专利名称：一种检测ape1基因多态性的检测方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因检测方法及试剂盒，特别涉及一种检测脱嘌呤脱嘧 啶核酸内切酶(APE 1 )基因多态性的检测方法及试剂盒。
背景技术：
美国国立环境卫生科学研究所在人类基因组计划(HGP)顺利进展后于 1997年底启动了"环境反应基因及其对人类健康的影响"的研究项目，即环境 基因组计划(EGP)，旨在阐明基因和环境对疾病的影响和它们之间的相互 作用。该计划列举了 11大类共76种再测序的环境应答基因，DNA修复基因 被列为第一位，其中21种DNA修复酶基因被列为重点研究对象。人类基因 与其它物种的基因的功能均是编码和保护遗传信息的完整性。DNA修复酶始 终监视染色体并校正癌基因和细胞毒性的化学物所致的核苷酸残基的破坏， 若没有DNA修复，那么由多种多样的DNA损伤因素所引起的染色体不稳定 性将是细胞和生物体致命的问题。
DNA在损伤因素的作用下,主要产生碱基损伤和DNA链的断裂。碱基损 伤包括:单碱基加合物、碱基改变和碱基缺失。链的损伤主要有DNA二聚体、 单链断裂和双链断裂。DNA损伤最主要的结果是突变和细胞死亡。虽然肿瘤 发生的具体机制尚不清楚，但DNA的损伤和基因结构异常，以及由此造成 的所谓癌基因和抑癌基因表达或功能上的改变却是细胞恶性转化的前提。细 胞可通过将损伤的DNA切除，合成一段新的DNA来修复损伤的DNA。
自然界的生物有多种多样，每种生物的个体之间存在许多差异，即为多 态性。由遗传造成的变异，导致一系列的多态性称为遗传多态性。相同条件 下接触环境有害因素的人群有不同程度的损伤，如果不及时修复，使损伤积 累至一定程度就可导致疾病。所以损伤修复，特别是DNA损伤修复具有重 要意义。而个体DNA修复能力与其DNA修复基因有密切关系，研究表明人 群DNA修复基因有不同的多态性，可表现为不同的遗传性状，人群对环境 有害因素有不同的易感性，因而机体DNA修复能力是除代谢酶基因多态外， 影响机体易感性的另 一 个重要因素。
APE1是碱基切除修复途径的限速酶，可修复细胞内大量存在的无碱基位点，同时具有氧化还原功能，可调节多种转录因子的DNA结合活性。APE1
基因外显子区域存在多个多态位点，其中部分多态位点影响酶构象或酶活性，
其中Leul04Arg、 Glul26Asp、 Arg237Ala多态位点的突变纯合型比野生纯合 型的核酸内切酶活性降低40-60%，本发明检测的APE1 11e64Val(rs2307486)
基因多态性可由于等位基因的不同而具有不同酶活性的三种基因型，分别为 AA、 AG、 GG 。
APE1基因序列请参见美国国家医学图书馆下属的国家生物技术信息中 心开发的PubMed数据库(网址http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/) ， GENE ID: 328, MIM: 107748， SNP位点chrl4: 19,994,044 )。
目前检测基因多态性的方法有以下几种。聚合酶链式反应-单链构象多态 性(SSCP)利用长度的单链DNA因其顺序不同或单个碱基差异，所形成的 构象不同，在凝胶中泳动速度不一样，从而分别不同的基因型，但是目前该 技术仍不成熟，在所有报道中，SSCP分析所用的各种条件各不相同，且存 在较大分歧，特别是在电泳温度及甘油使用方面；同时，对进口的电泳装置 和同位素或银染标记的依赖，限制其普遍应用。另外，由于多态位点的检测 是通过单链构象差异来观察的，需要测序来证实目的片断的多态性。基因芯 片法集成了大量的密集排列的大量已知的序列探针，通过与被标记的若干靶 核酸序列互补匹配，与芯片特定位点上的探针杂交，利用基因芯片杂交图象， 根据碱基互补匹配的原理确定靶基因的序列，但是其费用高昂，不能广泛地 应用。PCR产物直接测序方法虽能够把扩增的产物地序列完整的表示出来， 但是由于受测序技术本身的限制，测序反应对环境的干扰比较敏感，PCR产 物测序受外界的干扰很大，很容易造成测序失败，而且在检测本发明的点突 变不是十分可靠，可能会把突变模板的信号压低作为背景信号而导致突变点 检测错误。而本发明使用的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性 (PCR-RFLP)技术在所使用的反应条件上一致，重复性好，操作简便，快速， 终点判断准确，可直接确定突变的部位和性质，而且费用较低，因此本检测 方法及试剂盒可节约大量的样本、经费和时间，并得到广泛的应用。
发明内容
本发明目的的第一方面在于提出一种APE1 11e64Val基因多态性的检测方法。
一种APE1 11e64Val基因多态性的检测方法，该检测方法包括以—卜—步骤 a)以待检测人基因组DNA为模板，进行特异性PCR扩增；b)使用限制性内切酶对所述歩骤a)中的PCR扩增产物进行酶切； C)进行琼脂糖凝胶电泳，确定基因多态性； -所述步骤a)中使用碱基序列如下的正向引物和反向引物进行特异性PCR 扩增；所述步骤b)中使用限制性内切酶5gin进行酶切； 正向引物碱基序列 5'-GCCAAGAAGAGTAAGACGG-3'
反向引物碱基序列
5'-GTGACTAAACCCTAAGACCAT-3'。
步骤a)中所述的PCR扩增为在15^x1反应体系下，9fC预变性5min后， 进行30个如下循环扩增94"C变性40s， 53T退火20s， 72'C延伸25s，最后 72。C延伸5min。
所述的15^1反应体系包括1UTaqDNA聚合酶，10xBuffer 1.5^1， 25mmol/L MgCl2 l|il， 2.5mmol/L dNTPs 1.25^1， 50ng所述待检测人基因组 DNA， lOpmol/L正反向引物各0.5|il，由灭菌超纯水补足15^1。
步骤b)在20^1 SglII酶切体系中进行，所述的20nl5glII酶切体系包括 lOpl所述步骤a)中的PCR扩增产物，lOU/pl的BgIII限制性内切酶1^1， 10x 缓冲液2^1和7^1灭菌超纯水。
本发明检测方法属于聚合酶链反应一限制性片段长度多态性(poymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)检观!l技术， 重复性好，操作简便，快速，终点判断准确，可直接确定突变的部位和性质， 而且费用较低，能节约大量的样本、经费和时间。特别适用于一些小样本已 知突变位点的检测。本检测方法在实际应用中具有很大的灵活性，具有较好 的应用前景，使价格昂贵不宜丌展的项目能够实现，并且能够节约大量的样 本、经费和时间，对相关研究产生良好的促进作用。
本发明目的的第二方面在于提出一种检测APE1 11e64Val基因多态性的试 剂盒。
种检测APE1 11e64Val基因多态性的试剂盒，其特征在于，该试剂盒
包括
碱基序列如下的正向引物和反向引物； dNTPs;
DNA聚合酶及其常规10x缓冲液； 限制性内切酶5gl11和相应的缓冲液； iK向引物碱基序列 5'-GCCAAGAAGAGTAAGACGG画3'反向引物碱基序列
5'-GTGACTAAACCCTAAGACCAT-3'。
该试剂盒中单份试剂包括
10[imol/L正反向引物各0.5^d; lUTaq DNA聚合酶； Buffer 1.5jil; 25mmol/L MgCl2 2.5mmol/L dNTPs 1.25^1; 10单位SglII酶； 2pL的酶切缓冲液。
图1是APE1基因含64A〉G位点PCR产物酶切后电泳图。
具体实施例方式
下面结合附图和实施例进一步说明本发明的技术方案。 一种APE1 11e64Val基因多态性的检测方法，该检测方法包括以下步骤 a)以待检测人基因组DNA为模板，在APE1基因位点所在区域设计基因 序列正、反向引物，正向引物碱基序列如下所示；反向引物碱基序列如下所 示，用这对引物对待检测人基因组DNA进行特异性PCR扩增；PCR扩增后 产物序列为chrl4:19，993，921-19，994，162;
正向引物碱基序列
5'-GCCAAGAAGAGTAAGACGG-3'
反向引物碱基序列
5'-GTGACTAAACCCTAAGACCAT-3';
^利用限制性内切酶3^///对步骤a)中的PCR扩增产物进行酶切； c)根据琼脂糖凝胶电泳对上述APE1基因进行片段大小分离，确定其基 因多态性；
本发明中进行上述检测使用如下试剂盒，本试剂盒包括扩增用的基因特 异性引物、dNTPs、用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液，用于RFLP 的限制性内切酶i^/i/和相应的缓冲液。具体包括
lOpmol/L正反向引物各0.5^1;
UJ T叫DNA'聚合酶； Buffer 1.5^1; 25mmol/L MgCl2 2.5mmol/L dNTPs 1.25^1;
io单位万gin酶；
2pL的lOx酶切缓冲液。 实施例1
随机选择试验对象，并抽取血样，提取血淋巴细胞基因组DNA为待检 测人基因组DNA，根据APEUle64Val多态位点(rs2307486)的碱基替代情 况设计正、反向引物。
正向引物碱基序列5'-GCCAAGAAGAGTAAGACGG-3';反向引物碱基 序列5'-GTGACTAAACCCTAAGACCAT層3'。
用这对引物对待检测人基因组DNA进行特异性PCR扩增；具体的PCR 扩增步骤如下
对待检测人基因组DNA，用上述的正、反引物按照如下反应体系和条件 进行PCR扩增15pl反应体系包括lUTaqDNA聚合酶，10xBuffer 1.5^1 (10mmol/LTris-HCl，ph=8.3) ， 25mmol/L MgCl2 l|il， 2.5mmol/L dNTPs 1.25(il， 50ng待检测人基因组DNA， 10pmol/L上下游引物各0.5^1，由灭菌 超纯水补足15pl。 94。C预变性5min后，进行30个如下循环扩增94"C变性 40s， 53。C退火20s， 72。C延伸25s，最后72。C延伸5min。
PCR扩增产物在2(^l&m酶切体系对进行酶切，其中所述的2(^1~111 酶切体系包括10^1的PCR扩增产物，10U/pl的^III限制性内切酶1^1， 10x缓冲液2pl和7[il灭菌超纯水。
取PCR扩增产物10pL，加入10单位Bg/i7酶和2(aL的酶切缓冲液(美国 New England BioLabs公司提供)，组成20(iL反应体系，37。C水浴过夜消化后 在2X琼脂糖凝胶电泳30mm，于紫外灯下拍照鉴定。APE1 11e64Val多态片 段经BgIII酶切后可出现120bp、 122bp和242bp三个片段，但由于120bp与 122bp片段大小太近，故只能看到1个片段。其中野生纯合型(AA)为120bp 和122bp两个片段(两个等位基因均有酶切位点位于chrl4:19，994，042与 chrl4:19,994,043之间，酶切序列AGATCT)，但由于片段大小太近，故只 能看到120bp左右一个片段；突变纯合型(GG)为242bp—个片段(两个等 位基因均无酶切位点)；杂合型(AG)为242bp、 120bp和122bp三个片段( 个，位基肉无酶切位点，另-一个等位基因有酶切位点位于chrl4:19，994,()42 与chr 14:19,994,043之间，酶切序列AGATCT)，但只能看到242bp和12()bp左右的2个片段。参见图1，图1中，M:50bp DNA marker; Lane 1 ， 2， 3， 5， 7and8:AA; Lane 4: GG; Lane 6: AG。
用现有技术进行验证，本实施例的实验结果完全正确。 本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明 本发明，而并非用作为对本发明的限定，只要在本发明的实质精神范围内， 对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明的权利要求书范围内。
权利要求
1、一种APE1 Ile64Val基因多态性的检测方法，该检测方法包括以下步骤a)以待检测人基因组DNA为模板，进行特异性PCR扩增；b)使用限制性内切酶对所述步骤a)中的PCR扩增产物进行酶切；c)进行琼脂糖凝胶电泳，确定基因多态性；其特征在于所述步骤a)中使用碱基序列如下的正向引物和反向引物进行特异性PCR扩增；所述步骤b)中使用限制性内切酶BgIII进行酶切；正向引物碱基序列5′-GCCAAGAAGAGTAAGACGG-3′反向引物碱基序列5′-GTGACTAAACCCTAAGACCAT-3′。
2、 根据权利要求1所述的APE1 11e64Val基因多态性的检测方法，其特 征在于，步骤a)中所述的PCR扩增为在15pl反应体系下，94r预变性5min 后，进行30个如下循环扩增94。C变性40s， 53。C退火20s， 72。C延伸25s， 最后72。C延伸5min。
3、 根据权利要求2所述的APE1 11e64Val基因多态性的检测方法，其特 征在于，所述的15jj1反应体系包括1UT叫dna聚合酶，10xBuffer 1.5^1， 25mmo/LMgCl2 lpl， 2,5mmol/L dNTPs.25pl， 50ng所述待检测人基因组 DNA， lOpmol/L正反向引物各0.5^1，由灭菌超纯水补足15pl。
4、 根据权利要求1所述的APE1 11e64Val基因多态性的检测方法，其特 征在于所述步骤b)在20^1 5glII酶切体系中进行，所述的2(^1 Sgffl酶切体 系包括lOpl所述步骤a)中的PCR扩增产物，10U—1的^III限制性内切酶 ljil， 10x缓冲液2^1和7|il灭菌超纯水。
5、 一种检测APE1 11e64Val基因多态性的试剂盒，其特征在于，该试剂 盒包括碱基序列如下的正向引物和反向引物； dNTPs;DNA聚合酶及其10x缓冲液；限制性内切酶和相应的缓冲液； 正向引物碱基序列5'画GCCAAGAAGAGTAAGACGG陽3'反向引物碱基序列5'-GTGACTAAACCCTAAGACCAT-3'。
6、根据权利要求5所述的检测APE1 11e64Val基因多态性的试剂盒，其 特征在于，该试剂盒中反应所需单份试剂包括10fimol/L正反向引物各0.5p； IUT叫DNA聚合酶； 10x缓冲液1.5^1; 25誦ol/L MgCl2 2.5mmol/L dNTPs 1.25(il;io单位sgni酶；2pL的10x酶切缓冲液。
全文摘要
本发明涉及一种基因检测方法及试剂盒，特别涉及一种检测脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶(APE1)基因多态性的检测方法及试剂盒。该检测方法使用碱基序列如下的正向引物和反向引物进行特异性PCR扩增；使用限制性内切酶BgIII进行酶切；正向引物碱基序列5′-GCCAAGAAGAGTAAGACGG-3′；反向引物碱基序列5′-GTGACTAAACCCTAAGACCAT-3′。该试剂盒包括正向引物和反向引物；限制性内切酶BgIII。本发明的检测方法重复性好，操作简便，快速，终点判断准确，可直接确定突变的部位和性质，而且费用较低，能节约大量的样本、经费和时间。
文档编号C12Q1/68GK101538609SQ20091004700
公开日2009年9月23日 申请日期2009年3月4日 优先权日2009年3月4日
发明者仇玉兰, 夏昭林, 姚丽芳, 张晓蓉, 朱洪坤, 蔚 李, 威 王, 王海婷, 缪文彬, 伟 蒋, 相 陈 申请人:中华人民共和国上海出入境检验检疫局