专利名称：：C端缺失型p43蛋白及其在肿瘤治疗药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及缺失型重组人P43蛋白及其在肿瘤治疗药物中的应用。
背景技术：
：恶性肿瘤是威胁人类健康的大敌，医学界对恶性肿瘤的治疗主要采取杀死癌细胞为主的方法，即手术、化疗、放疗等。这些方法在杀死癌细胞的同时也损伤正常细胞，并且容易使肿瘤细胞产生耐药性。因而，人们一直在探索一种能专一性地杀死肿瘤细胞且不损伤正常细胞，同时又不易使肿瘤产生耐药性的治癌方法。目前用于治疗肿瘤的新药层出不穷。近年来，随着分子生物学技术的快速发展，人们逐渐关注运用基因工程药物治疗恶性肿瘤的方法。传统的肿瘤化疗大多使用细胞毒性药物，在杀死肿瘤细胞的同时也对正常细胞造成损害，削弱人的体质。所以很多癌症晚期患者最后多因为无法承受治疗而致死亡。恶性肿瘤有一个共同的特性，那就是局部的细胞疯狂地、不受遏制地增殖，而维持这种增殖就意味着需要大量营养供应。在肿瘤形成的同时，瘤体的内部及周围会形成大量供应养分的血管。那么如果能切断这些供养“管道”，阻断肿瘤的营养来源，肿瘤也就会衰竭而死。当前兴起的新生血管抑制疗法为彻底治疗肿瘤带来了曙光。研究发现肿瘤特别是实体瘤的生长需要大量的营养供应，在肿瘤周围会形成大量的新生血管。抗血管生成疗法主要是通过抑制快速异常增殖的血管内皮细胞的生长，特异性抑制肿瘤血管内皮细胞增殖，从而达到阻止肿瘤血管生成，使肿瘤毛细血管发生萎缩，切断肿瘤的营养供应，使肿瘤细胞凋亡或退化到最初的休眠状态，从而达到治疗癌症的目的。经过近十年的不断努力，现在已发现了多种有希望成为肿瘤治疗药物的新生血管抑制剂。其中最具代表性的是人血管内皮抑制素(humanendostatin)0有关人血管内皮抑制素(Endostatin)国际上首先报道是1997年1月Cell杂志上刊登的美国哈佛医学院福尔克曼(Folkman)研究小组的鼠内皮抑素基因的论文，该研究发现Angiostatin和Endostatin可以消除小鼠体内恶性肿瘤，而且未再复发。这两种药物是以阻止为肿瘤提供营养的血管的生长从而治疗肿瘤的。当时引起了国际轰动，Endostatin迅速成为肿瘤治疗领域的研究热点。美国FDA在没有完成临床前研究的情况下特批30例对其它药物已无反应的晚期癌症病人于99年初用人血管内皮抑制素(Angiostatin)和鼠内皮抑素(Endostatin)混合基因工程针剂进行临床试验。。目前，Endostatin已经通过了FDA的一期临床，目前正处于二期临床阶段。但由于Endostatin的溶解性较差，使得它的制备成本升高，同时在使用上也只能采用水针剂型，这使它的应用受到了很大的限制。p43蛋白是哺乳类动物氨酰tRNA合成酶的辅助因子，一方面直接调节内皮细胞形成毛细血管的生理过程，另一方面通过改变微环境来抑制肿瘤血管的生成。P43蛋白的抗血管生成活性及抑制肿瘤生长作用已经在体外及动物实验获得证实。人基因重组P43蛋白显示出其被开发成新型治疗癌症药物的潜力，对抗多种原发性和转移性实体肿瘤均有效，并可与化疗和放疗协同治疗。p43蛋白作为人体氨酰tRNA合成酶系的家族成员并且是内皮单核细胞激活肽的前体于1997年被SophieQ等人发现。p43蛋白为单链蛋白，全长312个氨基酸，二级结构含有11个β片层。韩国Imagene公司(W001/95927)对人ρ43蛋白的结构、生物活性进行了深入的研究，结果显示人Ρ43蛋白可以抑制快速异常增殖的血管内皮细胞的生长，以及抑制鸡胚尿囊膜新生血管生成，这说明Ρ43蛋白具有潜在的抗肿瘤作用。但是，目前仍需要对ρ43蛋白进一步改进，得到抗肿瘤效果更好的药物。
发明内容本发明的发明人经过大量研究发现，将ρ43蛋白的312个氨基酸的一部分切除得到的缺失型Ρ43蛋白具有更高的抗肿瘤活性。因此，本发明的一个目的是提供缺失型ρ43蛋白，其具有更高的抗肿瘤活性。本发明的另一个目的是提供缺失型ρ43蛋白在治疗抗肿瘤药物中的用途。本发明的还有一个目的是提供一种用于抗肿瘤的药物组合物，它包含缺失型ρ43蛋白。本发明提供了一种缺失型ρ43蛋白，它包括SEQIDNO:1所示氨基酸序列中缺失第250-312位氨基酸所得到的蛋白。在本发明的一个优选实例中，所述缺失型ρ43蛋白包括SEQIDNO=I所示氨基酸序列中缺失第265-312位氨基酸所得到的蛋白。在本发明的一个优选实例中，所述缺失型ρ43蛋白包括SEQIDNO=I所示氨基酸序列中缺失第265-289位氨基酸所得到的蛋白。在本发明的一个优选实例中，所述缺失型ρ43蛋白包括下列所示的蛋白(I)SEQIDNO:2序列(2)SEQIDNO3序列(3)SEQIDNO4序列(4)SEQIDNO5序列(5)SEQIDNO6序列。在本发明的一个优选实例中，所述缺失型ρ43蛋白与BSA、PEG和/或人血白蛋白的等分子偶联，形成多肽偶联物。在本发明的一个优选实例中，所述的偶联物由多肽、交联剂和BSA构成，其中所述的交联剂戊二醛或EDAC。本发明还提供了一种抗肿瘤的药物组合物，它包含(a)安全有效量的本发明所述的缺失型P43蛋白、偶联物或其组合；以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。本发明还提供了本发明所述的缺失型p43蛋白在制备治疗肿瘤药物中的用途。本发明还提供了编码本发明所述的缺失型p43蛋白的核苷酸序列。通过构建缺失型p43蛋白，能确定特异性抑制新生血管生成的结构域从而减少副作用，此外缺失型P43蛋白的分子量更小，从而易于吸收、具有更高的疗效。图1表示p43系列缺失体目的片断的PCR扩增结果，其中1表示p43_6;2表示p43-7；3表示p43-8；4表示p43_9；5表示p43_10；6表示DL2000。图2A表示目的蛋白诱导的结果，其中1、12表示蛋白质分子量标准；2表示p43_6诱导前；3表示p43-6诱导后的结果；4表示p43-7诱导前；5表示p43_7诱导后的结果；6表示p43-8诱导前；7表示p43-8诱导后的结果；8表示p43_9诱导前；9表示p43_9诱导后的结果；10表示p43-10诱导前；11表示p43-10诱导后的结果。图2B表示表达形式分析，其中1表示P43-6超声后上清；2表示p43_6超声后沉淀；3表示p43-7超声后上清；4表示p43-7超声后沉淀；5表示蛋白质分子量标准；6表示P43-8超声后上清；7表示p43-8超声后沉淀；8表示p43_9超声后上清；9表示p43_9超声后沉淀；10表示p43-10超声后上清；11表示P43-10超声后沉淀。图3表示p43系列缺失体纯化图谱，其中1表示P43-6的纯化结果；2表示p43_7的纯化结果；3表示p43-8的纯化结果；4表示p43-9的纯化结果；5表示p43_10的纯化结果。图4表示p43系列缺失体纯化流程图。图5表示p43缺失体对HUVEC管腔形成的作用，其中1表示阴性对照；2表示p43全长；3表示p43-6；4表示p43-7；5表示p43_8；6表示p43_9；7表示p43_10。图6表示p43缺失体对HUVEC迁移抑制结果，其中1表示p43缺失体与全长蛋白迁移抑制活性的比较示意；图2表示p43缺失体相对于全长蛋白的抑制活性示意图。具体实施例方式本发明涉及的药物组合物包含安全有效量的本发明涉及的化合物和药物上可接受的载体。“安全有效量”系指在普遍认同的医学判定范畴内，化合物的用量足以改善待治病情，且治疗时并未出现严重的副作用。某化合物的安全有效量应根据具体的待治病情、接受治疗的病人的年龄和生理状况、病情严重程度、疗程长短、药用载体及给药途径等因素而确定。此时组合物中包含按重量计约0.至约99.9%的化合物。在本发明中，如果没有特别的说明，百分数(％)或者份都指相对于纯的树脂的重量百分数或者重量份。在本发明中，如果没有特别的说明，所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合形成新的技术方案。在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方式可以相互组合形成新的技术方案。在本发明中，如果没有相反的说明，组合物中各组分的含量之和为100%。在本发明中，如果没有相反的说明，组合物中各组分的份数之和可以为100重量份。在本发明中，除非有其他说明，数值范围“a-b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“0-5”表示本文中已经全部列出了“0-5”之间的全部实数，“0-5”只是这些数值组合的缩略表示。在本发明中，除非有其他说明，整数数值范围“a-b”表示a到b之间的任意整数组合的缩略表示，其中a和b都是整数。例如整数数值范围“1-N”表示1、2……N，其中N是整数。在本发明中，除非有其他说明，“其组合”表示所述各元件的多组分混合物，例如两种、三种、四种以及直到最大可能的多组分混合物。如果没有特别指出，本说明书所用的术语“一种”指“至少一种”。本文所公开的“范围”以下限和上限的形式。可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。给定范围是通过选定一个下限和一个上限进行限定的。选定的下限和上限限定了特别范围的边界。所有可以这种方式进行限定的范围是包含和可组合的，即任何下限可以与任何上限组合形成一个范围。例如，针对特定参数列出了60-120和80-110的范围，理解为60-110和80-120的范围也是预料到的。此外，如果列出的最小范围值1和2，和如果列出了最大范围值3，4和5，则下面的范围可全部预料到1-3、1-4、1-5、2-3、2-4、和2_5。在本文中，除非另有说明，各组分的比例或者重量都指干重。在本文中，除非另有说明，p43蛋白的氨基酸序列为SEQIDN0:1所示。在本文中，除非另有说明，缺失型p43蛋白表示截短的SEQIDNO:1所示的蛋白或其保守性变体。在本文中，除非另有说明，缺失第N位氨基酸表示缺失SEQIDNO:1氨基酸序列中第N-312位氨基酸，其中N表示1-312的整数。例如，缺失第300-312位氨基酸表示SEQIDNO1氨基酸序列中分别缺失第300-312位氨基酸、第301-312位氨基酸……第311-312位氨基酸以及第312位氨基酸所得的氨基酸序列的组合。本发明一方面提供了一种缺失型p43蛋白，它包括SEQIDN0:1所示氨基酸序列中缺失第250-312位氨基酸所得到的蛋白。在本发明的一个优选实例中，所述缺失型p43蛋白包括SEQIDNO=I所示氨基酸序列中缺失第265-312位氨基酸所得到的蛋白。在本发明的另一个优选实例中，所述缺失型p43蛋白包括SEQIDNO=I所示氨基酸序列中缺失第265-289位氨基酸所得到的蛋白。在本发明的还有一个优选实例中，所述缺失型p43蛋白包括下列所示的蛋白(I)SEQIDNO:2序列(p43_6)(2)SEQIDNO3序列(p43_7)(3)SEQIDNO4序列(p43_8)(4)SEQIDNO5序列(p43_9)(5)SEQIDNO:6序列(p43_10)。在本发明中，所述p43蛋白是常规的，现有技术中已经公开了其制备方法和序列，具体参见US5641867和W00195927，上述专利文献的所有内容以引用的方式全文插入于此。在本发明的一个优选实例中，所述P43蛋白由信谊药厂提供。在本发明中，所述形成缺失型p43蛋白的方法是常规的，本领域的普通技术人员根据本发明的描述可以直接得到所述缺失型P43蛋白。在本领域中，所述形成缺失型p43蛋白的方法一般包括宿主表达方法、直接合成方法和全长蛋白质切割方法等。在本发明中，所述缺失型p43蛋白也可用于与例如BSA、PEG和/或人血白蛋白的等分子偶联，从而形成多肽偶联物。通常，所述的偶联物由多肽、交联剂和BSA构成，其中所述的交联剂优选为戊二醛或EDAC。此外，本发明的缺失型p43蛋白及其偶联物还可用于制备抗肿瘤的药物组合物。因此，本发明另一方面提供了一种抗肿瘤的药物组合物，它包含(a)安全有效量的本发明缺失型P43蛋白、偶联物或其组合；以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。本发明缺失型P43蛋白的数量通常为10微克到100毫克/剂，较好为100微克到50毫克/剂，更好1000微克到10毫克/剂，最好3000到5000微克/剂。本发明所用的术语“有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、疾病的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约1微克到100毫克/千克体重/天，较好为100微克到50毫克/千克体重/天本发明的蛋白。药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体。该术语指这样的一些药剂载体它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的，在Remington，sPharmaceuticalSciences(MarkPub.Co.,N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂(载体)的充分讨论。这类载体包括(但不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐剂、及其组合。治疗或预防性组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、PH缓冲物质等。通常，可将治疗或预防性组合物制成可注射剂型，例如液体溶液或悬液，还可制成在注射前适合混入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。一旦配成本发明的组合物，可将其直接给予对象。待预防或治疗的对象可以是动物，尤其是人。本发明的含本发明多肽的治疗或预防性药物组合物，可以经口服、皮下、皮内、静脉注射、肌内注射等方式应用。治疗剂量方案可以是单剂方案或多剂方案。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例实施例1制备SEQIDNO2氨基酸序列的缺失型p43蛋白(p43_6)目的片断的PCR扩增以中国专利申请CN101225371A中公开的p43蛋白的表达质粒为模版，以表1所示的引物组(引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成)，采用K0D-plUS(T0Y0B0)反应体系分别PCR扩增SEQIDN0:7的核苷酸序列(表2)，琼脂糖凝胶电泳结果表明，扩增得到了大小与预期相符合的目的条带(图1)。表1_产物名称_引物组_产物(bp)SEQIDNO2Primerl2&Primer07882SEQIDNO3Primer12&Primer08873SEQIDNO4Primer12&Primer09849SEQIDNO5Primerl2&PrimerlO822SEQIDNO6Primer12&Primer11_810_；!"^、麗Primer075'-CGCTCGAGGTATGTAGCCAC-3'PrimerO85'-CGCTCGAGCACACACTCATC-3'Primer095'-CGCTCGAGATCAGGCTGGAT-3'Primer105'-CGCTCGAGCTTCTTAGGATTCAG-3’Primer115’-CGCTCGAGCAGCTCCTTGT-3'Primer125，-CGGAATTCTAATGGCAAATAATGATGCTG-3'表2PCR反应休系(50μ1):__..■·................Μ.........二..::......rCiiShζ:..·.:-:........:.:.......:........,.......,:......................................................................—___—KODplus缓冲液5μ1，2mMdNTP5μ1,25mMMgSO42μ1，模板0.5μ1,25ρΜ上下游引物各Ιμ，KODplusΙμ,H2O34.5μ1pCR反应程序:^94。c2分钟KC15sΓ940C15sp4°C15s5个循环58°C^30s5个循环5530^25个循环52°C30s-.680C60s1680C60s60s表达载体的构建PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、割胶回收、纯化；利用EcoRI和XhoI(TaKaRa)分别双酶切各个PCR产物及pTIG-Trx质粒载体。以T4DNA(TaKaRa)连接酶4°C连接过夜，连接产物转化E.coliTOPlO感受态细胞(天根生化科技(北京)有限公司)。筛选具有外源DNA插入的阳性克隆。经ABI3700型测序仪、采用T7pr0m0ter和T7terminator引物双向测序，结果证明得到了SEQIDNO:7核苷酸序列的目的基因。分别转化pTIG-Trx_p43系列缺失体至E.coliBL21(DE)感受态细胞(天根生化科技(北京)有限公司)，经小量培养、质粒抽提及EcoRI和XhoI双酶切鉴定具有正确目的基因插入的单菌落，扩大培养，建立带有SEQIDNO:7核苷酸序列表达载体的工程菌。将构建好的工程菌接种于液体LB中，200rpm、37°C培养至0.D.600为0.4-0.6，加入终浓度为ImM的IPTG，200rpm、37°C继续培养4h。离心收集菌体，再以20mMTris(pH8.0)重悬菌体，超声裂菌，SDS-PAGE分析表达形式(图2)。扩大培养后收集得到的菌体，加入ImMPMSF冰浴条件下超声破碎菌体，40C9000rpm离心30min，收集上清。以HisTrapFF亲和层析柱对目的蛋白进行纯化，收集洗脱液，冷冻干燥浓缩，得到SEQIDN0:2氨基酸序列的缺失型p43蛋白(图3)，具体纯化流程如图4。^MM2制各SEQIDNO=3t[某酸序歹U的缺失型p43舶(d43_7)如实施例1相同的方法制备SEQIDNO3氨基酸序列的缺失型p43蛋白，不同的是用表2所示的相应引物合成SEQIDNO.8核苷酸序列的目的基因。实施例3制备SEQIDNO4氨基酸序列的缺失型d43蛋白(D43_8)如实施例1相同的方法制备SEQIDNO4氨基酸序列的缺失型p43蛋白，不同的是用表2所示的相应引物合成SEQIDNO:9核苷酸序列的目的基因。实施例4制备SEQIDNO5氨基酸序列的缺失型d43蛋白(D43_9)如实施例1相同的方法制备SEQIDNO5氨基酸序列的缺失型p43蛋白，不同的是用表2所示的相应引物合成SEQIDNO:10核苷酸序列的目的基因。实施例5制备SEQIDNO6氨基酸序列的缺失型d43蛋白(D43_10)如实施例1相同的方法制备SEQIDNO6氨基酸序列的缺失型p43蛋白，不同的是用表2所示的相应引物合成SEQIDNO:11核苷酸序列的目的基因。^MM6:p43系歹U缺失体g白抑泡丨肿瘤新牛血If牛成实验材料和方法M199，FBS及胰酶购自Gibico；Transwell购自corning；Matrigel购自BDBiosciences；纤维粘蛋白购自Sigma；荧光染料CalceinAM购自Biotium。细胞培养人脐静脉内皮细胞株(HumanUmbilicalVeinEndothelialCells,HUVEC)细胞由中国药科大学药物筛选中心袁胜涛副教授惠赠。细胞培养于含10%FBS的M199培养基中，37°C、5%CO2孵箱中培养。待细胞处于指数生长期时进行实验。内皮细胞管腔形成抑制实验Matrigel胶在冰上融化后，加入预冷的96孔板中(60μ1/孔)，37°C放置30分钟使其凝固。每孔加入用含10%FBS的M199培养液稀释的HUVEC(3.0XIO4个细胞/100μ1/孔)。同时分别加入一系列终浓度为50ymOl/ml的ρ43全长及缺失体样品，37°C孵育4h，加荧光染料CalceinAM染色，荧光显微镜下观察，随机选三个视野拍照(X100)。实验结果表明p43-6、p43-7、p43-8、p43-9和p43_10缺失型蛋白抑制血管内皮细胞管腔形成的活性明显高于P43蛋白。p43蛋白作用的管腔还没有完全断裂、有比较完整的管腔结构，而P43-6、p43-7、p43-8、p43_9和p43_10缺失型蛋白作用的管腔几乎都已断裂(图5)。内皮细胞迁移抑制实验以细胞迁移实验作为p43缺失体活性的定量检测方法，迁移抑制率作为活性高低的评价标准。把缺失体蛋白的迁移抑制率与全长人P43蛋白进行比较。HUVEC经血清饥饿4-5h。在Transwell的下室面涂上纤维粘蛋白，置超净台内风干。胰酶消化细胞，用PBS润洗，以含0.2%FBS的M199培养基重悬、计数。取细胞悬液180μ1加入内室(105个细胞)。外室加入10%FBS的M199培养基，540μ1/孔。将ρ43全长及缺失体于内室中加入20μ1，外室中加入60μ1(终浓度为50μmol/ml)，混勻，并以PBS作为阴性对照。将培养板置于37°C、5%CO2培养箱内培养16-18h。弃去孔中培养液，用90%乙醇固定细胞lOmin。用棉签轻轻擦去内室上层未迁移的细胞，0.结晶紫室温染色lOmin，用PBS漂净多余染料，以10%乙酸ΙΟμΙ/孔抽提lOmin。以酶标仪在595nm波长测定光吸收。根据以下公式计算迁移抑制率迁移抑制率=(A对照-A处理)/A对照X100%。在相同条件下，p43-6、p43-7、p43-8、p43-9和p43_10缺失型蛋白的血管内皮细胞的迁移抑制活性明显高于全长的P43蛋白(表3)。表3、p43缺失体对HMEC-I迁移抑制结果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>序列表<110>信谊药厂<120>C端缺失型ρ43蛋白及其在肿瘤治疗药物中的应用<130)090787<160>11<170>PatentInversion3.3<210>1<211>312<212>PRT<213>p43蛋白<400>1MetAlaAsnAsnAspAlaValLeuLysArgLeuGluGlnLysGlyAla151015GluAlaAspGlnlielieGluTyrLeuLysGlnGlnValSerLeuLeu202530LysGluLysAlalieLeuGlnAlaThrLeuArgGluGluLysLysLeu354045ArgValGluAsnAlaLysLeuLysLysGlulieGluGluLeuLysGln505560GluLeulieGlnAlaGlulieGlnAsnGlyValLysGlnlieAlaPhe65707580ProSerGlyThrProLeuHisAlaAsnSerMetValSerGluAsnVal859095lieGlnSerThrAlaValThrThrValSerSerGlyThrLysGluGln100105110lieLysGlyGlyThrGlyAspGluLysLysAlaLysGluLyslieGlu115120125LysLysGlyGluLysLysGluLysLysGlnGlnSerlieAlaGlySer130135140AlaAspSerLysProlieAspValSerArgLeuAspLeuArglieGly145150155160CyslielieThrAlaArgLysHisProAspAlaAspSerLeuTyrVal165170175GluGluValAspValGlyGlulieAlaProArgThrValValSerGly180185190LeuValAsnHisValProLeuGluGlnMetGlnAsnArgMetVallie195200205LeuLeuCysAsnLeuLysProAlaLysMetArgGlyValLeuSerGln210215220AlaMetValMetCysAlaSerSerProGluLyslieGlulieLeuAla225230235240ProProAsnGlySerValProGlyAspArglieThrPheAspAlaPhe245250255ProGlyGluProAspLysGluLeuAsnProLysLysLyslieTrpGlu260265270GlnlieGlnProAspLeuHisThrAsnAspGluCysValAlaThrTyr275280285LysGlyValProPheGluValLysGlyLysGlyValCysArgAlaGln290295300ThrMetSerAsnSerGlylieLys305310<210>2<211>288<212>PRT<213>p43_l蛋白<400>2MetAlaAsnAsnAspAlaValLeuLysArgLeuGluGlnLysGlyAla151015GluAlaAspGlnlielieGluTyrLeuLysGlnGlnValSerLeuLeu202530LysGluLysAlalieLeuGlnAlaThrLeuArgGluGluLysLysLeu354045ArgValGluAsnAlaLysLeuLysLysGlulieGluGluLeuLysGln505560GluLeulieGlnAlaGlulieGlnAsnGlyValLysGlnlieAlaPhe65707580ProSerGlyThrProLeuHisAlaAsnSerMetValSerGluAsnVal859095lieGlnSerThrAlaValThrThrValSerSerGlyThrLysGluGln100105110lieLysGlyGlyThrGlyAspGluLysLysAlaLysGluLyslieGlu115120125LysLysGlyGluLysLysGluLysLysGlnGlnSerlieAlaGlySer130135140AlaAspSerLysProlieAspValSerArgLeuAspLeuArglieGly145150155160CyslielieThrAlaArgLysHisProAspAlaAspSerLeuTyrVal165170175GluGluValAspValGlyGlulieAlaProArgThrValValSerGly180185190LeuValAsnHisValProLeuGluGlnMetGlnAsnArgMetVallie195200205LeuLeuCysAsnLeuLysProAlaLysMetArgGlyValLeuSerGln210215220AlaMetValMetCysAlaSerSerProGluLyslieGlulieLeuAla225230235240ProProAsnGlySerValProGlyAspArglieThrPheAspAlaPhe245250255ProGlyGluProAspLysGluLeuAsnProLysLysLyslieTrpGlu260265270GlnlieGlnProAspLeuHisThrAsnAspGluCysValAlaThrTyr275280285<210>3<211>285<212>PRT<213>p43_2蛋白<400>3MetAlaAsnAsnAspAlaValLeuLysArgLeuGluGlnLysGlyAla151015GluAlaAspGlnlielieGluTyrLeuLysGlnGlnValSerLeuLeu202530LysGluLysAlalieLeuGlnAlaThrLeuArgGluGluLysLysLeu354045ArgValGluAsnAlaLysLeuLysLysGlulieGluGluLeuLysGln505560GluLeulieGlnAlaGlulieGlnAsnGlyValLysGlnlieAlaPhe65707580ProSerGlyThrProLeuHisAlaAsnSerMetValSerGluAsnVal859095lieGlnSerThrAlaValThrThrValSerSerGlyThrLysGluGln100105110lieLysGlyGlyThrGlyAspGluLysLysAlaLysGluLyslieGlu115120125LysLysGlyGluLysLysGluLysLysGlnGlnSerlieAlaGlySer130135140AlaAspSerLysProlieAspValSerArgLeuAspLeuArglieGly145150155160CyslielieThrAlaArgLysHisProAspAlaAspSerLeuTyrVal165170175GluGluValAspValGlyGlulieAlaProArgThrValValSerGly180185190LeuValAsnHisValProLeuGluGlnMetGlnAsnArgMetVallie195200205LeuLeuCysAsnLeuLysProAlaLysMetArgGlyValLeuSerGln210215220AlaMetValMetCysAlaSerSerProGluLyslieGlulieLeuAla225230235240ProProAsnGlySerValProGlyAspArglieThrPheAspAlaPhe245250255ProGlyGluProAspLysGluLeuAsnProLysLysLyslieTrpGlu260265270GlnlieGlnProAspLeuHisThrAsnAspGluCysVal275280285<210>4<211>278<212>PRT<213>p43_3蛋白<400>4MetAlaAsnAsnAspAlaValLeuLysArgLeuGluGlnLysGlyAla151015GluAlaAspGlnlielieGluTyrLeuLysGlnGlnValSerLeuLeu202530LysGluLysAlalieLeuGlnAlaThrLeuArgGluGluLysLysLeu354045ArgValGluAsnAlaLysLeuLysLysGlulieGluGluLeuLysGln505560GluLeulieGlnAlaGlulieGlnAsnGlyValLysGlnlieAlaPhe65707580ProSerGlyThrProLeuHisAlaAsnSerMetValSerGluAsnVal859095lieGlnSerThrAlaValThrThrValSerSerGlyThrLysGluGln100105110lieLysGlyGlyThrGlyAspGluLysLysAlaLysGluLyslieGlu115120125LysLysGlyGluLysLysGluLysLysGlnGlnSerlieAlaGlySer130135140AlaAspSerLysProlieAspValSerArgLeuAspLeuArglieGly145150155160CyslielieThrAlaArgLysHisProAspAlaAspSerLeuTyrVal165170175GluGluValAspValGlyGlulieAlaProArgThrValValSerGly180185190LeuValAsnHisValProLeuGluGlnMetGlnAsnArgMetVallie195200205LeuLeuCysAsnLeuLysProAlaLysMetArgGlyValLeuSerGln210215220AlaMetValMetCysAlaSerSerProGluLyslieGlulieLeuAla225230235240ProProAsnGlySerValProGlyAspArglieThrPheAspAlaPhe245250255ProGlyGluProAspLysGluLeuAsnProLysLysLyslieTrpGlu260265270GlnlieGlnProAspLeu275<210>5<211>268<212>PRT<213>p43_4蛋白<400>5MetAlaAsnAsnAspAlaValLeuLysArgLeuGluGlnLysGlyAla151015GluAlaAspGlnlielieGluTyrLeuLysGlnGlnValSerLeuLeu202530LysGluLysAlalieLeuGlnAlaThrLeuArgGluGluLysLysLeu354045ArgValGluAsnAlaLysLeuLysLysGlulieGluGluLeuLysGln505560GluLeulieGlnAlaGlulieGlnAsnGlyValLysGlnlieAlaPhe65707580ProSerGlyThrProLeuHisAlaAsnSerMetValSerGluAsnVal859095lieGlnSerThrAlaValThrThrValSerSerGlyThrLysGluGln100105110lieLysGlyGlyThrGlyAspGluLysLysAlaLysGluLyslieGlu115120125LysLysGlyGluLysLysGluLysLysGlnGlnSerlieAlaGlySer130135140AlaAspSerLysProlieAspValSerArgLeuAspLeuArglieGly145150155160CyslielieThrAlaArgLysHisProAspAlaAspSerLeuTyrVal165170175GluGluValAspValGlyGlulieAlaProArgThrValValSerGly180185190LeuValAsnHisValProLeuGluGlnMetGlnAsnArgMetVallie195200205LeuLeuCysAsnLeuLysProAlaLysMetArgGlyValLeuSerGln210215220AlaMetValMetCysAlaSerSerProGluLyslieGlulieLeuAla225230235240ProProAsnGlySerValProGlyAspArglieThrPheAspAlaPhe245250255ProGlyGluProAspLysGluLeuAsnProLysLys260265<210>6<211>264<212>PRT<213>p43_5蛋白<400>6MetAlaAsnAsnAspAlaValLeuLysArgLeuGluGlnLysGlyAla151015GluAlaAspGlnlielieGluTyrLeuLysGlnGlnValSerLeuLeu202530LysGluLysAlalieLeuGlnAlaThrLeuArgGluGluLysLysLeu354045ArgValGluAsnAlaLysLeuLysLysGlulieGluGluLeuLysGln505560GluLeulieGlnAlaGlulieGlnAsnGlyValLysGlnlieAlaPhe65707580ProSerGlyThrProLeuHisAlaAsnSerMetValSerGluAsnVal859095lieGlnSerThrAlaValThrThrValSerSerGlyThrLysGluGln100105110lieLysGlyGlyThrGlyAspGluLysLysAlaLysGluLyslieGlu115120125LysLysGlyGluLysLysGluLysLysGlnGlnSerlieAlaGlySer130135140AlaAspSerLysProlieAspValSerArgLeuAspLeuArglieGly145150155160CyslielieThrAlaArgLysHisProAspAlaAspSerLeuTyrVal165170175GluGluValAspValGlyGlulieAlaProArgThrValValSerGly180185190LeuValAsnHisValProLeuGluGlnMetGlnAsnArgMetVallie195200205LeuLeuCysAsnLeuLysProAlaLysMetArgGlyValLeuSerGln210215220AlaMetValMetCysAlaSerSerProGluLyslieGlulieLeuAla225230235240ProProAsnGlySerValProGlyAspArglieThrPheAspAlaPhe245250255ProGlyGluProAspLysGluLeu260<210>7<211>864<212>DNA<213>p43-l核苷酸序列<400>7atggcaaataatgatgctgttctgaagagactggagcagaagggtgcagaggcagatcaa60atcattgaatatcttaagcagcaagtttctctacttaaggagaaagcaattttgcaggca120actttgagggaagagaagaaacttcgagttgaaaatgctaaactgaagaaagaaattgaa180gaactgaaacaagagctaattcaggcagaaattcaaaatggagtgaagcaaatagcattt240ccatctggtactccactgcacgctaattctatggtttctgaaaatgtgatacagtctaca300gcagtaacaaccgtatcttctggtaccaaagaacagataaaaggaggaacaggagacgaa360aagaaagcgaaagagaaaattgaaaagaaaggagagaagaaggagaaaaaacagcaatca420atagctggaagtgccgactctaagccaatagatgtttcccgtctggatcttcgaattggt480tgcatcataactgctagaaaacaccctgatgcagattctttgtatgtggaagaagtagat540gtcggagaaatagccccaaggacagttgtcagtggcctggtgaatcatgttcctcttgaa600cagatgcaaaatcggatggtgattttactttgtaacctgaaacctgcaaagatgagggga660gtattatctcaagcaatggtcatgtgtgctagttcaecagagaaaattgaaatcttggct720cctccaaatgggtctgttcctggagacagaattacttttgatgctttcccaggagagcct780gacaaggagctgaatcctaagaagaagatttgggagcagatccagcctgatcttcacact840aatgatgagtgtgtggctacatac864<210>8<211>855<212>DNA<213>p43-2核苷酸序列<400>8atggcaaataatgatgctgttctgaagagactggagcagaagggtgcagaggcagatcaa60atcattgaatatcttaagcagcaagtttctctacttaaggagaaagcaattttgcaggca120actttgagggaagagaagaaacttcgagttgaaaatgetaaactgaagaaagaaattgaa180gaactgaaacaagagctaattcaggcagaaattcaaaatggagtgaagcaaatagcattt240ccatctggtactccactgcacgctaattctatggtttctgaaaatgtgatacagtctaca300gcagtaacaacegtatcttctggtaccaaagaacagataaaaggaggaacaggagacgaa360aagaaagcgaaagagaaaattgaaaagaaaggagagaagaaggagaaaaaacagcaatca420atagctggaagtgccgactctaagccaatagatgtttcccgtctggatcttcgaattggt480tgcatcataactgctagaaaaeacectgatgcagattctttgtatgtggaagaagtagat540gtcggagaaatagceceaaggacagttgtcagtggcctggtgaatcatgttcctcttgaa600cagatgcaaaatcggatggtgattttactttgtaacctgaaacctgcaaagatgagggga660gtattatctcaageaatggtcatgtgtgctagttcaecagagaaaattgaaatcttggct720cetecaaatgggtctgttcctggagaeagaattacttttgatgctttcccaggagagcct780gacaaggagctgaatcctaagaagaagatttgggagcagatccagcctgatcttcacact840aatgatgagtgtgtg855<210>9<211>834<212>DNA<213>p43-3核苷酸序列<400>9atggcaaataatgatgctgttctgaagagactggagcagaagggtgcagaggcagatcaa60atcattgaatatcttaagcagcaagtttctctacttaaggagaaagcaattttgcaggca120actttgagggaagagaagaaacttcgagttgaaaatgctaaactgaagaaagaaattgaa180gaactgaaacaagagctaattcaggcagaaattcaaaatggagtgaagcaaatagcattt240ccatctggtactccactgcacgctaattctatggtttctgaaaatgtgatacagtctaca300gcagtaacaaccgtatcttctggtaccaaagaacagataaaaggaggaacaggagacgaa360aagaaagcgaaagagaaaattgaaaagaaaggagagaagaaggagaaaaaacagcaatca420atagctggaagtgccgactctaagccaatagatgtttcccgtctggatcttcgaattggt480tgcatcataactgctagaaaacaccctgatgcagattctttgtatgtggaagaagtagat540gtcggagaaatagccccaaggacagttgtcagtggcctggtgaatcatgttcctcttgaa600cagatgcaaaatcggatggtgattttactttgtaacctgaaacctgcaaagatgagggga660gtattatctcaagcaatggtcatgtgtgctagttcaccagagaaaattgaaatcttggct720cctccaaatgggtctgttcctggagacagaattacttttgatgctttcccaggagagcct780gacaaggagctgaatcctaagaagaagatttgggagcagatccagcctgatctt834<210>10<211>804<212>DNA<213>p43-4核苷酸序列<400>10atggcaaataatgatgctgttctgaagagactggagcagaagggtgcagaggcagatcaa60atcattgaatatcttaagcagcaagtttctctacttaaggagaaagcaattttgcaggca120actttgagggaagagaagaaacttcgagttgaaaatgctaaactgaagaaagaaattgaa180gaactgaaacaagagctaattcaggcagaaattcaaaatggagtgaagcaaatagcattt240ccatctggtactccactgcacgctaattctatggtttctgaaaatgtgatacagtctaca300gcagtaacaaccgtatcttctggtaccaaagaacagataaaaggaggaacaggagacgaa360aagaaagcgaaagagaaaattgaaaagaaaggagagaagaaggagaaaaaacagcaatca420atagctggaagtgccgactctaagccaatagatgtttcccgtctggatcttcgaattggt480tgcatcataactgctagaaaacaccctgatgcagattctttgtatgtggaagaagtagat540gtcggagaaatagccccaaggacagttgtcagtggcctggtgaatcatgttcctcttgaa600cagatgcaaaatcggatggtgattttactttgtaacctgaaacctgcaaagatgagggga660gtattatctcaagcaatggtcatgtgtgctagttcaccagagaaaattgaaatcttggct720cctccaaatgggtctgttcctggagacagaattacttttgatgctttcccaggagagcct780gacaaggagctgaatcctaagaag804<210>11<211>792<212>DNA<213>p43-5核苷酸序列〈400〉11atggcaaataatgatgctgttctgaagagactggagcagaagggtgcagaggcagatcaa60atcattgaatatcttaagcagcaagtttctctacttaaggagaaagcaattttgcaggca120actttgagggaagagaagaaacttcgagttgaaaatgctaaactgaagaaagaaattgaa180gaactgaaacaagagctaattcaggcagaaattcaaaatggagtgaagcaaatagcattt240ceatctggtactccactgcacgctaattctatggtttctgaaaatgtgatacagtctaca300gcagtaacaaccgtatcttctggtaccaaagaacagataaaaggaggaacaggagacgaa360aagaaagcgaaagagaaaattgaaaagaaaggagagaagaaggagaaaaaacagcaatca420atagctggaagtgccgactctaagccaatagatgtttcccgtctggatcttcgaattggt480tgcatcataactgctagaaaacaccctgatgcagattctttgtatgtggaagaagtagat540gtcggagaaatagccccaaggacagttgtcagtggcctggtgaatcatgttcctcttgaa600cagatgcaaaatcggatggtgattttactttgtaacctgaaacctgcaaagatgagggga660gtattatctcaagcaatggtcatgtgtgctagttcaccagagaaaattgaaatcttggct720cctccaaatgggtctgttcctggagacagaattacttttgatgctttcccaggagagcct780gacaaggagctg79权利要求一种缺失型p43蛋白，它包括SEQIDNO1所示氨基酸序列中缺失第250-312位氨基酸所得到的蛋白。2.如权利要求1所述的缺失型p43蛋白，其特征在于所述缺失型p43蛋白包括SEQIDNO1所示氨基酸序列中缺失第265-312位氨基酸所得到的蛋白。3.如权利要求1所述的缺失型p43蛋白，其特征在于所述缺失型p43蛋白包括SEQIDNO1所示氨基酸序列中缺失第265-289位氨基酸所得到的蛋白。4.如权利要求1所述的缺失型p43蛋白，其特征在于所述缺失型p43蛋白包括下列所示的蛋白(1)SEQIDNO2序列(2)SEQIDNO3序列(3)SEQIDNO4序列(4)SEQIDNO5序列(5)SEQIDNO:6序列。5.如权利要求1所述的缺失型p43蛋白，其特征在于所述缺失型p43蛋白与BSA、PEG和/或人血白蛋白的等分子偶联，形成多肽偶联物。6.如权利要求5所述的缺失型p43蛋白，其特征在于所述的偶联物由多肽、交联剂和BSA构成，其中所述的交联剂戊二醛或EDAC。7.一种抗肿瘤的药物组合物，它包含(a)安全有效量的权利要求1所述的缺失型P43蛋白、偶联物或其组合；以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。8.权利要求1所述的缺失型p43蛋白在制备治疗肿瘤药物中的用途。9.编码权利要求1所述的缺失型p43蛋白的核苷酸序列。全文摘要本发明涉及缺失型重组人p43蛋白及其在肿瘤治疗药物中的应用。通过构建缺失型p43蛋白，能确定特异性抑制新生血管生成的结构域从而减少副作用，此外缺失型p43蛋白的分子量更小，从而易于吸收、具有更高的疗效。文档编号C12N15/12GK101824083SQ20091004714公开日2010年9月8日申请日期2009年3月6日优先权日2009年3月6日发明者刑玉华,刘刚,刘大涛,吴光昊,姚钰舜,王嬿,王慧敏,王渊琦,胡立德,谭小钉,邹亮,黄相红申请人:信谊药厂