专利名称：磁性纳米颗粒固定化沙雷氏菌脂肪酶、制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物化工领域，涉及沙雷氏菌脂肪酶的固定化，以及固定化脂肪酶在医 药前体生产中的应用。
背景技术：
地尔硫卓(Diltiazem)是上世纪70年代发现并合成的苯并噻平类钙离子通道阻滞剂， 它作用于冠脉血管及末梢血管的血管平滑肌及房室结，对钙通道有阻滞作用，能抑制钙 离子向细胞内流入，降低血管平滑肌细胞内游离钙离子的浓度而使血管平滑肌松弛；并 能有效地扩张小动脉血管，增加冠脉血流量，降低冠状静脉氧差，有降低心率和血压作 用。可用于室上性心律失常，典型心绞痛，变异型心绞痛，老年性高血压等病症的治疗。 由于该药疗效确切，毒副作用小，是心血管疾病治疗的重要药物。
对甲氧苯基縮水甘油酸甲酯，简称MPGM，其左旋异构体[(2i ，35)-(-)-MPGM]是心 血管药物地尔硫卓合成的重要中间体，目前有不少单位在进行(-)-MPGM的制备开发。 粘质沙雷氏菌脂肪酶是催化(士)-MPGM水解拆分，制备光学纯(-)-MPGM的优良生物催 化剂。由于游离脂肪酶的稳定性相对较低，难以重复使用，而且酶液中的复杂组分给产 品的纯化处理带来较多麻烦，因此有必要对脂肪酶进行固定化。
日本的田边公司[/. 1994， 78: 59-63]使用中空纤维膜对沙雷氏菌脂
肪酶进行截留固定化，并使用固定化了脂肪酶的中空纤维膜反应器进行(士)-MPGM的水 解拆分。固定化脂肪酶可以重复使用5批次，当上载的酶失活时，可以将其洗脱之后上 载新酶。尽管如此，由于膜传质阻力的存在，导致反应速率慢，第一轮反应需要23h才 能达到反应终点。在先前研究中，我们发现环氧树脂(如EupergitC)和硅藻土是比较好的 沙雷氏菌脂肪酶固定化载体[催化学报，2007， 28: 175-179]，固定化脂肪酶可以重复使 用5 10批。尽管如此，使用环氧树脂共价偶联法进行酶的固定化，载体价格比较昂贵， 固定化酶成本高；而使用硅藻土吸附法进行固定化，虽然固定化方法非常简单，酶上载
4容量也较大，但是固定化酶的稳定性仍不够高，反应和分离操作也不太方便，这些问题 限制了这两种固定化方法的工业化应用。
磁性Fe304纳米颗粒作为一种较新的酶固定化载体，具有以下一些优势1)颗粒粒 径一般在100nm以内，因此其比表面积很大，单位质量载体的蛋白结合率相对较高；2) 酶分子结合到载体的表面，因此固定化酶反应时的传质阻力较小；3)由于磁性材料的 超顺磁性，固定化酶能借助磁体方便地从反应介质体系中分离出来。由于磁性Fe304纳 米颗粒在酶固定化方面良好的应用前景，国内外对其进行了不少探索和应用研究。例如， Horst等(E"" viwe3f/cw6. 7fecA "， 2006， 38， 1005-1012)将磁性Fe3O4纳米颗粒用戊二醛修 饰后，直接固定过氧化氢酶，所获得的固定化酶较游离酶相比，在相同的底物浓度下最 大反应速率提高了6倍。Qiu等0/./4/i!pA /^/j7nerSci， 2005， 95， 328-335)在磁性Fe304纳米 颗粒外层包裹了一层苯乙烯-马来酸酐聚合物，并利用外层聚合物暴露的酸酐键将(x-淀 粉酶共价结合到载体表面，所得到的固定化酶活力回收率为47.2%。 Huang等(5totecAiw/. iV叫,2003， 19， 1095-1 IOO)利用碳酰二亚胺为偶联剂，将来源于褶皱假丝酵母的脂肪酶 固定到磁性Fe304纳米颗粒上，所获得的固定化酶较游离酶相比，酶活提高了1.41倍，稳 定性提高了近31倍。
在本发明中，本发明人使用氨基化处理的磁性Fe304纳米颗粒作为固定化载体，选 择戊二醛作为交联剂，对专利报道的菌株粘质沙雷氏菌脂肪酶(ZL200410067046.1)进行 偶联固定化，载体材料价格低廉，酶的上载容量以及酶活回收率高。使用该磁性纳米颗 粒固定化脂肪酶催化(土)-MPGM的水解拆分，反应速率快，对映选择性好，产品光学纯 度高，固定化酶可以多次重复使用，应用成本低。
发明内容
本发明目的是提供一种磁性纳米颗粒固定化脂肪酶，进一步说是一种磁性纳米颗粒 固定化沙雷氏菌脂肪酶。
本发明的目的还提供一种上述磁性纳米颗粒固定化脂肪酶的制备方法。
本发明的另外一目的是提供一种上述磁性纳米颗粒固定化脂肪酶的用途，尤其是用 于催化(土)-MPGM的水解拆分，制备光学纯的(2i ， 35)-(-)-MPGM,作为心血管药物地尔 硫卓合成的手性中间体。
5本发明的磁性纳米颗粒固定化沙雷氏菌脂肪酶是由氨基化的磁性纳米颗粒作为固 定化载体，用戊二醛作为交联剂，使沙雷氏菌脂肪酶共价结合到固定化载体上获得的磁 性纳米颗粒固定化沙雷氏菌脂肪酶，该固定化酶的活力为500~ 10000U/g。
本发明的磁性纳米颗粒固定化沙雷氏菌脂肪酶能悬浮于水溶液中形成稳定的均一 悬浊液，但在外加磁场作用下能快速、完全沉降。
本发明的上述磁性纳米颗粒固定化脂肪酶的制备方法为将醛基化修饰的磁性Fe304 颗粒加入到粘质沙雷氏菌脂肪酶的培养液或粗酶液中(酶浓度10~60 U/ml)， 0~40°C反 应2 24小时，磁力倾析，用pH 7~9的缓冲液洗涤，备用。所述的醛基化的磁性Fe304 颗粒与沙雷氏菌发酵粗酶液的重量与体积比为1: 20 1: 1000。
固定化脂肪酶活力的测定方法为称取一定质量的固定化沙雷氏菌脂肪酶，置于1 ml磷酸钾缓冲液(100 mM, pH 7.0)中，充分振荡悬浮，30°C预热3 min后，加入30 100 mM的对硝基苯酚丁酸酯(溶于二甲基亚砜)，振荡反应3min后，用磁铁吸附使磁粉固 定化酶沉降，上清液适当稀释后，测定405 nm下的吸光度，以不加酶的样品作为空白 对照。酶活力单位的定义为在上述条件下，每分钟催化1.0nmol对硝基苯酚丁酸酯水 解所需的酶量定义为一个活力单位(U)。
醛基化磁性Fe304颗粒的制备方法如下
1、酶固定化材料的制备
1) 将FeCl3.6H20与FeS04'7H20按一定的摩尔比(1:0.5 ~ l:2)混合溶解于水中，在高 速搅拌条件下加入NaOH溶液，使反应体系pH控制在7~11 ， 30~60°C反应10~60 min 后磁力倾析，用热水和酒精洗涤得到的磁性Fe304颗粒。
2) 将磁性Fe304颗粒分散于酒精/水(v/v = 1:1 ~4:1)体系中，其浓度为0.1~5% w/v， 加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷，使其与磁性Fe304的摩尔比为1:1 4:1;在20 60。C反 应6~24小时。反应结束后用热水和酒精洗涤，得到氨基化磁性Fe304颗粒。
3) 将氨基化Fe304纳米颗粒分散于pH为6.0~9.0的缓冲液中，加入戊二醛进行醛 基化修饰，氨基化载体的量为5~10 g/L，戊二醛浓度为0.in/。 5。/。w/v，在20 50。C反 应时间为2 24小时，反应完毕后，用缓冲液洗涤得到的醛基化磁性Fe304颗粒。所述 的氨基化磁性Fe304颗粒与戊二醛的重量比为1: 1 1: 10。
本发明的固定化脂肪酶可以用于催化拆分手性酯消旋对甲氧苯基縮水甘油酸甲酯(土)-MPGM。
催化拆分方法反应在水-有机两相体系中进行，有机相可以使用甲苯、异丙醚、甲 基叔丁基醚等溶剂，有机相占反应体系总体积的5~95%，有机相中底物(土)-MPGM的 浓度为0.05 1.5mol/L;固定化沙雷氏菌脂肪酶的用量为1000~10，000U/L;反应温度为 20~40°C，优选为30。C;反应pH为7.0-9.0，优选为8.0-8.5。每批反应剩余底物的对映 体过量值(ee)髙于99%时终止，回收固定化沙雷氏菌脂肪酶，水洗后投入下一批反应使 用。
每批反应完毕后，反应液静置分层，取上清有机相，用一定浓度的亚硫酸氢钠溶液 洗涤，随后干燥、浓縮、精制即可获得光学纯的地尔硫卓手性中间体(2及，35)-(-)-MPGM。
采用本发明所公开的固定化沙雷氏菌脂肪酶催化拆分制备(-)-MPGM，固定化酶易 于制备，反应条件温和，具有很好的工业应用开发前景。
图1磁性纳米颗粒固定化脂肪酶重复批次水解拆分(土)-MPGM的示意图。 具体的实施方式
通过下述实施例可以进一步理解本发明，但不能限制本发明的内容。
实施例l氨基化磁性Fe304纳米颗粒的制备
将5.07 g FeCl3'6H20和3.48 g FeS04'7H20溶解于100 ml水中，高速搅拌下滴加5 mol/L的NaOH溶液，使反应体系pH控制在7~11， 50。C反应60分钟后，用磁铁吸附 生成的Fe304颗粒，依次用热水和酒精洗涤得到的磁性Fe304颗粒。将获得的磁性Fe304 颗粒加到150ml50o/。的乙醇水溶液中，加入15g3-氨基丙基三乙氧基硅烷，50°C搅拌 反应10小时后用磁铁吸附收集生成的氨基化Fe304颗粒，并依次用热水和酒精洗涤。 获得的载体颗粒的平均粒径约为50nm。
实施例2磁性Fe304纳米颗粒固定化粘质沙雷氏菌脂肪酶 取0.1 g氨基化磁性Fe304纳米颗粒分散于10 ml pH为8.0的Tris-HCl缓冲液中，
7加入戊二醛至终浓度为1% (w/v)， 3(TC反应12小时。用缓冲液洗涤磁性Fe304纳米颗 粒，去除未结合到载体表面的戊二醛分子，得到表面醛基化修饰的磁性Fe304纳米颗粒。 将醛基修饰后的磁性Fe304纳米颗粒加入到浓縮的粘质沙雷氏菌发酵粗酶液(活力为50 U/ml)中，4。C搅拌5小时。磁力倾析后用缓冲溶液洗涤，去除未结合到载体上的酶蛋白 分子，固定化酶的活力为4055 U/g。得到的固定化酶保存于pH 8.5的Tris-HCl缓冲溶 液中备用。
实施例3磁性纳米颗粒固定化沙雷氏菌脂肪酶重复批式拆分(土)-MPGM
将20 mg磁粉固定化沙雷氏菌脂肪酶分散于25 ml pH为8.5的Tris-HCl缓冲溶液中， 加入等体积含有5.2 g (土)-MPGM的甲苯溶液。在30°C和180 rpm的恒温摇床上振荡反 应，间歇取样分析有机相中MPGM的"值，待ees大于99。/。后终止反应。反应液静置 分层，使用磁铁吸附回收水相中的固定化酶，用pH 8.5的Tris-HCl缓冲溶液洗涤后直 接用于下一批次的反应；有机相用亚硫酸氢钠溶液洗漆后，旋转蒸发除去溶剂，即可获 得光学纯的(-)-MPGM粗品。磁粉固定化沙雷氏菌脂肪酶拥有良好的操作稳定性，如图 l所示，重复使用ll个批次，共计105h后，固定化酶仍保持了60%以上的活力。
8
权利要求
1、一种磁性纳米颗粒固定化沙雷氏菌脂肪酶，酶的活力为500～10000U/g，其特征是所述的磁性纳米颗粒固定化沙雷氏菌脂肪酶由氨基化的磁性纳米颗粒作为固定化载体，用戊二醛作为交联剂，使沙雷氏菌脂肪酶共价结合到固定化载体上；该固定化酶的活力为500～10000U/g。
2、 一种如权利要求1所述的磁性纳米颗粒固定化沙雷氏菌脂肪酶的制备方法，其特征 是采用下述步骤1) 将氨基化磁性Fe304颗粒分散于pH为6.0-9.0的缓冲液中，加入戊二醛交联剂 进行醛基化修饰，氨基化磁性Fe304颗粒的量为1~10 g/L，戊二醛浓度为0.1%~5% w/v， 在20~ 50°(:搅拌反应2~24小时，得到醛基化的磁性Fe304颗粒；所述的氨基化磁性 Fe304颗粒与上述的戊二醛的质量比为1: 1 1: 10;2) 将l)的醛基化的磁性Fe304颗粒与沙雷氏菌发酵粗酶液混合，在0~40°(:，进行 共价固定化2~24 h;所述的醛基化的磁性Fe304颗粒与沙雷氏菌发酵粗酶液的重量与 体积比为1: 20 1: 1000。
3、 如权利要求2所述的方法，其特征是所述的氨基化磁性Fe304纳米颗粒由下述步骤 制备1) 将FeCly6H20与FeSCV7H20按1: 0.5 1: 2的摩尔比混合溶解于水中，总浓 度为5 50g/L，在高速搅拌下加入1 10 M的NaOH溶液，使反应体系pH控制在 7~11，在30 60。C反应10 60分钟，生成磁性Fe304颗粒；2) 将l)的磁性Fe304颗粒分散于体积比为1:1 ~ 4:1的酒精/水体系中，加入3-氨 基丙基三乙氧基硅烷，使其与Fe304的摩尔比为1:1 ~ 4:1，在20~60°C搅拌反应6~24 小时，得到氨基化磁性Fe304颗粒。
4、 一种如权利要求l所述的磁性纳米颗粒固定化沙雷氏菌脂肪酶的用途，其特征是用于制备光学纯的地尔硫卓手性中间体(2及，35)-(-)-对甲氧苯基縮水甘油酸甲酯。
5、 如权利要求4所述的用途，其特征是所述的制备是消旋对甲氧苯基縮水甘油酸甲酯 和如权利要求l所述的磁性纳米颗粒固定化沙雷氏菌脂肪酶在20^4(fC反应l ~24 h， 所述的反应在含有消旋对甲氧苯基縮水甘油酸甲酯的浓度为0.05~1.5111011的有机溶剂和含有磁性纳米颗粒固定化沙雷氏菌脂肪酶的pH为7.0 9.0的水溶液的两相体系中 进行，磁性纳米颗粒固定化沙雷氏菌脂肪酶的用量为1000 10，000U/L;有机相体积占 反应体系总体积的5~95%。
全文摘要
本发明公开了一种磁性纳米颗粒固定化粘质沙雷氏菌脂肪酶、脂肪酶的固定化方法以及在拆分地尔硫卓手性前体消旋对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯[(±)-MPGM]中的应用。本发明使用氨基化的磁性纳米颗粒作为沙雷氏菌脂肪酶的固定化载体，用戊二醛作为交联剂，使沙雷氏菌脂肪酶共价结合到固定化载体上。将固定化沙雷氏菌脂肪酶应用到(±)-MPGM的酶促水解拆分反应中，固定化酶可以重复使用多次，显示了良好的操作稳定性和实际应用可行性。
文档编号C12N11/00GK101503683SQ20091004751
公开日2009年8月12日 申请日期2009年3月13日 优先权日2009年3月13日
发明者江 潘, 彬 胡, 许建和 申请人:华东理工大学