，并能^!鹏隹持人角膜内,胞的形东。本发明的带恪方法鄉骤如下步骤一、首5fe^外:t錄牛角膜内皮细胞；步骤二、再制齢角膜内卿SfelM，蔬用主要活性成份蛋白含量占10-200pg/ml的牛角膜内皮细ra鞭、含量占10%的胎牛血清、青霉素和素各100U/ml其余用D/F12基础if^^补足配制成，以专门用于体外i^^人角膜内卿胞。其中步骤一(1)/AJ1宰场获取芋賴羊牛B艮球，去離艮球外附带的组织xjg，用PBS冲洗牛眼球，以去除牛眼球上的残繊只；(2)a种眼鄉A^净工作台内，PBS再次浙躯MA含1000U/ml妥布霉^7K中浸泡10-15倂中，取出后再用PBS冲洗牛眼球，以去除牛眼球上残余的妥布霉素；(3)用无菌0艮科剪沿角膨彖!Tf牛眼球的角膜片，用DMEM-富糖型基础i錄液冲洗，再把角膜片内皮面向iS于i歸皿中，在解剖显微镜下沿角IM^取下角斷上带有内皮细胞的后弹力层，再鹏弹力层上的内鹏胞面向下贴于另一培养皿内，待战内皮细鹏占牢后，#^加少许含量占10%的胎牛血清和2ngtolbFGF的DMEM-富糖型i:歸液于i歸皿中浸版弹力层，在37°C、CO2浓度为5%的斜牛下常规土鎌以得到原代牛角膜内皮细胞；或者是将取下的带有内鄉胞的后弹力层直接方JfA含量占10%的胎牛血清和2ngto!bFGF的DMEM-^M型i^^中过夜，第二天离心去上清液，力口入浓度为0.02g/ml的EDTA消化液37'C消化1小时，再离心去上清液，蹄加含量占10%的胎牛血清和2ng/mlbFGF的DMEM-高糖型:fel^液吹打自胞悬液，并移Ai^皿内常规i^牛角膜内皮细胞；(4)次日向i錄皿中补力n^M占10%的胎牛血清和2ng/mlbFGF的DMEM-Slt型;^^t,每3天魏一次J^^皿中的i^im，待原代牛角膜内自^:^#皿面积的80%以上，即可对m^代牛角膜内鹏鹏行銜#緣(5)传^ffl浓度为0.125g/ml的月,B浓度为0.02g/ml的EDTA消化^37。C、。02为5%的^|牛下消化贴壁的牛角膜内細胞，5^+后〗种角膜内鹏^个圆形细胞时，再用鍾占10%的胎牛血激^#止消化、并蝶牛角膜内皮细胞悬液，1000ipm离心5溯、去上清液、力D^1:占10%的胎牛血清和2ng/mlbFGF的DMEM-寓糖型ig^S，按照1:1^#3&1传为24i^皿细胞量的比例传代于直径9cm:tg^皿内常挪歸，以得到足够量的牛角膜内^ffl)Kafi^i旨角步fc、制糾角膜内皮细MM(1)将J^銜tt錄的牛角膜内鄉胞，用PBS冲鄉胞二次，再用離为0.125gM的JRSIff鹏为0.02^ml的EDTA消化職37。C、CO2浓度为5%的割牛下消化贴壁的牛角膜内皮细胞，5^H+后寸种角膜内卿M^个圆形细胞时，再用籠占l(f/。的胎牛血清i^S终止消化、并收集牛角膜内鹏胞悬液；(2)1000ipm离心5^H中去上清液，加入D/F12基石股gf^S轻吹打鹏脱悬液，同法重复3次以去除其中的胎牛血清成份，最后再加足量的凝出il^SD/F12以重悬牛角膜内皮细胞，如对^#^直径9跡的歸皿消化下来的细鹏n10mlD/F12(3)再将牛角膜内Mfl胞悬M-20。C冷冻30併中后37。C解冻，如此反复3次以使牛角膜内鄉胞充分纖；(4)以0.22,滤器滤除战牛角膜内皮细鹏鞭中的细胞碎片，即得至件角膜内皮细MM，留取lml样本待用BCA蛋白试剂激则其蛋白含量；雖在无菌容器中配制主要活H^伤嘴白含量占10"200^ml的牛角膜内皮细MM、賴占10%的胎牛血清、青霉素和链霉素各訓U/ml其余用D/F12基础^^夜补足，即得本发明人角膜内鄉胞培养液。Tffi以本发明中牛角膜内鹏W^为主要活(4/t份的i^M为^ffi例详细说明鄉例lMIT'紛析不同浓度的牛角膜内皮细MM液促人角膜内皮细胞增殖的,兄(1)将AJ3台儿角膜内飾胞以同样驢的趟台细胞接种到96孑Lfel:(细胞接种密度为4"5xl04个/ml)，置于37。C、50/oC02剩牛下職(2)次日细M6離，去除原液分别ifet含0、10、20、50、100、200ng/ml蛋白的牛角膜内鄉臓鹏的D/F12i"gl^(龍占歸的胎牛血清)，每组设6个該孔；(3)@#冬5琉，MTT法测定各会fiAffiH維膜内ra胞的增殖情况。结果显示蛋白賴为1(W00Mg/ml的牛角膜内鹏MW^且i)Sa角膜内飾鹏殖能力:l^t于只含胎牛血^i且，其中以蛋白，为20-100ng/ml的牛角膜内^佳。鄉例2MTT^^析不同i^^SA角膜内^Mfitt殖的情况(1)将A^台J说膜内Mg胞以同样M的趟織胞接种到96孑Lfei(细胞接种密度为4-5xl(f个/ml)，置于37。C、50/oCQz餅下職(2)次日细ffite壁后，去除原液分别^g分别&^D/F12培养液、含50^ml蛋白浓度的牛角膜内，MM、50Mgtel蛋白^g的牛角^hJ^Hffiia鞭、50ngtol蛋白的牛角膜基质细液、A^台儿角膜基质细胞斜牛:t^^和牛角膜内飾胞劍牛i&M的D/F12:t^t(6组±§中鹏含量占腦的胎牛血清)每组设5个鼓孔；(3)继彰歸4-5Xig，MTT法测定各纟M台角膜内皮细胞的增殖情况。结果见下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>显然，本发明蛋白^S为5(^g/ml的牛角膜内皮细|鞭组，其{4角膜内皮细胞增殖能力均优于D/F12培fM组、蛋白^4为50pg/ml的牛角J3fi:皮细MI鞭组、蛋白含量为50j^ml的牛角膜基质细鹏MS、Al台儿角膜基质细胞斜牛培养漱且和牛角膜内皮细胞割牛i^ma。鄉例3倒，微镜下观察牛角膜内，自^^寸人角膜内皮细态的维持(1)将A^台儿角膜内鹏胞以同样M的趟^ffll^^中到24孑L^J:，置于37。C、5%(202斜牛下土歸；(2)次日细鹏離，去除原液分别换作含0、10、20、50、100、200^ml蛋白的牛角膜内卿臓角鞭的D/F12培鎌(含量占10%的胎牛血清)，每组设3个复孔；(3)倒觀微镜下,见察并照相的生长汰态。结腿示蛋白缠为10-200pg/ml的牛角膜内鹏M^飽g^itMt^胎儿角膜内飾胞的规形内态，随着培养时间的延长不含牛角膜内^&^容易出现^^凋亡，其中以蛋白为20-100ng/ml的牛角膜内飾|^**佳。魏例4使JSM微镜下观^^角膜内劇MM^A^台儿角膜内MB胞传代的影响(1)将yy台儿角膜内飾胞以同样驢的起鄉胞传代接种到24孑^J:，置于37。C、5。/oCQ2斜牛下培养；(2)次日细J3fi!te,，去除原液分别换作含0、25、50、100^ml蛋白的牛角膜内細MM的D/F12±歸液(缠占腦的胎牛血清)，每组设3个复孔；(3)倒SM微镜下繊观察并照相iB^ffl胞的生长枕态。结颗示蛋白賴为25-100^ml的牛角膜内鹏ffiW^;t錄的AI台儿角膜内飾鹏圣消化传代更易于贴壁，传f^细MS易于增殖，且可以维持|^的内皮细^。鄉例5牛角膜内皮细lfeSM^寸AJ^儿角膜内皮细胞中S^和增殖相錢因鋭的影响(1)将AJ3台儿角膜内皮细胞以同样驢的趟鰂胞接种到24孑L社，置于37。C、5。/oCQ2斜牛下J:歸；(2)次日细胞贴離，去除原液分别换作含0、10、20、50、100、200Hg/ml蛋白的牛角膜内皮细角對夜的D/F12培M(^!:占10%的胎牛血清)；(3)收^ffii^培^^歸的人角膜内皮细胞，提取细胞的总RNA并反转成cDNA，以用于RT-PCR翻；(4)RT-PCR方法检测W1f品中增殖相关基因Ki67&S老相关基因SOD2、P16的^iM。结果显示蛋白賴为20-謂一ml的牛角膜内皮细鹏^^歸的AI台儿角胰内皮细胞中SOD2、pl6^iil:明显低于不含牛角膜内皮细lfiM^培养的AJ!台儿角膜内皮细胞，而Ki67載翻湘反，这充分表明牛角膜内，ra鞭制sa人角膜内皮细胞的增殖、抑制角膜内皮细胞的衰老凋亡。显然，本发明的人角膜内皮细l&fe&im比含AI台儿角膜基质细胞斜牛培鎌、牛角膜内鄉胞^f牛i歸液、牛角Mi:Mtllfiia鞭、牛角膜SM细MW3:D/F12力口含量占10n/。胎牛血清的i^^SS人角膜内鄉胞的增殖玄M强，能输子的〈&af本外i歸的人角膜内MS胞;^扩增、维持角膜内皮细胞的#征、抑制细M老和凋亡，并且更利于内皮细胞的传f^t咅养。其中以含蛋白^l:为20-100^ml的牛角膜内皮细Ma游fi^R佳。另外，本发明的原材争件角膜内皮细fe^源丰富易于体外培养，且制备方法简单，便于叙包，有利于产业化，具有广阔的鹏开发前景。权利要求1、人角膜内皮细胞培养液，其特征在于该培养液包括主要活性成份为蛋白含量占10-200μg/ml的牛角膜内皮细胞裂解液以及含量占10％的胎牛血清、青霉素和链霉素各100U/ml其余用DMEM/F12基础培养液补足于无菌容器中配成。2、如权利要求1所述的人角膜内皮细胞培养液，其特征在于上述的主要活性成份牛角膜内皮细胞裂解液的蛋白浓度优选为20-100ug/ml。3、如权利要求1所述的人角膜内皮细胞培养液的制备方法步骤一、首先体外培养牛角膜内皮细胞；步骤二、然后制备牛角膜内皮细胞裂解液，最后按蛋白含量占10-200^g/ml的牛角膜内皮细胞裂解液、含量占10%的胎牛血清、青霉素和链霉素各100U/ml以及DMEM/F12基础培养液补足混匀配制于无菌容器中；其中上述步骤一中的体外培养牛角膜内皮细胞的方法如下(1)从屠宰场获取新鲜牛眼球，去除眼球外附带的组织后，用大量的PBS冲洗牛眼球；(2)将上述牛眼球移入超净工作台内，用PBS再次冲洗后浸入含1000U/ml妥布霉素水中浸泡10-15分钟，取出后再用PBS冲洗牛眼球；(3)用无菌眼科剪沿角膜缘剪下上述牛眼球的角膜片，用DMEM-高糖型基础培养液冲洗，再把角膜片的内皮面向上置于培养皿中，在解剖显微镜下沿角膜缘取下角膜片上带有内皮细胞的后弹力层后，再把后弹力层上的内皮细胞面向下贴于另一培养皿内，待内皮细胞贴牢后，再添加含量占10%的胎牛血清和2ng/mlbFGF的DMEM-高糖型培养液于培养皿中浸没后弹力层，并在37°C、C02浓度为5%的条件下常规培养即得到原代牛角膜内皮细胞；(4)次日向该培养皿中补加含量占10%的胎牛血清和2ng/mlbFGF的DMEM-高糖型培养液，每3天更换一次培养皿中的培养液，待原代牛角膜内皮细胞达到培养皿面积的80%以上，即可对该牛角膜内皮细胞进行传代培养以得到足够量的牛角膜内皮细胞来制备牛角膜内皮细胞裂解液；其中上述步骤二中的制备牛角膜内皮细胞裂解液的制备方法(l)将上述得到的牛角膜内皮细胞，用PBS冲洗细胞二次，再用浓度为0.125g/ml的胰酶和浓度为0.02g/ml的EDTA消化液在37°C、(202浓度为5%的条件下消化贴壁的牛角膜内皮细胞，5分钟后待牛角膜内皮细胞形成单个圆形细胞时，即用含量占10%的胎牛血清培养液终止消化、并收集牛角膜内皮细胞悬液于离心管中；(2)1000卬m离心5分钟去上清液，加入DMEM/F12基础培养液轻轻吹打成细胞悬液，同法重复3次，以去除其中的胎牛血清成份，最后再加足量的基础培养液DMEM/F12重悬牛角膜内皮细胞；(3)再将上述牛角膜内皮细胞悬液在-20。C冷冻30分钟后37。C解冻，如此反复3次，以使牛角膜内皮细胞充分裂解；(4)用0.22pm滤器滤除上述牛角膜内皮细胞裂解液中的细胞碎片，得到牛角膜内皮细胞裂解液，留取lml样本待用BCA蛋白试剂盒测其蛋白含量；最后在无菌容器中配制蛋白含量占10-200pg/ml的牛角膜内皮细胞裂解液、含量占10%的胎牛血清、青霉素和链霉素各100U/ml其余用DMEM/F12基础培养液补足，即得人角膜内皮细胞培养液。4、如权利要求3所述的人角膜内皮细胞培养液的制备方法，其特征是上述传代培养方法是(1)首先用浓度为0.125g/ml的胰酶和浓度为0.02g/ml的EDTA消化液在37°C、浓度为5%的C02条件下消化贴壁的牛角膜内皮细胞，5分钟后待牛角膜内皮细胞成单个圆形细胞时，再用含量占10%的胎牛血清的培养液终止消化、并收集牛角膜内皮细胞悬液；(2)将上述收集的牛角膜内皮细胞悬液以1000rpm离心5分钟、去上清液后加含量占10%的胎牛血清和2ng/mlbFGF的DMEM-高糖型培养液，按照1:2-1:4的比例传代并常规培养。5、如权利要求3所述的人角膜内皮细胞培养液的制备方法，其特征是上述歩骤一中，原代牛角膜内皮细胞体外培养方法还可将取下的带有内皮细胞的后弹力层放入含量占10%的胎牛血清和2ng/mlbFGF的DMEM-高糖型培养液中过夜，第二天离心去上清液，加入浓度为0.02g/ml的EDTA消化液37'C消化1小时，再离心去上清液，加入含量占10%的胎牛血清和2ng/mlbFGF的DMEM-高糖型培养液吹打成细胞悬液并移入培养皿内常规培养牛角膜内皮细胞6、人角膜内皮细胞培养液应用于人角膜内皮细胞的体外培养。全文摘要本发明涉及一种人角膜内皮细胞培养液及其制备方法和应用。包括主要活性成份为蛋白含量占10-200μg/ml的牛角膜内皮细胞裂解液及含量占10％的胎牛血清、青霉素和链霉素各100U/ml其余用D/F12基础培养液补足。方法首先体外培养牛角膜内皮细胞；然后制备牛角膜内皮细胞裂解液，最后在无菌容器中配制即得。本发明首次将牛角膜内皮细胞裂解液制成细胞培养液并应用到人角膜内皮细胞的体外培养，能促进体外培养的人角膜内皮细胞大量扩增、维持角膜内皮细胞的形态特征、抑制细胞衰老和凋亡，并且更利于内皮细胞的传代培养。其中的原材料牛角膜内皮细胞来源丰富易于体外培养，培养液的制备方法简单，便于实施，有利于产业化，具有广阔的应用开发前景。文档编号C12N5/08GK101597592SQ20091001634公开日2009年12月9日申请日期2009年6月11日优先权日2009年6月11日发明者史伟云,周庆军,杨玲玲,彦高申请人:山东省眼科研究所