专利名称：一种黑芥子硫酸苷酶的提取方法
技术领域：
本发明属于农业技术领域，涉及植物体内酶的分离纯化方法。
背景技术：
黑芥子硫苷酸酶，俗称黑芥子硫苷酸酶(myrosinase，EC3. 2. 3. 1)，广泛存在于自 然界。目前在分属15个科500多种双子叶植物中均鉴定到黑芥子硫苷酸酶存在，其中，十 字花科作物中黑芥子硫苷酸酶含量较高。目前，黑芥子硫苷酸酶大多数都是从十字花科蔬菜中提取，其提取方法不仅步骤 繁琐，而且得率相对较低。Jwarmy等从萝卜根中提出了 2种黑芥子硫苷酸酶。他们将新鲜根 IOOg (干重6g)剪碎，5°C下加蒸馏水研磨，组织勻浆用粗棉布过滤，然后4°C离心(13000r/ min)，取上清液在4°C用水透析2d，得到酶粗提液。透析液用(MM)2SO4 <盐析，达到100% 饱和度，收集沉淀离心15min。沉淀部分用水溶解，过DAAE-纤维素柱，用含0. 1 0. 5mol/ L的磷酸缓冲液(pH7，10mmol/L)梯度洗脱。收集有活性的酶，再过S印hadex G-200柱，用 柠檬酸纳-磷酸缓冲液(pH6，10mmol/L)洗脱，得到了 2种黑芥子硫苷酸酶，分别为0. 8和 0. 6mg。该技术方案存在工艺复杂和难以大规模生产的技术缺陷。中国专利CN101173266，名称为“固定化黑芥子硫苷酸酶及其制备方法”，该发明涉 及固定化黑芥子硫苷酸酶及其制备方法。采用十字花科蔬菜种子，特别是西兰花种子，在提 取黑芥子硫苷酸酶过程中添加甘油、EDTA、DTT保护酶活性；在4°C低温下操作，完成去杂质 获得酶初提液；在固定化步骤中添加海藻酸钠，在不影响酶活性的温度下溶解混合，滴入氯 化钙溶液制成海藻酸钙小颗粒，用戊二醛溶液处理颗粒，将游离的黑芥子硫苷酸酶固定化。 该技术方案主要作为黑芥子硫苷酸酶活性的保护方法，对黑芥子硫苷酸酶的分离纯化方法 未做详细研究和说明。
发明内容
为改变现有以十字花科植物为原料提取分离黑芥子硫苷酸酶技术的现状，针对 现有的黑芥子硫苷酸酶提取分离技术缺陷，本发明提供了一种以辣根(拉丁文Armoracia rusticana G. M. Sch.)为原料提取黑芥子硫苷酸酶的方法。该方法不仅能简化繁琐的提取 步骤，而且能够分离得到活性和纯度较高的黑芥子硫苷酸酶。本发明解决该技术问题所采用的的技术方案是①辣根的清洗、切片、预冷将新鲜辣根，如春栽至第二年十月采收的新鲜辣根的肉质根，洗净后冷风吹干，切 成小片，例如厚度1 2mm，放入超低温冰箱冷冻处理，例如温度范围-65°C _70°C。②勻浆、收集滤液按辣根切片重量加入1. 5-2. 5倍重量比的pH为5 7干净去离子水；较佳的，可 按辣根切片重量加入2倍重量比的pH为5 7干净去离子水，迅速(2min以内)打菜，用 压榨机压汁，采用3-5层医用纱布过滤；较佳的，采用4层医用纱布过滤，收集滤液；使用定性分析滤纸(中速)经过真空抽滤，收集滤液。(真空度的范围是-0. 1 -0. OlMpa ；较佳 是-0. OlMpa)③静置、沉淀、上清液离心在3 5°C条件下静置，较佳的，可在4°C条件下静置，取上清液进行冷冻离心，弃 去沉淀。上清液放在3 5°C条件下冷藏待进行分离纯化；较佳的，放在4°C条件下冷藏待 进行分离纯化。④丙酮沉淀、离心、纯化取一定体积的上述清液，在3 5°C (4°C较佳)、均勻搅拌的条件下，按体积比 V(清液)V(丙酮)=1 1.5 2.5，加入经过预冷(-201放置较佳，可行范围-301 至-10°C )的丙酮进行沉淀，沉淀完成后汁液进行离心，收集沉淀；沉淀再用少量，例如5 IOml丙酮悬浮洗涤脱水，再离心，收集沉淀。⑤冷冻干燥、保存收集的沉淀经低温冷冻，真空干燥至恒重，密封保存。由于采用了上述技术方案，本发明取得的有益效果是本发明提供的以辣根为原料提取黑芥子硫苷酸酶的整套提取方法，其原料来源 丰富，提取方法简单，更适合于工业化生产。黑芥子硫苷酸酶能催化硫代葡萄糖苷水解生 成一系列具有生物活性的水解产物-异硫氢酸酯(isothiocyanates)，异硫氢酸酯为不 稳定的中间物配基，此配基重排主要形成萝卜硫素(SF)。十字花科蔬菜中富含多种芥子 苷(glucosinolates简称GLs)。硫代葡萄糖苷(一种芥子苷)经黑芥子硫酸苷酶酶解 (myrosinase)或酸水解后，产生萝卜硫素(sulforaphen，简称SF)，它是活性很强的抗癌成 分。由于近年来，癌症的发病率有逐渐上升的趋势，萝卜硫素具有较强的抗癌作用，而且是 植物活性物质，故备受关注，具有广阔的研究价值及市场前景。
图1为黑芥子硫酸苷酶提取工艺流程图。
具体实施例方式下面将详细说明本发明技术的技术内容1、辣根提取黑芥子硫苷酸酶主要取自于辣根的肉质根，辣根为深根性植物所以必 须将新鲜采收的辣根彻底清洗干净，可采用自来水清洗；辣根肉质根比较坚实，在准备步骤 过程中，需要利用切片机进行切片；切片后机械伤口的产生，使酶和底物发生接触，必须立 即放入超低温冰箱(_65°C _70°C )冷冻处理。2、勻浆、收集滤液取辣根切片一份，按重量比加入1. 5倍 3倍的无杂质去离子水(4°C冰箱预冷)， 蒸馏水的PH值调整在6士0. 5之间，然后迅速(2min以内)打成勻浆，将打好的全浆放到压 榨机中，用动力液压将汁液全部压挤出来，采用3 5层医用纱布过滤，收集滤液；使用定性 分析滤纸(中速)对滤液进行真空抽滤，(真空度-0. 1 -0. OlMpa)再收集滤液，进入下 一处理步骤。整个过程要求在低温(3 5°C )下进行。3、静置、沉淀、上清液离心
将收集的滤液放置在3 5°C条件下静置2 4h，取上清液进行低温冷冻离心 (4°C、6000r/min、15min)，弃去沉淀。取清液放在3 5 °C条件下冷藏待进行分离纯化。4、丙酮沉淀、离心、纯化取一定体积的上述清液，在3 5°C、均勻搅拌的条件下，按体积比加入1. 5倍 3倍的经过预冷(-20°C)的丙酮进行2h沉淀，沉淀完成后汁液进行离心(4°C、6000r/min、 IOmin)，收集沉淀；用5 IOml的冷丙酮(_20°C预冷)沉淀，悬浮洗涤脱水2次，离心(4°C、 6000r/min、10min)，收集沉淀。5、冷冻干燥、保存取上述沉淀，放入冻干盘中，低温冷冻真空干燥(-35 _40°C，4. O 5. Ombar)至 恒重，收集冻干样，将其密封保存在-20°C条件下。实施方式1(1)按重量百分比计，称取2份冷冻的辣根片，加入4份的无杂质去离子水(4°C冰 箱预冷)，蒸馏水的PH值调整在6士0.5之间，然后迅速(2min以内)打成勻浆，将打好的 全浆放到压榨机中，用动力液压将汁液全部压挤出来，采用3 5层医用纱布过滤，收集滤 液；使用定性分析滤纸(中速)对滤液进行真空抽滤，(真空度-0. 1 -0. OlMpa)再收集 滤液，进入下一处理步骤。整个过程要求在低温(3 5°C )下进行。(2)将收集的滤液放置在3 5°C条件下静置2h，取上清液进行低温冷冻离心 (4°C、6000r/min、15min)，弃去沉淀。取清液放在3 5°C条件下冷藏待进行分离纯化。(3)按体积百分比计，取1份上述清液，在3 5°C、均勻搅拌的条件下，加入2 份的经过预冷(-20°C)的丙酮进行2h沉淀，沉淀完成后汁液进行离心(4°C、6000r/min、 IOmin)，收集沉淀；用5 IOml的冷丙酮(_20°C预冷)沉淀，悬浮洗涤脱水2次，离心(4°C、 6000r/min、10min)，收集沉淀。(4)取上述沉淀，放入冻干盘中，低温冷冻真空干燥(-35 -40°C，4.0 5. Ombar)至恒重，收集冻干样，将其密封保存在-20°C条件下。上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发 明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的 一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施 例，本领域技术人员根据本发明的揭示，对于本发明做出的改进和修改都应该在本发明的 保护范围之内。
权利要求
一种黑芥子硫酸苷酶的提取方法，其特征在于由辣根中提取黑芥子硫酸苷酶。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于包括以下步骤对辣根的清洗、切片、 预冷；勻浆、收集滤液；静置、沉淀、上清液离心；沉淀、离心、纯化；冷冻干燥、保存。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于包括①辣根的清洗、切片、预冷将新鲜辣根洗净后冷风吹干，切成小片，放入超低温冰箱冷冻处理；②勻浆、收集滤液按辣根切片重量加入1. 5-2. 5倍倍重量比的干净去离子水，迅速打浆，用压榨机压汁， 采用医用纱布过滤，收集滤液，滤液再经过真空抽滤，最终得到粗酶液；③静置、沉淀、上清液离心在3 5 °C条件下静置，取上清液进行冷冻离心，弃去沉淀；上清液放在3 5°C条件下 冷藏待进行分离纯化；④沉淀、离心、纯化取一定体积的上述清液，在3 5°C、均勻搅拌的条件下，按清液丙酮=1 1.5 2. 5的体积比加入经过预冷的丙酮进行沉淀，沉淀完成后汁液进行离心，收集沉淀；沉淀再 用少量丙酮悬浮洗涤脱水，离心，收集沉淀；⑤冷冻干燥、保存收集的沉淀经低温冷冻真空干燥至恒重，冷冻密封保存。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于其中第②步所用去离子水的PH值为 5. 5~6. 5 ο
5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于其中第④步中丙酮沉淀时间为2h。
全文摘要
本发明公开了一种黑芥子硫酸苷酶的提取方法，由辣根中提取黑芥子硫酸苷酶。将鲜辣根清洗、切片、预冷处理，按辣根切片重量加入2倍重量比的pH为5～7干净蒸馏水，匀浆过滤，收集滤液；通过静置、离心、丙酮沉淀、再离心、丙酮悬浮洗涤脱水、离心，收集沉淀；将该沉淀进一步用低温冷冻真空干燥机冻干，可获得具有较高酶活性的黑芥子硫酸苷酶。本发明的方法其原料来源丰富，提取方法简单，更适合于工业化生产。
文档编号C12N9/24GK101993862SQ200910056790
公开日2011年3月30日 申请日期2009年8月21日 优先权日2009年8月21日
发明者乔勇进, 方强, 王海宏, 陈召亮 申请人:上海市农业科学院作物育种栽培研究所