一种调控植物衰老进程中叶绿素降解的关键基因及其应用的制作方法

专利名称：一种调控植物衰老进程中叶绿素降解的关键基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种参与叶绿素降解调控的关键新基因CRNl及其应用。本发明还提供了一种创建滞绿植物品系的方法，以及一种筛选/鉴定 滞绿植物品系的分子辅助育种方法。
背景技术：
植物叶片进入衰老程序后，由于叶绿素的快速降解所导致的黄化现象，是几乎 所有植物绿色器官衰老的共同、也是最显著的表观特征。虽然叶片衰老可以被许多环境 因子和发育因子诱导，但是叶片衰老开始的时间以及过程都是被细胞凋亡过程所调控。 在过去数十年中，学者们在许多作物上发现了叶片绿期延迟至成熟或衰老之后，即滞绿 (stay-green)或非黄化(non-yellowing)突变体。根据Thomas, H 和 Howarth, C. J. (J. Exp. Bot.，51 :329，2000)的分类，滞绿突变体 可以分为五种基本类型。A型滞绿突变体的衰老启动推迟，但是衰老的速率不变；B型滞绿 突变体衰老启动正常，但是叶片黄化和光合速率下降减缓。由于这两类滞绿突变体的光合 期被延长，因而被称之为“功能型”滞绿。C型滞绿突变体中叶绿素降解功能由于遗传变异 导致的异常，叶绿素含量可以长期维持不变；但是，就生理功能退化而言，与野生型无异。因 此该类突变体被称之为“非功能型”滞绿，或“表观”滞绿。D型滞绿突变体是由于速冻或骤 干所引起的叶片死亡所致。最后一种为E型突变体，在该种突变体内积聚过量的叶绿素，使 得叶片呈深绿色，但光合效率维持不变。D型、E型与C型一样，也为“非功能型”滞绿。叶绿素降解代谢途径上的三个关键酶基因中(叶绿素酶基因，脱镁叶绿酸氧化酶 基因，RCC基因)，只有脱镁叶绿酸氧化酶基因显示出了一定的调控衰老叶片中叶绿素降 解的潜力，但是该基因的突变和被过度抑制会引起有毒中间产物的积累，进而导致叶片上 出现类似于创伤引起的坏死斑点(H0rtensteiner，S.Annu. Rev. Plant Biol. 57 =55-77, 2006)。迄今为止，研究得最广泛、最深入的滞绿突变体是草地羊毛(Festuca pratensis) 滞绿突变体及其衍生遗传材料(Thomas, H.，Planta, 137 :53，1977 ；Thomas, H.，Planta, 154 -.212,1982 ；Thomas, H.，Theor. Appl. Genet.，73 :551，1987 ；Thomas, H. &Matile, P.， Phytochemistry,27 :342，1988)。该突变体是一种自然发生的变异体，受核内单隐形位点 (sid)的调控；属于非功能型突变。与野生型相比，在衰老叶片中有明显的脱植醇叶绿素 酸酯、羟基叶绿素酸酯和脱镁叶绿酸的积累；而且，叶绿素捕光结合蛋白(light harvest chlorophyll-binding protein)的稳定性也显著地增加。但是，可溶性蛋白，特别是1， 5_ 二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)大亚基的降解速率没有差异。在大豆中，滞绿性状受到三个核基因(G和dld2)和一个胞质基因(cytG)的控制 (Guiamet, J. J.，et al.，Plant Cell Physiol. ,31 :1123，1990)。一个显性基因 G 使种皮 维持绿色。一个胞质基因，cytG和两个隐性基因，dldld2d2*G_dldld2d2调控叶片、果 荚、种皮和胚中的绿色色素。据报道，cytG的突变可使得衰老叶片中的叶绿素b比叶绿素a更加稳定，因而抑制了叶绿素的降解。dldld2d2纯合突变可使衰老叶片中叶绿素和可溶 性 Rubisco 蛋白的降解显著延迟(Guiamet, J. J. et al.，Plant Physiol. ,96 :227，1991 ； Guiamet, J. J. etal. , Physiol. Plant. ,96 :655,1996)在干菜豆(Phaseolus vulgaris)的滞绿突变体中，也报道了衰老叶片中叶绿素滞 留的现象(Backmann，A. et al. Biochem. Bioph. Res. Co. 203 1362-1362，1994)。但是，在突 变体中既没有发现叶绿素酶活性的改变，也没有检测到脱镁叶绿酸的积累。然而，相比于野 生型，突变体中的叶绿素酸酯a和b的确有积累，表明脱镁螯合酶活性可能存在缺陷(Fang， Ζ.，et al. J. Exp. Bot 49 :503_510，1998)。在水稻上，也筛选到了受单隐形核基因调控的滞绿突变体sgr (t)，并被定位在9 号染色体长臂上的 RFLP 标记 RG662 和 C985 之间(Cha et al.，TAG. 104 :526_532，2002)。最新研究表明，sid，水稻sgr(t)，番茄(gf)以及辣椒(cl)等均编码拟南芥 AtNYEl直系同源基因，其在豌豆中的同源基因控制着子叶黄/绿性状(Armstead et al. New Phytol. ,172,592-597. 2006, Armstead et al Science, 315, 73. 2007 ；Park et al. Plant Cell,19,1649-1664. 2007 ；Ren et al. Plant Physiol. ,144,1429-1441. 2007 ；Barry et al.Plant Physiol. 147 :179_187)。

发明内容
本发明的目的是获得调控叶绿素降解代谢的关键调控基因。本发明的另一个目的是获得一种创建植物滞绿性状的方法。本发明的内容之一是从拟南芥中克隆了叶绿素降解代谢的关键调控基因AtCRNl ； 内容之二是利用CRNl基因，可以但不仅限于运用RNAi等基因工程手段，创建植物滞绿性 状。本发明提供了一种调控植物叶绿素降解代谢的关键基因AtCRNl，其中该基因的氨 基酸编码序列特征如Seq ID No 2所示。本发明还提供了一种调控植物叶绿素降解代谢的关键基因AtCRNl，其中该基因的 核苷酸编码序列特征如Seq ID No 1所示。本发明的AtCRNl基因可以根据Seq ID No 1通过人工合成方法获得其核苷酸编 码序列。另一方面，本发明提供了滞绿植物的一种制备方法，即通过化学或物理因子诱变 目标植株中AtCRNl基因发生突变，破坏或降低AtCRNl基因的表达。本发明的制备方法中，所述的化学因子可以是EMS(甲基磺酸乙酯)等。本发明的制备方法中，所述的物理因子可以是快中子等辐射诱变因子。本发明的制备方法中，可以将AtCRNl基因或基因片断导入T-DNA载体，用T-DNA 载体转化目标植物，抑制AtCRNl基因的表达。可以通过农杆菌介导T-DNA插入AtCRNl以 破坏或降低AtCRNl基因的表达。本发明的制备方法中，所述的目标植株可以为绿叶菜类植物、饲草或草坪类植物。本发明的制备方法中，所述的T-DNA载体可以为siRNA或者miRNA载体等反义RNA 载体。本发明的制备方法中，用于抑制AtCRNl基因表达的重组载体含有35S、actinl,ubiquitinl或者衰老增强启动子等，以便更好更强的产生滞绿性状。在本发明中，术语“AtCRNl基因 核苷酸编码序列”指编码AtCRNl基因的核苷酸序 列，如SEQ ID NO. 1中1-1452位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO. 1序列的编码框1-1452位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密 码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO. 1中1-1452位核苷 酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出SEQ ID NO. 2所述的序列。该术语还包括 能在中度严紧条件下，更佳地在高度严紧条件下与SEQ ID NO. 1中从核苷酸1-1452位的核 苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO. 1中从核苷酸1-1452位同源性 至少70 %，较佳地至少80 %，更佳地至少90 %的核苷酸序列。在本发明中，“AtCRNl蛋白”指氨基酸编码序列如SEQ ID N0. 2的多肽。该术语还 包括具有与该蛋白相同功能的、SEQ ID N0. 2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并 不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基 酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以 内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相 似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加 一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸通常也不 会改变蛋白质的功能。该术语还包括该蛋白的活性片段和活性衍生物。本发明的AtCRNl基因可以根据其核苷酸编码序列通过人工合成方法获得。也可 以用分子克隆的常规手段，按照AtCRm基因序列设计引物，从植物基因组中克隆得到。本发明对已有滞绿性状相关文献结果中选出的827个在各种衰老条件下都表达 的基因进行了 GO 分类，然后利用 expression angler 程序(Toufigh et al Plant J. 43， 153-1632005)分析获得了若干与NYEl表达谱最为相似的基因(见附图1)。接着，本发明 从拟南芥生物资源中心(ABRCwww. arabidopsis. orR/abrc/)订购了这些基因的T-DNA插入 突变体，播种于l/2MS+30mg/L Kan的平板上，对出现明显滞绿效应得小苗的基因组DNA进 行PCR分析，结果表明，该T-DNA插入在目的基因At5gl3800位置的第3个外显子上，是纯 合的插入突变体。进一步半定量PCR分析证明，纯合突变体中全长基因没有表达(见附图 6)，我们将该基因命名为 CRNlko-negulated with NYE1, SEQ ID No. 1)，突变体 crnl-1。验证实验结果表明，crnl-Ι中叶绿素的降解速率较nyel-1更为缓慢(见附图 2-4，7)，显示CRNl在创造植物滞绿品系上具有更大的应用前景。本发明提出的一种利用调控叶绿素降解代谢的关键基因AtCRNl创建植物滞绿的 方法，通过各种诱变/插入突变方法突变AtCRNl或同源度40 %以上AtCRNl的同源基因，获 得滞绿突变体，抑制AtCRNl基因的表达，获得植物滞绿性状。本发明提出的一种利用调控叶绿素降解代谢的关键基因AtCRNl创建植物滞绿方 法，将AtCRNl基因或基因片断导入T-DNA载体，用T-DNA载体转化野生型植株，获得植物滞 绿性状。本发明中，插入突变为T-DNA插入。T-DNA载体为RNAi载体，通过形成双链RNA抑 制目的基因表达。 RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指双链RNA特异性地诱发与其序列 同源的mRNA分子被降解，从而抑制相应基因的表达的现象(Fire et al. Nature 391 806-811. 1998)，是一种特殊的转录后基因表达沉默(post transcriptional gene silence, PTGS)现象。本发明构建了 AtCRNl的RNAi表达载体。方法是用带XbaI和SmaI酶切位点的引物(SEQ ID No. 3和4)扩增正义链，PCR产物连接用同样酶切处理pPZPY122质粒载体。通 过类似的过程继续连入反义链(使用带SacI的SEQ IDNo. 5和带有SalI酶切位点的带XbaI 和SmaI酶切位点6为引物)和loop区段。最后得到插入了 sense =Ioop :antisense结构 片断的RNAi表达载体pPZPYAtCRNl。该质粒载体通过电转化导入农杆菌LBA4404，在含有 氯霉素，利福平，链霉素的YEB培养基上挑单克隆，并用PCR鉴定阳性克隆。对Tl代转基因 植株进行PCR检测，DNA (southern blots)分析和滞绿性分析，以及对T2代进行抗性分离 和滞绿特性分析，结果表明运用RNAi技术抑制AtCRNl基因的表达能够创建滞绿性状。利用RNAi技术抑制CRNl基因的表达创建绿叶菜和牧草类植物的滞绿性状。利用上述RNAi载体，构建旨在抑制青菜体内BnCRNl或黑麦草体内LpCRNl表达的 载体，通过农杆菌LBA4404介导，转化青菜花蕊或黑麦草胚性愈伤组织，在含有选择压力的 培养基上筛选可能的转化体，获得可能的转化植株。对Tl代植株进行PCR检测和目的基因 表达分析，以量化内源CRNl基因被抑制的水平。在CRNl基因被显著抑制的植株中，衰老叶 片表现典型的滞绿性状，没有观察到不利的表型特征。检测植物基因组中是否含有全长AtCRm基因，还可以作为一种筛选/鉴定滞绿植 物品系的分子辅助育种方法。本发明获得了一个叶绿素降解代谢的关键调控基因AtCRNl，通过抑制该基因的表 达可以创建植物滞绿品系。该基因的变异和被抑制，除了导致衰老叶片滞绿以外，不引起任 何可见的不利形态变异。滞绿性状可以延长绿叶蔬菜的货价寿命和饲料作物的采后绿期， 进而增加其主要营养成分叶绿素和蛋白质的含量；滞绿性状也可以显著地改善草坪植物的 绿期和景观效果。


图1是67个衰老诱导响应的、叶绿体定位的蛋白的基因表达模式图。其 中，框内为与NYEl表达模式最为接近的几个基因At3g44880 (ACDl)，At2g25625， At4g22920(ATNYEl)，At5gl3800, At5g39520。图2是在黑暗诱导4天后的crnl-Ι突变体叶片。其中，Col-O叶片已经基本全部 呈黄色，crnl-Ι叶片则基本为绿色，nyel-Ι叶片略微发黄。图3是自然衰老的叶片表型照片。其中Col-O叶片与crnl-Ι叶片相比，发黄的速 度和面积明显增加。图4是整株自然衰老表型图。其中，crnl-Ι的植株为绿色，而Col-O的叶片至少
有半数已呈黄色。图5是crnl-Ι突变体的鉴定图。图示T-DNA插入在CRm基因的第三个外显子中。图6是crnl-Ι中CRNl全长基因表达的半定量PCR分析结果图。使用模板DNA为 黑暗处理3天后叶片中RNA的反转录产物，PCR反应循环数为29。可见，crnl-Ι没有CRNl 全长基因。图7是黑暗处理过程中crnl-Ι叶片中叶绿素降解的柱形图。与Col-O和nyel-1相比，crnl-1的叶绿素含量下降幅度明显减少。图8. AtCRNl与大豆GmCRNl部分氨基酸序列的比较。相同氨基酸在中间栏标出， “ + ”代表生化性状相近的氨基酸(下同)。图9. AtCRNl与水稻OsCRNl部分氨基酸序列的比较。图10. AtCRNl与玉米ZmCRNl部分氨基酸序列的比较。图11. AtCRNl与青菜BnCRNl部分氨基酸序列的比较。图12.基于ClustalW方法的物种间多序列的比较图。黑色背景表示完全一致的 残基，灰色背景表示部分一致的残基图。
具体实施方式

实施例1 =AtNYEl共表达基因筛选Buchanan-Wollaston ^ (Buchanan-ffollaston et al. Plant J. 42,567-585, 2005)比较了各种衰老条件下拟南芥全基因组基因表达的水平，我们对文献结果中选出的 827个在各种衰老条件下都表达的基因进行了 GO分类，结果表明这些基因中有67个编码叶 绿体定位蛋白，NYE1，Pa等叶绿素降解相关基因也在其中。利用expression angler程序 (Toufigh et al Plant J. 43，153-1632005)分析这67个基因，获得了若干与NYEl表达谱 最为相似的基因(见附图1)。 实施例2 =T-DNA插入突变体分析和CRNl的鉴定我们从拟南芥生物资源中心(ABRC www, arabidopsis. orR/abrc/)订购了这些基 因的T-DNA插入突变体，播种于l/2MS+30mg/L Kan的平板上，10天后移出具有抗性的小苗 到土壤中，当植株的第6片莲座叶完全展开时，取第3-4片叶片进行黑暗处理，结果发现有 一株(突变体编号SALK_000095)呈现明显的滞绿性状(见附图2_4)。对基因组DNA进行 PCR分析的结果表明，该T-DNA插入在目的基因At5gl3800位置的第3个外显子上，是纯合 的插入突变体(见附图5)。半定量PCR分析表明，SALK_000095纯合突变体中全长基因没有 表达(见附图6)，我们将该基因命名为CRNl (co regulated with NYE1, SEQ ID No. 1)， 突变体crnl-1。CTAB法小管抽取植物基因组DNA (1)单株收取拟南芥叶片1-2片置于1. 5ml Eppendorf管中，液氮保存，将2%的 CTAB溶液在65 °C的水浴锅中预热；(2)用液氮预冷的研磨棒充分研磨植物材料，加入预热的CTAB溶液600ul，混勻；(3)65°C水浴20_30min，中间轻摇数次；(4) 13，OOOrpm,离心 lOmin，转移上清到新的 Eppendorf 管中；(5)加等体积酚氯仿异戊醇，约500ul，混勻；(6) 13，OOOrpm,离心 lOmin，转移上清到新的 Eppendorf 管中；(7)加2/3体积的异丙醇，约400ul，颠倒混勻，静置IOmin ；(8) 13，OOOrpm，离心 lOmin，弃上清；(9)约400ul的70 %乙醇洗涤沉淀1-2次；(10) 55°C下干燥 5min,加 50 μ 1ΤΕ，1 μ 1 RNA 酶溶解沉淀；(11)-20°C下保存 DNA 样品，
[CTAB 缓冲液CTAB(2% )，Tris.Cl pH8. 0 (lOOmmol/L), EDTA pH8. O (20mmol/L), NaCl(1. 4mol/L)]T-DNA突变体鉴定所用引物LP :CTACCAATCCTGGACTCCTCC (见 SEQ ID NO 7)RP :TGTACAGGTTATCGGTGAGCC (见 SEQ ID NO 8)LBbl :ATTTTGCCGATTTCGGAAC (见 SEQ ID NO 9)
半定量PCR引物ACT2-S CGCTCTTTCTTTCCAAGCTC (见 SEQ ID NO 10)ACT2-A AACAGCCCTGGGAGCATC (见 SEQ ID NO 11)CRNl-FL-S ATGGAGATAATCTCACTGAACG (见 SEQ ID NO 12)CRN I-FL-A CTATGCAGACTTCCCTCCAAAC (见 SEQ ID NO 13)PCR反应体系(50 μ 1体系)H2O40. 3 μ 110 X PCR 缓冲液5· O μ 1IOXdNTP(ImM)Ι.ΟμΙDNA 模板Ι.ΟμΙLP (20 μ Μ)0· 5 μ 1RP (20 μ Μ)0. 5μ 1LBbl (20um)0. 5 μ 1Taq 酶0. 2 μ 1PCR反应条件Step194 °C 5minSt 印 294 °C 45secSt 印 355 °C 45sec
Step472°C 90secSt印2 4 循环30次St印5延伸 72 °C 5min注退火温度依据引物特性做相应调整(st印3，一般为引物Tm_5°C )和延伸时间 (step4，一般为 lmin/kb)实施例3 插入突变体表型分析和叶绿素含量测定当植株的第6片莲座叶完全展开时，取第3-4片叶片进行黑暗处理；叶片置于垫有 2层湿润滤纸的培养皿中处理不同天数后取样，进行总叶绿素含量测定。结果表明，crnl-1 中叶绿素的降解速率较nyel-1更为缓慢(见附图7)，显示CRNl在创造植物滞绿品系上具 有更大的应用前景。叶绿素测定0. Ig新鲜叶片，加液氮研磨后，用3ml丙酮萃取。黑暗条件下静置，防止叶绿素分 解。待叶绿素完全萃取溶入丙酮后，用分光光度计测定A645，A663值，并通过下列公式计算 它们的含量Chl a(mg. ml_l) = 0. 0127A663-0. 00269A645
Chl b (mg. ml_l) = 0. 0229A663-0. 00468A645实施例4 =CRNl基因的生物信息学分析
CRNl属于esterase/lipase超家族成员，我们猜测可能具有叶绿素酶类似的功 言旨。运用 Chlorop (http //www, cbs. dtu. dk/services/ChloroP/)禾口 PPDB (http //ppdb. tc. cornell.edu/)分析表明，CRNl N末端的46个残基为叶绿体定位信号肽(cTP)。Blast 分析发现同CRNl基因在拟南芥中与其同源性较高的是NP_195371 (At4g36530)，其部分序 列一致性仅为29% (95/324)，以及NP_568381 (At5gl9850)，其部分序列一致性仅为25% (80/318)。因此认为，CRm在拟南芥中为单拷贝基因。CRm在其他物种中普遍存在同源性 较高的基因，可能是CRNl的直系同源基因。tBLASTn结果表明CRm在水稻、玉米、大豆和青 菜等重要农作物中均含有高保守性同源基因。AtCRNl与大豆GmCRNl部分氨基酸具有60% (270/448)的同源性，与水稻OsCRNl部分氨基酸有59% (269/449)同源性，与玉米ZmCRNl 部分氨基酸有66% (259/392)同源性，与青菜BnCRNl部分氨基酸序列有75% (183/243) 同源性(图8-11)。实施例5利用RNAi技术抑制CRNl基因的表达创建有滞绿性状的植株构建AtCRNl的RNAi表达载体。方法是用带XbaI和SmaI酶切位点的引物(SEQ ID No. 3和4)扩增正义链，产物回收后用XbaI和SmaI双酶切，再回收酶切产物；用同样酶 切处理PPZPY122质粒载体。将产物酶切回收片断与载体酶切回收片断通过T4DNA连接酶 连接，然后用自带引物测序，筛选鉴定正确的克隆。以此载体作为二次克隆的载体，通过类 似的过程继续连入反义链(SEQ ID No. 5和6)和loop区段(图12中的intron)。最后得 到插入了 sense: loop:antisense结构片断的RNAi表达载体pPZPYAtCRNl。该质粒载体通 过电转化导入农杆菌LBA4404，在含有氯霉素，利福平，链霉素的YEB培养基上挑单克隆，并 用PCR鉴定阳性克隆。用蘸花法侵染拟南芥Col-O野生型。收获的种子在含90mg/L庆大 霉素的培养基上筛选，抗性苗移至土壤。对Tl代转基因植株进行PCR检测，DNA(southern blots)分析和滞绿性分析，以及对T2代进行抗性分离和滞绿特性分析，结果表明运用RNAi 技术抑制AtCRNl基因的表达能够创建滞绿性状。实施例6利用RNAi技术抑制CRNl基因的表达创建绿叶菜和牧草类植物的滞绿性 状。利用上述RNAi载体，构建旨在抑制青菜体内BnCRNl或黑麦草体内LpCRNl表达的 载体，通过农杆菌LBA4404介导，转化青菜花蕊或黑麦草胚性愈伤组织，在含有选择压力的 培养基上筛选可能的转化体，获得可能的转化植株。对Tl代植株进行PCR检测和目的基因 表达分析，以量化内源CRNl基因被抑制的水平。在CRNl基因被显著抑制的植株中，衰老叶 片表现典型的滞绿性状，没有观察到不利的表型特征。序列表<210>1<211>1455<212>DNA<213> 拟南芥<220><221>CDS
<222>(1). . (1455)<223>
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一种调控植物叶绿素降解代谢的关键基因AtCRN1，其中该基因的氨基酸编码序列特征为Seq ID No2。
2.一种调控植物叶绿素降解代谢的关键基因AtCRNl，其中该基因的核苷酸编码序列 特征为 SeqID No :1。
3.如权利要求1所述基因的制备方法，其特征是根据SeqID No :1通过人工合成方法 获得其核苷酸编码序列。
4.一种制备滞绿植物的方法，其特征是通过化学或物理因子诱变目标植株中AtCRNl 基因发生突变，破坏或降低AtCRNl基因的表达。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征是，所述的化学因子是EMS。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征是，所述的物理因子是快中子。
7.如权利要求4所述的制备方法，其特征是将AtCRNl基因或基因片断导入T-DNA载 体，用T-DNA载体转化目标植物，抑制AtCRNl基因的表达。
8.如权利要求4所述的制备方法，其特征是，所述的目标植株为绿叶菜类植物、饲草或 草坪类植物。
9.如权利要求7所述的制备方法，其特征是，所述的T-DNA载体为siRNA或者miRNA载体。
10.如权利要求7所述的制备方法，其特征是，用于抑制AtCRNl基因表达的重组载体含 有35S、actinl、ubiquitinl或者衰老增强启动子。
全文摘要
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种参与叶绿素降解调控的关键新基因及其应用。滞绿性状可以延长绿叶蔬菜的货价寿命和饲料作物的采后绿期，进而增加其主要营养成分叶绿素和蛋白质的含量；滞绿性状也可以显著地改善草坪植物的绿期和景观效果。本发明提供了一种调控植物叶绿素降解代谢的关键基因AtCRN1，该基因的氨基酸编码序列特征为SEQ ID No2。本发明还提供了一种创建滞绿植物品系的方法，即通过化学或物理因子诱变目标植株中AtCRN1基因发生突变，破坏或降低AtCRN1基因的表达。此外，检测植物基因组中是否含有全长AtCRN1基因，还可以作为一种筛选/鉴定滞绿植物品系的分子辅助育种方法。
文档编号C12N15/55GK101831450SQ20091004748
公开日2010年9月15日 申请日期2009年3月12日 优先权日2009年3月12日
发明者任国栋, 梁宁菁, 蒯本科, 魏强 申请人:复旦大学