专利名称：一种隐球酵母属菌胶囊剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种隐球酵母属菌胶囊剂及其制备方法。
背景技术：
生防制剂商业化生产中的一个主要问题是需要寻找到一种合适的方法可以让 产品在货架期中保持足够的生防效力。冷冻干燥是一种成功、有效的剂型加工方式， 形成的干粉制剂有利于保存、销售。但商业化生产中，冷冻干燥需要大型的设备， 而且能量消耗很大，成本较高。为了降低生产成本，提高生防效力，需要寻找其它 的剂型加工方式。
褐藻酸是褐藻类细胞壁成分中的多糖，是由D-甘露糖醛酸与L-古洛糖醛酸组 成的一种聚糖醛酸，在铜藻、裙带菜、海带和昆布等海洋生物中含量丰富。在工业 上经常使用的是它的钠盐形式——褐藻酸钠。褐藻酸钠又名海藻酸钠、海带胶、褐 藻胶、藻酸盐，广泛应用于食品、医药、纺织、印染、造纸、日用化工等行业，作 为增稠剂、乳化剂、稳定剂、黏合剂、上桨剂等使用。褐藻酸钠是一种多极性、多 羟基的高分子化合物，与水具有非常强的亲合力，在溶液中与钙离子接触会诱导古 洛糖醛残基的交联，形成凝胶。褐藻酸钠形成的凝胶具有极高的胶体稳定性。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种制备隐球酵母属菌胶囊剂的方法。
本发明所提供的制备隐球酵母属菌胶囊剂的方法，可以包括如下步骤将褐藻 酸盐溶液、隐球酵母属菌、多价金属阳离子混合，得到隐球酵母属菌胶囊剂。
所述将褐藻酸盐溶液、隐球酵母属菌、多价金属阳离子混合的方法可包括如下 步骤将所述褐藻酸盐溶液与所述隐球酵母属菌混合，得到所述褐藻酸盐和所述隐 球酵母属菌的混合液；再将所述混合液与所述多价金属阳离子的溶液混合。
所述将所述混合液与所述多价金属阳离子的溶液混合的方法包括将所述混合 液逐滴加入到所述多价金属阳离子的溶液的步骤。
所述将所述混合液与所述多价金属阳离子的溶液混合的方法中，在所述将所述 混合液逐滴加入到所述多价金属阳离子的溶液后，还可包括搅拌的步骤，也可以静 置而不搅拌。所述搅拌的时间可为20-60分钟，优选为20-30分钟。
所述褐藻酸盐黏度可为200X 10_3pa s -20000 X 10—3pa s，优选为250X l(Tpa s -14000X10—3pa s。黏度指褐藻酸盐2%的水溶液的黏度值。
所述褐藻酸盐和所述隐球酵母属菌的混合液中所述褐藻酸盐的浓度可为 0. 5%-2. 5% (质量百分含量)，所述隐球酵母属菌的浓度可为lX 108-5X 108cfu/mL， 优选为2X108cfu/mL。
所述多价金属阳离子的溶液中所述多价金属阳离子的浓度可为 0. 045-0. 36mol/L，优选为0. 09mol/L;所述多价金属阳离子可为钙、钡、铝等，优
选为钙离子。
所述逐滴加入的速度可为3-7ml/min，优选为5ml/min。 所述褐藻酸盐具体可为褐藻酸钠。
所述隐球酵母属菌可为酵母拮抗菌(Crypfococcwshwre/^W)，具体可为酵 母拮抗菌(Crj73z^cocciAs ^wr朋z^7) CGMCC No. 1029。
由上述任一所述方法得到的隐球酵母属菌胶囊剂也属于本发明的保护范围。 本发明制备方法与现有的冷冻干燥技术相比，不需要大型的设备，不需要严格 复杂的工艺条件，只要简单的仪器，在常规条件下就可完成，大大节省了成本，节 约了资源，简化了操作。实验证明，本发明方法制备得到的隐球酵母属菌胶囊剂中 活菌率高，均在70%以上，高的可达90%，而且菌的活性保持不变。本发明隐球酵 母属菌胶囊剂在低温和常温下都可存放， 一个月内常温和低温的存放效果没有显著 差异，便于生产上的运输和销售。因此，本发明方法在制备生物制剂及菌或其它生 物的保藏中都具有广阔的应用前景。
具体实施例方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 实施例1、酵母拮抗菌(Cryp"cocc^ 7awe/2h7)的胶囊剂的制备 一、酵母拮抗菌Crj7^ococc^ "^^7ti7菌种的保存、活化及其发酵培养 1、菌种的活化
取-20。C保存的酵母拮抗菌(Cr/pz^cocciAs CGMCC No. 1029
(CN1733898)，将其接种于NYDA培养基中，铺板，在28。C下培养72小时；72小 时后取少量生长良好的酵母拮抗菌接种在NYDB液体培养基中进一步活化培养；铺
4板，在NYDA培养基上划线获得单菌落。
NYDA培养基葡萄糖IO，大豆蛋白胨5，牛肉膏l，酵母提取物7.5，琼脂18，
单位gL-、
NYDB液体培养基葡萄糖IO，大豆蛋白胨5，牛肉膏l，酵母提取物7.5，单
位gL—'。
大豆蛋白胨购自北京双旋微生物培养基制品厂，产品目录号为02-19;牛肉膏
购自北京双旋微生物培养基制品厂，产品目录号为02-05A;酵母提取物购自北京双 旋微生物培养基制品厂，产品目录号为02-12A。 2、菌种的培养
挑取单菌落接入上述NYDB液体培养基中(250mL三角瓶中含100mL培养基)， 振荡培养(28°C， 200rpm) 24小时，然后按2%接种浓度接种到1000raL三角瓶(含 250mL培养基)中，在相同条件下进行扩大培养，培养48小时。
二、在不同条件下制备酵母拮抗菌胶囊剂
(一) 用黏度为250Xl(Tpa s、浓度为1%的褐藻酸钠溶液进行制备 将NYDB中培养48小时的酵母拮抗菌离心收集，用无菌水漂洗3次，用无菌水
悬浮菌；然后用灭过菌(湿热灭菌，121°C， 15分钟)的黏度为250Xl(Tpa' s的 褐藻酸钠配制的溶液与酵母拮抗菌悬液混合，得到褐藻酸钠与酵母拮抗菌混合液， 混合液中褐藻酸钠的浓度为1% (质量百分含量)，混合液中酵母拮抗菌的浓度为 1X 108cfu/mL。用5mL的加样器每次吸取5mL的混合液，以3mL/min的速度将混合 液滴于0.25mol/L的CaCl2溶液中，用磁力搅拌器缓慢搅拌40分钟，得到含有酵母 拮抗菌的凝胶体球，将凝胶体球过滤出来，在无菌条件下风干，获得的干胶球即为 酵母拮抗菌胶囊剂。
(二) 用黏度为250X 10—3pa s、浓度为2. 5%的褐藻酸钠溶液进行制备
将NYDB中培养48小时的酵母拮抗菌离心收集，用无菌水漂洗3次，用无菌水 悬浮菌；然后用灭过菌(湿热灭菌，12rC， 15分钟)的黏度为250X10—3pa's的 褐藻酸钠配制的溶液与酵母拮抗菌悬液混合，得到褐藻酸钠酵母拮抗菌混合液，混 合液中褐藻酸钠的浓度为2. 5%，混合液中酵母拮抗菌的浓度约为3X108Cfu/mL。用 5mL的加样器每次吸取5mL的混合液，以4mL/rain的速度将混合液滴于0. 045mol/L 的CaCl2溶液中，用磁力搅拌器缓慢搅拌30分钟，得到含有酵母拮抗菌的胶体球，
5将胶体球过滤出来，在无菌条件下风干，获得的干胶球即为酵母拮抗菌胶囊剂。
(三) 用黏度为3500X 10—3pa s、浓度为0. 5%的褐藻酸钠溶液进行制备
将NYDB中培养48小时的酵母拮抗菌离心收集，用无菌水漂洗3次，用无菌水 悬浮菌；然后用灭过菌(湿热灭菌，121°C， 15分钟)的黏度为3500X 10—3pa's 的褐藻酸钠配制的溶液与酵母拮抗菌悬液混合，得到褐藻酸钠酵母拮抗菌混合液， 混合液中褐藻酸钠的浓度为0. 5%，混合液中酵母拮抗菌的浓度约为2X108cfu/mL。 用5mL的加样器每次吸取5 raL的混合液，以5 mL/min的速度将混合液滴于 0.09mol/L的CaCl2溶液中，用磁力搅拌器缓慢搅拌30分钟，得到含有酵母拮抗菌 的胶体球，将胶体球过滤出来，在无菌条件下风干，获得的干胶球即为酵母拮抗菌 胶囊剂。
(四) 用黏度为3500X10、a s、浓度为1%的褐藻酸钠溶液进行制备
将NYDB中培养48小时的酵母拮抗菌离心收集，用无菌水漂洗3次，用无菌水 悬浮菌；然后用灭过菌(湿热灭菌，121°C， 15分钟)的黏度为3500X 10—3pa's 的褐藻酸钠配制的溶液与酵母拮抗菌悬液混合，得到褐藻酸钠酵母拮抗菌混合液， 混合液中褐藻酸钠的浓度为1%，混合液中酵母拮抗菌的浓度约为5X108cfu/raL。用 5mL的加样器每次吸取5mL的混合液，以7mL/rain的速度将混合液滴于0. 36mol/L 的CaCl2溶液中，用磁力搅拌器缓慢搅拌60分钟，得到含有酵母拮抗菌的胶体球， 将胶体球过滤出来，在无菌条件下风干，获得的干胶球即为酵母拮抗菌胶囊剂。
(五) 用黏度为14000X10、a s、浓度为0. 5%的褐藻酸钠溶液进行制备 将NYDB中培养48小时的酵母拮抗菌离心收集，用无菌水漂洗3次，用无菌水
悬浮菌；然后用灭过菌(湿热灭菌，12rC， 15分钟)的黏度为14000X 10—3pa* s 的褐藻酸钠配制的溶液与酵母拮抗菌悬液混合，得到褐藻酸钠酵母拮抗菌混合液， 混合液中褐藻酸钠的浓度为0. 5%，混合液中酵母拮抗菌的浓度约为2X 108Cfu/mL。 用5mL的加样器每次吸取5mL的混合液，以5mL/min的速度将混合液滴于0. 09mol/L 的CaCl2溶液中，用磁力搅拌器缓慢搅拌30分钟，得到含有酵母拮抗菌的胶体球， 将胶体球过滤出来，在无菌条件下风干，获得的干胶球即为酵母拮抗菌胶囊剂。(六)用黏度为14000X10 a s、浓度为1%的褐藻酸钠溶液进行制备 将NYDB中培养48小时的酵母拮抗菌离心收集，用无菌水漂洗3次，用无菌水 悬浮菌；然后用灭过菌(湿热灭菌，121°C， 15分钟)的黏度为14000X10—3pa* s 的褐藻酸钠配制的溶液与酵母拮抗菌悬液混合，得到褐藻酸钠酵母拮抗菌混合液， 混合液中褐藻酸钠的浓度为1%，混合液中酵母拮抗菌的浓度约为4X108cfu/raL。用 5mL的加样器每次吸取5mL的混合液，以6mL/min的速度将混合液滴于0. 15mol/L 的CaCl2溶液中，用磁力搅拌器缓慢搅拌20分钟，得到含有酵母拮抗菌的胶体球， 将胶体球过滤出来，在无菌条件下风千，获得的干胶球即为酵母拮抗菌胶囊剂。
上述制备方法中均使用5ml的加样器，其目的主要是保证获得胶囊的大小相同， 可以根据实际需要选择不同大小的加样器。
三、胶囊剂中酵母拮抗菌的活性检测
(一) 步骤二中实验(一)制备的胶囊剂中细胞活性检测 将步骤二中实验(一)制备的胶囊剂在风干后用过滤灭菌的50 ramol/L pH 7. 0
的磷酸缓冲液溶解，然后用血球计数器将溶解后的溶液中酵母拮抗菌的浓度稀释到 约4Xl(fcfu/mL，吸取50PL涂布于NYDA平板上，28。C下培养12小时，用显微镜 观测平板，计数。活力正常的细胞能迅速繁殖形成微菌落，而死亡的细胞或活力弱 的细胞不能形成微菌落。选择不同的视野分别计数有活力和失去活力的细胞数量， 计算酵母拮抗菌存活率。每个平板观察的细胞数为300个，共有3个平板用于观察计数。
存活率=活性细胞数量/计数细胞总数X 100% 实验设3次重复，结果如表l所示。
(二) 步骤二中实验(二)制备的胶囊剂中细胞活性检测 将步骤二中实验(二)制备的胶囊剂在风干后用过滤灭菌的50 mmol/L pH 7. 0
的磷酸缓冲液溶解，然后用血球计数器将溶解后的溶液中酵母拮抗菌的浓度稀释到 约4XlCfcfu/mL，吸取50叱涂布于NYDA平板上，28。C下培养12小时，用显微镜 观测平板，计数。活力正常的细胞能迅速繁殖形成微菌落，而死亡的细胞或活力弱 的细胞不能形成微菌落。选择不同的视野分别计数有活力和失去活力的细胞数量， 计算酵母拮抗菌存活率。每个平板观察的细胞数为300个，共有3个平板用于观察计数。
7存活率=活性细胞数量/计数细胞总数X 100% 实验设3次重复，结果如表l所示。
(三) 步骤二中实验(三)制备的胶囊剂中细胞活性检测 将步骤二中实验(三)制备的胶囊剂在风干后用过滤灭菌的50 mmol/L pH 7.0
的磷酸缓冲液溶解，然后用血球计数器将溶解后的溶液中酵母拮抗菌的浓度稀释到 约4XlO0cfu/niL，吸取50叱涂布于NYDA平板上，28。C下培养12小时，用显微镜
观测平板，计数。活力正常的细胞能迅速繁殖形成微菌落，而死亡的细胞或活力弱 的细胞不能形成微菌落。选择不同的视野分别计数有活力和失去活力的细胞数量， 计算酵母拮抗菌存活率。每个平板观察的细胞数为300个，共有3个平板用于观察计数。
存活率=活性细胞数量/计数细胞总数X 100% 实验设3次重复，结果如表l所示。
(四) 步骤二中实验(四)制备的胶囊剂中细胞活性检测 将步骤二中实验(四)制备的胶囊剂在风干后用过滤灭菌的50 mmol/L pH 7.0
的磷酸缓冲液溶解，然后用血球计数器将溶解后的溶液中酵母拮抗菌的浓度稀释到 约4Xl(fcfu/raL，吸取50叱涂布于NYDA平板上，28。C下培养12小时，用显微镜
观测平板，计数。活力正常的细胞能迅速繁殖形成微菌落，而死亡的细胞或活力弱 的细胞不能形成微菌落。选择不同的视野分别计数有活力和失去活力的细胞数量， 计算酵母拮抗菌存活率。每个平板观察的细胞数为300个，共有3个平板用于观察计数。
存活率=活性细胞数量/计数细胞总数X 100% 实验设3次重复，结果如表l所示。
(五) 步骤二中实验(五)制备的胶囊剂中细胞活性检测 将步骤二中实验(五)制备的胶囊剂在风干后用过滤灭菌的50 ramol/L pH 7. 0
的磷酸缓冲液溶解，然后用血球计数器将溶解后的溶液中酵母拮抗菌的浓度稀释到 约4X106cfu/mL，吸取50吣涂布于NYDA平板上，28。C下培养12小时，用显微镜 观测平板，计数。活力正常的细胞能迅速繁殖形成微菌落，而死亡的细胞或活力弱 的细胞不能形成微菌落。选择不同的视野分别计数有活力和失去活力的细胞数量， 计算酵母拮抗菌存活率。每个平板观察的细胞数为300个，共有3个平板用于观察 计数。存活率=活性细胞数量/计数细胞总数X 100% 实验设3次重复，结果如表l所示。 (六)步骤二中实验(六)制备的胶囊剂中细胞活性检测
将步骤二中实验(六)制备的胶囊剂在风干后用过滤灭菌的50 ramol/L pH 7. 0 的磷酸缓冲液溶解，然后用血球计数器将溶解后的溶液中酵母拮抗菌的浓度稀释到 约4Xl(fcfu/mL，吸取50叱涂布于NYDA平板上，28。C下培养12小时，用显微镜
观测平板，计数。活力正常的细胞能迅速繁殖形成微菌落，而死亡的细胞或活力弱 的细胞不能形成微菌落。选择不同的视野分别计数有活力和失去活力的细胞数量， 计算酵母拮抗菌存活率。每个平板观察的细胞数为300个，共有3个平板用于观察 计数。
存活率=活性细胞数量/计数细胞总数X 100% 实验设3次重复，结果如表l所示。
表l、酵母拮抗菌胶囊剂风干后细胞存活率
处理存活率(％)
实验(一)1% 250X 10—3pa s76. 7 ±2. 3*
实验(二) 2. 5% 250X 10—3pa s82. 2±2. 7
实验(三)0. 5% 3500X 10—3pa s91.5±2.9
实验(四)1% 3500X 10—3pa s81.6±5.9
实验(五)0. 5% 14000X10—3pa s88. 1±3, 1
实验(六)1% 14000X10—3pa s88, 1±3. 3
*:数值为存活率士标准偏差，星号作为代表，表示此列数据均为存活率土标准偏差。
试验结果表明酵母拮抗菌Co7 "coccm hwr朋"7经不同浓度和黏度的褐藻 酸钠胶囊化处理后细胞存活率在75 %以上，最高达到91. 5% (0. 5 % 3500X 10—3pa s)。 (表l)。
四、存放温度对酵母拮抗菌胶囊剂中酵母菌存活率的影响
将用黏度为3500Xl(T3pa s、浓度为0. 5%的褐藻酸钠溶液(即步骤二中实验(三))制备得到的胶囊剂，分别存放在4r和25t:条件下，30天后按照实验三的
方法检测制剂中酵母拮抗菌的存活率。
实验设3次重复，结果取平均数。
试验结果表明，酵母拮抗菌Cr>p"coCc"s h"2，e/7"7的胶囊剂在25'C存放30 天后的存活率为60.4%，在4。C存放30天后的存活率为62.8%，低温存放的存活率 略高于常温，两者差异不显著。表明本发明方法制备得到的菌胶囊剂可以在室温储 存，而且存放时间比较长。
权利要求
1、一种制备隐球酵母属菌胶囊剂的方法，包括如下步骤将褐藻酸盐溶液、隐球酵母属菌、多价金属阳离子混合，得到隐球酵母属菌胶囊剂。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述将褐藻酸盐溶液、隐球酵 母属菌、多价金属阳离子混合的方法包括如下步骤将所述褐藻酸盐溶液与所述隐 球酵母属菌混合，得到所述褐藻酸盐和所述隐球酵母属菌的混合液；再将所述混合 液与所述多价金属阳离子的溶液混合。
3、 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述将所述混合液与所述多价 金属阳离子的溶液混合的方法包括将所述混合液逐滴加入到所述多价金属阳离子 的溶液的步骤。
4、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述将所述混合液与所述多价 金属阳离子的溶液混合的方法中，在所述将混合液逐滴加入到所述多价金属阳离子 的溶液后，包括搅拌的步骤。
5、 根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述搅拌的时间为20-60分钟。
6、 根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述褐藻酸盐黏度为200Xl(Tpa s -20000X 10—3pa s，优选为250X 10—3pa s -14000 X 10—3pa s。
7、 根据权利要求2-6中任一所述的方法，其特征在于所述褐藻酸盐和所述 隐球酵母属菌的混合液中所述褐藻酸盐的浓度为0.5%-2.5% (质量百分含量)，所 述隐球酵母属菌的浓度为lX 108-5 X 108cfu/mL，优选为2X 108cfu/mL;所述多价金 属阳离子的溶液中所述多价金属阳离子的浓度为0. 045-0. 36mol/L，优选为 0.09mol/L;所述多价金属阳离子优选为钙离子。
8、 根据权利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于所述逐滴加入的速度 为3-7ml/min，优选为5ml/min。
9、 根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于所述隐球酵母属菌为酵母拮抗菌(CrjT t(9C(9CC^S1 23"re72"7)。
10、 由权利要求1-9中任一所述方法得到的隐球酵母属菌胶囊剂。
全文摘要
本发明公开了一种隐球酵母属菌胶囊剂及其制备方法。本发明的制备隐球酵母属菌胶囊剂的方法，包括如下步骤将褐藻酸盐溶液、隐球酵母属菌、多价金属阳离子混合，得到隐球酵母属菌胶囊剂。实验证明，本发明方法制备得到的隐球酵母属菌胶囊剂中活菌率高，均在70％以上，高的可达90％，而且菌的活性不会下降。本发明隐球酵母属菌胶囊剂在低温和常温下都可存放，常温条件下一个月内保存效果与低温存放效果无显著差异，而且不会影响菌的生物活性。因此，本发明方法在制备生物制剂及菌或其它生物的保藏中都具有广阔的应用前景。
文档编号C12N1/04GK101503661SQ20091007977
公开日2009年8月12日 申请日期2009年3月10日 优先权日2009年3月10日
发明者孟祥红, 勇 徐, 李博强, 田世平, 秦国政 申请人:中国科学院植物研究所