专利名称：：一种生物制氢方法及其专用菌的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种生物制氢方法及其专用菌。
背景技术：
：生物质能一直是人类赖以生存的重要能源，它仅次于煤炭、石油和天然气，居于世界能源消费总量的第四位，在整个能源系统中占有重要地位。在我国，生物质能占全部能源消耗总量的20%。但长期以来，生物质能在我国商业用能结构中的比率极小，其主要是作为一次能源在农村利用，约占农村总能耗的70%左右。以生物质为原料的生物炼制作为一个相对比较年轻的研究领域，系统的研究和开发主要是在欧洲进行的；而工业领域的发展则主要是在美国。美国生物质技术顾问委员会开展了一个关于生物能量、生物燃料和生物产物的长期计划和目标，基于生物质的运输燃料将从2001年占美国燃料消耗的0.5%增长到2030年的20%。从2006年1月1日起，我国开始施行《中华人民共和国可再生能源法》，将大大促进可再生能源的开发利用，增加能源供应，改善能源结构，保障能源安全，保护环境，实现经济社会的可持续发展。在生物炼制中，基于生物原料的燃料包括固体、液体和气体三种形式，生物柴油、乙醇、甲醇、甲烷和氢气等，是目前世界上被广泛关注的几种能源形式。氢气本身无毒，燃烧后仅生成水，所以被认为是理想的清洁能源。氢气不但是一种优质燃料，还是石油、化工、化肥和冶金工业的重要原料。所有气体中，氢气最轻，导热性最好；除核燃料外，氢的发热值是所有化石燃料、化工燃料和生物燃料中最高的；氢可以气态、液态或固态的金属氢化物出现，能适应贮运及各种应用环境的不同要求。通过生命周期分析，在所有燃料中氢气有最高的原料灵活性，来源于可再生生产途径的氢气环境友好，不涉及温室气体排放，最终实现化石能源到可再生能源的平稳转换。相对于日益完备的氢能利用的下游体系，氢气却没有在以可再生资源为原料的生产方面实现突破。目前，氢气还是主要来自化石燃料的重整转化(占氢气来源的96%)和电解水制氢(占4%)，这显然未能摆脱原有的化石能源体系。因此，如何可持续地从自然界中获取氢气尤其受到人们的关注。生物制氢是解决这一问题的重要途径之一。现代生物制氢的研究始于20世纪70年代的能源危机，到90年代險着对温室效应的进一步认识，生物制氢作为可持续发展的工业技术再次引起人们的重视。生物制氢技术包括光驱动过程和厌氧发酵两种路线前者利用光合细菌直接将太阳能转化为氢气，是一个非常理想的过程，但是由于光利用效率很低，光反应器设计困难等因素，近期内很难推广应用；而后者采用的是产氢菌厌氧发酵，它的优点是产氢速度快，反应器设计简单，且能够利用可再生资源和废弃有机物进行生产，相对于前者更容易在短期内实现。发酵法制氢的研究始于90年代中，但是由于研究小组不多，进展并不大。90年代末到本世纪初，由于逐步意识到发酵制氢具有在近期内实现产业化的潜力，在暗发酵制氢方面的科研投入也大大增加。大量的微生物都具有不同程度的产氢能力，因此利用发酵产氢微生物，将葡萄糖等生物质转化为氢气在技术本身没有问题，而一直困扰其应用的是过程经济性的问题，即如何降低发酵制氢的成本，使之可以和化石能源催化重整制氢的经济性相比拟，或者使之可以与其他生物能源(生物制甲垸、燃料酒精、生物柴油)相竞争。当前的核心问题是如何提高氢气的转化得率以降低生产成本。目前，国内外的研究主要是基于菌种的筛选、驯化、育种以及各种发酵工艺参数的优化，还无法达到实际应用的水平。但是近年来，随着分子生物学、代谢工程、系统生物学、微生物生态学以及与其交叉的物理、化学等学科技术的发展，使得人们能够深入了解细菌产氢的物质和能量代谢及调控机理，能够更好的对复杂微生物复合体系进行定性定量分析及调控，这些都是目前发酵制氢的前沿研究方向。
发明内容本发明的一个目的是提供一种可产氢气的重组菌。本发明所提供的重组菌，是向产氢的宿主菌中导入激发所述宿主菌厌氧发酵且与所述宿主菌厌氧代谢正相关的基因，得到的含有所述基因的重组菌。其中，所述宿主菌具体可为兼性厌氧菌或专性厌氧菌。所述兼性厌氧菌具体可为肠杆菌科(f/^ero&"en'ac朋e)菌；所述专性厌氧菌具体可为梭菌属(ac^rn'o^/zz)菌。所述肠杆菌科(^^aro力acfer&ceae)菌具体可为肠杆菌属(^)tero力a"er)菌或埃希氏菌属(&c力e"'c力is)菌。所述梭菌属(67oszmViw迈)菌具体可为类腐败梭菌(67oWn'&'鹏para/wz^r/ZYcw/ff);所述肠杆菌属(^teroZa"e力菌具体可为产气肠杆菌所述类腐败梭菌(67asto'G^Mzpara/wz^'/Ycw/z)具体可为类腐败梭菌(C7astrW鹏psr邵wz^rz'/Ycw/z/)ATCC17796;所述产气肠杆菌(5>7fero^l3"e_raeroge"es)具体可为产气肠杆菌(￡IAM1183。所述与所述宿主菌厌氧发酵正相关的基因可为调节因子FNR或NarP的编码基因；所述调节因子FNR的氨基酸序列如序列表中序列l所示；所述调节因子NarP的氨基酸序列如序列表中序列3所示。所述调节因子FNR的编码基因的核苷酸序列具体可如序列表中序列2所示；所述调节因子NarP的编码基因的核苷酸序列具体可如序列表中序列4所示。厌氧代谢调节因子FNR和NarP与产氢相关。转录调节因子FNR可激活一些基因的表达，包括厌氧氧化丙三醇和甲酸等碳源的酶的基因、厌氧还原一些终端电子接受体如硝酸盐、延胡索酸盐和二甲亚砜的酶的基因，及运输这些碳源和电子接受体的蛋白的基因(KangY，WeberKD，QiuY，etal.Genome-wideexpressionanalysisindicatesthatFNRofEscherichiacoliK-12regulatesalargenumberofgenesofunknownfunction.JBacteriol，2005，187:1135-1160)。NarP是一个双组分调节系统的调节因子，与亚硝酸盐、硝酸盐有关(GOA.GeneOntologyannotationbasedonSwiss-Protkeywordmapping.2000)。本发明的另一个目的是提供一种生物制氢的方法。本发明所提供的生物制氢的方法包括如下步骤发酵上述任一所述重组菌，得到氢气。当用产气肠杆菌(^>^erc>Za"e_raeir^ewes)禾口类腐败梭菌(CJostrio^'〃迈par3/w^^'/Ycw历)作为宿主，用本发明方法进行生物制氢时，整个体系培养温度可为2550'C，发酵时间可为5、0h，发酵pH可为4.5-9.0。采取操作简单、最为广泛使用的批式培养。均可以以葡萄糖作为碳源。就发酵微生物产氢的代谢路径而言，到目前为止研究比较清楚的有两大类，一5类是以甲酸为前体物质在甲酸裂解产氢酶体系的作用下生产氢气(HC00—+H+—H2+C02);另一类是以NADH为前体以铁氧还蛋白为介导在氢酶的作用下生产氢气(NADH+H+—NAD++H2)。本发明的发明人经过研究总结出氢气生成的本质是厌氧条件下电子流或能量的调节控制机制之一(2e—+2H+—H2),生物发酵制氢是只有在厌氧条件下才能发生的反应，且是厌氧条件下控制能量流的机制之一。同时发明人又创造性的联系到在细胞代谢网络中存在的一类结合于DNA的双向转录厌氧调节因子(即与厌氧发酵正相关的调节因子)，它们能剌激许多涉及厌氧发酵的基因转录，同时抑制只有在好氧条件下才能发挥功能的基因的转录。发明人将上述厌氧调节因子应用到生物制氢中，从而完成了本发明。现有技术中关于生物制氢的改进，一般都是集中在与产氢代谢路径相关的酶或者蛋白基因的改进。本发明的发明人突破了现有思维，从氢气生成的本质出发，从细胞代谢全局调控的角度进行了生物制氢代谢的改进，具体是促进细胞厌氧代谢，以剌激氢酶活性，改变细胞氧化还原状态，从而提高细胞产氢能力。所述的全局调控就是通过使细胞厌氧发酵正相关的基因在细胞中过量表达实现的，利用上述厌氧调节因子，对整个厌氧代谢进行调节，通过刺激整个厌氧代谢基因的转录，进而调节厌氧产氢路径，促进更多的代谢流进入产氢路径，提高细胞的产氢能力。实验证明，本发明重组菌的产氢能力与对照菌比有了显著的提高。因此，本发明重组菌与生物制氢方法在生物制氢领域中有广阔的应用前景，对节约能源具有重要的意义。具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。pMAL-c2X购自NEB公司，产品目录号为N8076;pACYC184购自NEB公司，产品目录号为E4152S;pET-28a(+)购自Novagen公司，编号为69337-3;大肠杆菌(^c力eWc/^coh'K-12)购自NEB公司，产品目录号为E4104S。所有涉及的分子生物学操作都是按照《分子克隆实验指南》的标准操作(萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼妮阿蒂斯T.分子克隆实验指南(第二版)[译].北京科学出版社，1993)。产气肠杆菌(7&2fero&cfer犯/^ge;7es)IAM1183属兼性厌氧革兰氏阴性菌，购自日本东京大学应用微生物研究所(InstituteofAppliedMicrobiology,I細y。类腐败梭菌(C7oWnW鹏/arwwz^'/icMz)ATCC17796属专性厌氧革兰氏阳性菌，购自美国标准生物品收藏中心(AmericanTypeCultureCollection,ATCC)。产气肠杆菌(￡^eroZ^"eraejY^朋es)IAM1183为兼性厌氧菌。产气肠杆菌培养温度为37t:。培养基组成为每升培养基中含有葡萄糖15g，蛋白胨5g，(NH4)2S042g，KH2P0414g，K2HP043H206g，MgS040.2g，所述培养基的pH为6.0。产气肠杆菌能利用葡糖酸盐、葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、半乳糖、D-甘露醇、水杨苷、D-阿东醇、间-肌醇、D-山梨醇、L-阿拉伯糖、棉籽糖、L-鼠李糖、麦芽糖、D-木糖、海藻糖、纤维二醇、ct-甲基-D-葡萄糖苷、七叶灵、蜜二糖、D-阿拉伯糖醇、粘质酸盐、D-甘露糖和甘油；也能利用丙二酸盐、柠檬酸盐和醋酸盐作为唯一碳源；还能利用一定浓度甲酸。产气肠杆菌可以在logP值为3.2以上的溶剂(异辛烷、庚垸、己烷、环己垸)中生存，还能在汞存在的条件下生存，表明其具有处理富溶剂废物的潜力。类腐败梭菌(67asz^zVi'咖par邵wm'/Yc咖)ATCC17796为专性厌氧菌，属于梭菌类，可以产生孢子，有较好的产氢能力。类腐败梭菌的培养温度为3545。C。培养基组成为每升培养基中含有葡萄糖15.0g，胰蛋白胨2.0g，酵母提取物4.5g，碳酸钠4.0g，半胱氨酸盐酸盐3.0g，所述培养基的pH为6.0。类腐败梭菌可利用葡萄糖、果糖、半乳糖、糖原、乳糖、麦芽糖、甘露糖、水杨苷、淀粉、蔗糖、N-乙酰-D-氨基葡萄糖。类腐败梭菌菌株之间有一定差异，能利用一定浓度的苦杏仁苷、阿拉伯糖、纤维二糖、七叶苷、菊糖、鼠李糖、核糖、山梨糖、山梨醇、海藻糖、木糖和乙酸、丁酸。调节因子FNR蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示，编码该因子蛋白FNR的基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示；调节因子NarP蛋白的氨基酸序列如序列表中序列3所示，编码该因子蛋白NarP的基因的核苷酸序列如序列表中序列4所示。一、重组载体pMCL-//Lr^BpMCL-72ar/的构建1、调节因子FNR的编码基因Z)^的获得以大肠杆菌(^sc力en'c力j'aco7iK-12)为模板，用引物P3F/P3R进行PCR扩增，得到FNR蛋白的编码基因/>^;扩增得到的基因Ar的核苷酸序列为'序列表中序列2自5'末端起第1-753位核苷酸所示，产物中基因两端分别带有限制性内切酶BamHI和Pstl的识别序列。2、调节因子NarP的编码基因的获得以大肠杆菌(fsc力erj'c力iacoh'K-12)为模板，用引物P4F/P4R进行PCR扩增，得到NarP蛋白的编码基因朋/p;扩增得到的基因/7S7p的核苷酸序列为序列表中序列4自5'末端起第1-648位核苷酸所示，产物中基因两端分别带有限制性内切酶BamHI和Pstl的识别序列。3、pMCL质粒的构建以pMAL-c2X为模板，用P1F/P1R引物进行PCR扩增，得到pMAL-c2X上除去氨苄青霉素抗性(^^;)后的剩余序列；用限制性内切酶XhoI和KpnI酶切消化上述扩增产物，得产物I;PCR扩增条件为94°C，5min;30个循环，94°C，lmin;60°C，3min;72°C，1min;最终72。C延伸5min，最后4"C保存。以pACYC184为模板，用引物P2F/P2R进行PCR扩增，得到pACYC184上的氯霉素序列(&);将PCR扩增产物TA克隆到pMD-18Tsimple载体上，然后用限制性内切酶KpnI和Xhol酶切消化得产物II;PCR扩增条件为94°C，5min;30个循环，94°C，lmin;58°C，1.5min;72°C，1min;最终72。C延伸5min，最后4。C保存。连接酶切产物I和酶切产物II，得到pMCL质粒。将pMCL质粒进行酶切验证和测序验证，结果表明构建的pMCL质粒的结构正确。4、重组载体pMCL-Ar的构建用限制性内切酶BamHI和Pstl分别酶切编码基因/7Lr和pMCL质粒，连接，得到重组质粒pMCL-将pMCL-/hr质粒进行酶切验证和测序验证，结果表明构建的pMCL-/hr质粒的结构正确。5、重组载体pMCL-"ar/的构建用限制性内切酶BamHI和Pstl分别酶切编码基因/ar/7和pMCL质粒，连接，得到重组质粒pMCL-"ar/;将pMCL-朋ip质粒进行酶切验证和测序验证，结果表明构建的pMCL-朋ip质粒的结构正确。所用的引物序列如表l所示。表1、质粒构建需要引物<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注下划线序列代表酶切位点序列。二、重组载体pMKL-Ar和pMKL-朋ip的构建1、调节因子F服的编码基因Ar的获得以大肠杆菌(^sc力erich'acoWK-12)为模板，用引物P7F/P7R进行PCR扩增，得到FNR蛋白的编码基因Ar;扩增得到的基因/z^的核苷酸序列为序列表中序列2自5'末端起第1-753位核苷酸所示，产物中基因两端分别带有限制性内切酶BamHI和PstI的识别序列。2、调节因子NarP的编码基因/ar/的获得以大肠杆菌(i^c力en'c力iacoWK-12)为模板，用引物P8F/P8R进行PCR扩增，得到NarP蛋白的编码基因朋ip;扩增得到的基因朋ip的核苷酸序列为序列表中序列4自5'末端起第1-648位核苷酸所示，产物中基因两端分别带有限制性内切酶BamHI和Pstl的识别序列。3、pMKL质粒的构建以pMAL-c2X为模板，用P5F/P5R引物进行PCR扩增，得到pMAL-c2X上除去氨苄青霉素抗性(^P)后的剩余序列；用限制性内切酶XhoI和KpnI酶切消化上述扩增产物，得产物III;PCR扩增条件为94°C，5min;30个循环，94°C，lmin;60°C，3min;72°C，1min;最终72。C延伸5min，最后4"C保存。以pET-28a(+)为模板，用引物P6F/P6R进行PCR扩增，得到pET-28a(+)上的卡那霉素(《m);将PCR扩增产物TA克隆到pMD-18Tsimple载体上，然后用限制性内切酶KpnI和XhoI酶切消化得产物IV;PCR扩增条件为:94°C，5min;30个循环，94°C，lmin;58°C，1.5min;72°C，1min;最终72。C延伸5min，最后4'C保存。连接酶切产物III和酶切产物IV，得到pMKL质粒。将pMKL质粒进行酶切验证和测序验证，结果表明构建的pMKL质粒的结构正确。4、重组载体pMKL-Ar的构建用限制性内切酶BamHI和Pstl分别酶切编码基因Ar和pMCL质粒，连接，得到重组质粒PMKL-//LT;将pMKL-//LT质粒进行酶切验证和测序验证，结果表明构建的pMKL-Ar质粒的结构正确。5、重组载体pMKL-yar;的构建用限制性内切酶B柳HI和Pstl分别酶切编码基因；2a2p和pMKL质粒，连接，得到重组质粒pMKL-"arp;将pMKL-朋r;质粒进行酶切验证和测序验证，结果表明构建的pMKL-/7sr/7质粒的结构正确。所用的引物序列如表2所示。表2、质粒构建需要引物名称用途引物序列(5'—3')酶切位点P5F去除pMAL-c2X乂mp序歹(lCATCCTCGAGACCAAGTTTACTCATATAXholP5R去除pMAL-c2X^mp序列TAGGTACCATGAGCGGATACATATTTKpnlP6F复制pET-28a(+)Kw序列TACGGTACCAAGCTGGGCTGTGTGCAKpnlP6R复制pET-28a(+)Kw序列AGCACTCGAGAACAACACTCAACCCTATCXholP7F复制K12/w序列AAAGGATCCATGATCCCGGAAAAGCGAB咖HIP7R复制五.co"K12/w序列AACTGCAGTCAGGCAACGTTACGCGTATGPstlP8F复制五.co"'K12ncwp序列CGGGATCCATGCCTGAAGCAACACCTTTTBamHIP8R复制￡.co//K12序列AACTGCAGTTATTGTGCCCCGCGTTGTPstl注下划线序列代表酶切位点序列。下述各实施例进行生物制氢时，均以葡萄糖作为碳源。实施例l、以产气肠杆菌为宿主，转入调节因子FNR的编码基因，提高其产氢能力10一、构建重组菌将表达质粒pMCL-/>Lr电导入产气肠杆菌(^^ftro力3cteraeroge/7es)IAM1183，得到含有基因//^的重组产气肠杆菌/pMa-Z)^。二、发酵重组产气肠杆菌/pMCL-i)^产氢所用的培养基组成为每升培养基中含有葡萄糖15g，蛋白胨5g，(NH4)2S042g，KH2P0414g，K2HP04'3H206g，MgS040.2g，所述培养基的pH为6.0。将活化后的重组产气肠杆菌/pMCL-Ar接入培养基中，使其在培养基中的初始含量为5X108CFU/ml，37°C、170rpm培养15h，重组质粒用IPTG(0.5mM)i秀导。培养过程中采用厌氧条件，通过氮气吹扫的方式去除空气中的氧气。培养过程中，收集产生的气体，培养结束后，计算生成的氢气总量，同时检测培养基中葡萄糖的剩余含量。氢气的测量采用气相色谱的方法(上海精密科学仪器有限公司GC112A型号气相色谱；TCD检测器；TDX-01不锈钢填充柱；进样器、检测器和柱箱温度分别为120、120和80。C;氮气作为载气，流速为10ml/min)。葡萄糖的测定采用常规3,5-二硝基水杨酸比色法(MillerGL.1959.Useofdinitrosalicylicacidreagentfordeterminationofreducingsugar.AnalChem31(3):426-428)。同时以转入空质粒pMCL的产气肠杆菌(i)j^ro力scz^raer0ge/2es)IAMU83作为对照，转入空质粒pMCL的重组菌称作重组产气肠杆菌/pMCL。试验重复三次，结果取平均值土标准差。用培养15h的单位细胞产氢得率和单位葡萄糖产氢得率作为评价产氢能力的指标。单位细胞产氢得率的计算公式单位细胞产氢得率^产氢量(L)/细胞干重(g);单位葡萄糖产氢得率的计算公式单位葡萄糖产氢得率=产氢量(mol)/消耗的葡萄糖(mol)。结果表明重组产气肠杆菌/pMCLlg细胞生产4.288士0.177升(平均值土标准差)(常温常压)氢气，1摩尔葡萄糖生产1.010±0.010摩尔(平均值土标准差)氢气。重组产气肠杆菌/pMCL-/)^lg细胞生产5.592土0.976升(平均值士标准差)(常温常压)氢气，比对照增加了30.4%;l摩尔葡萄糖生产1.131士0.037摩尔(平均值土标准差)氢气，比对照增加了12.0%。表明，基因Ar在菌内的过表达使菌生产氢气的能力得到提高。实施例2、以产气肠杆菌为宿主，转入调节因子NarP的编码基因，提高其产氢能力一、构建重组菌将表达质粒pMCL-朋/p电导入产气肠杆菌(fiterote"eraero《e"es)IAM1183，得到含有基因/^277的重组产气肠杆菌/^\1(^-/73277。二、发酵重组产气肠杆菌/pMCL-/2arp产氢重组菌的培养方法、所用的培养基、氢气产量的检测方法、氢气得率的计算方法等均如实施例1中所述。同时以转入空质粒pMCL的重组产气肠杆菌/pMCL作为对照。试验重复三次，结果为平均值士标准差的形式。用培养15h的单位细胞产氢得率和单位葡萄糖产氢得率作为评价产氢能力的指标。结果表明重组产气肠杆菌/pMCLlg细胞生产4.288土0.177升(平均值士标准差)(常温常压)氢气，1摩尔葡萄糖生产1.010±0.010摩尔(平均值土标准差)氢气。重组产气肠杆菌/pMCL-"aiplg细胞生产4.716±0.045升(平均值土标准差)(常温常压)氢气，增加了10.0%;1摩尔葡萄糖生产1.391土0.113摩尔(平均值土标准差)氢气，增加了37.7%。表明，基因/73/p在菌内的过表达使菌生产氢气的能力得到提高。实施例3、以类腐败梭菌为宿主，转入调节因子FNR的编码基因，提高其产氢能力一、构建重组菌将表达质粒pMKL-//lt电导入类腐败梭菌(67osz^rj'o7咖par邵wz^i/YcMz)ATCC17796,得到含有基因/>lt的重组类腐败梭菌/pMKL-Ar。二、发酵菌产氢气所用的培养基的组成为葡萄糖15.0g/L，胰蛋白胨2.0g/L，酵母提取物4.5g/L，碳酸钠4.0g/L，半胱氨酸盐酸盐3.Og/L;pH调至6.0。将活化后的重组类腐败梭菌/pMKL-Z)7r接入培养基中，使其在培养基中的浓度为5X108CFU/ml，重组质粒用IPTG(O.5raM)诱导，37。C、170rpm培养15h。培养过程中采用厌氧条件，通过氮气吹扫的方式去除空气中的氧气。培养过程中收集产生的气体，培养结束后，计算生成的氢气总量，同时检测培养基中葡萄糖的剩余含量。氢气的测量采用气相色谱的方法(上海精密科学仪器有限公司GC112A型号气相色谱；TCD检测器；TDX-01不锈钢填充柱；进样器、检测器和柱箱温度分别为120、120和80。C;氮气作为载气，流速为10ml/min)。葡萄糖的测定采用常规3，5-二石肖基7K丰汤酸比色^去(MillerGL.1959.Useofdinitrosalicylicacidreagentfordeterminationofreducingsugar.AnalChem31(3):426-428)。同时以转入空载体pMKL的类腐败梭菌(67a^rio^;/i7para/w^ri/Ycw/zATCC17796)作为对照，记作重组类腐败梭菌/pMKL。试验重复三次，结果为平均值土标准差的形式。用培养15h的单位细胞产氢得率和单位葡萄糖产氢得率作为评价产氢能力的指标。产氢得率的计算公式如实施例1中所述。结果表明培养结束后，重组类腐败梭菌/pMKLlg细胞生产1.552±0.026升(平均值士标准差)(常温常压)氢气，1摩尔葡萄糖生产0.968±0.018摩尔(平均值土标准差)氢气。重组类腐败梭菌/pMKL-Arlg细胞生产2.396±0.183升(平均值士标准差)(常温常压)氢气，比对照增加了54.4%;l摩尔葡萄糖生产1.173土0.041摩尔(平均值土标准差)氢气，比对照增加了21.2%。表明基因/hr的过表达使类腐败梭菌产生氢气的能力提高。实施例4、以类腐败梭菌为宿主，转入调节因子NarP的编码基因，提高其产氢能力一、构建重组菌将表达质粒pMKL-"aip电导入类腐败梭菌(ao^2^/z'咖parajWZ^2'/"icMz)ATCC17796，得到含有基因Ar的重组类腐败梭菌/pMKL-7aip。二、发酵菌产氢气发酵培养方法、培养基、氢气检测方法、葡萄糖的测定方法、产氢得率的计算公式与实施例3中所述一致。同时以实施例3中的重组类腐败梭菌/pMKL作为对照。试验重复三次，结果为平均值士标准差的形式。用培养15h的单位细胞产氢得率和单位葡萄糖产氢得率作为评价产氢能力的指标。结果表明培养结束后，重组类腐败梭菌/pMKLlg细胞生产1.552±0.026升(平均值土标准差)(常温常压)氢气，1摩尔葡萄糖生产0.968土0.018摩尔(平均值土标准差)氢气。重组类腐败梭菌/pMKL-朋/plg细胞生产1.603±0.011升(平均值士标准差)(常温常压)氢气，比对照增加了3.3%;l摩尔葡萄糖生产L060土0.018摩尔(平均值土标准差)氢气，比对照增加了9.5%。表明基因"srp的过表达使类腐败梭菌产生氢气的能力提高。序列表<110>清华大学〈120〉一种生物制氢方法及其专用菌〈130〉CGGNARC92373<160〉4<210>1<211>250〈212〉PRT<213〉大肠杆菌(Esc/7er/cWaco//)〈220〉<223〉<400〉1MetlieProGluLysArglielieArgArglieGinSerGlyGlyCys151015AlalieHisCysGinAspCysSerlieSerGinLeuCyslieProPhe202530ThrLeuAsnGluHisGluLeuAspGinLeuAspAsnlielieGluArg354045LysLysProlieGinLysGlyGinThrLeuPheLysAlaGlyAspGlu505560LeuLysSerLeuTyrAlalieArgSerGlyThrlieLysSerTyrThr65707580lieThrGluGinGlyAspGluGinlieThrGlyPheHisLeuAlaGly859095AspLeuValGlyPheAspAlalieGlySerGlyHisHisProSerPhe100105110AlaGinAlaLeuGluThrSerMetValCysGlulieProPheGluThr115120125LeuAspAspLeuSerGlyLysMetProAsnLeuArgGinGinMetMet130135140ArgLeuMetSerGlyGlulieLysGlyAspGinAspMetlieLeuLeu145150155160LeuSerLysLysAsnAlaGluGluArgLeuAlaAlaPhelieTyrAsn165170175UuSerArgArgPheAlaGinArgGlyPheSerProArgGluPheArg180185190LeuThrMetThrArgGlyAsplieGlyAsnTyrLeuGlyLeuThrVal195200205GluThrlieSerArgLeuLeuGlyArgPheGinLysSerGlyMetLeu210215220AlaValLysGlyLysTyrlieThrlieGluAsnAsnAspAlaLeuAla225230235240GinLeuAlaGlyHisThrArgAsnValAla245250<210>2〈211〉753<212〉DNA〈213>大肠杆菌(Esc/7er/c/7/aco//)<220><223〉〈400〉2atgatcccggaaaagcgsatcaggattgcagcatcagccacagcttgataatatcattgagctggtgatgsacttaaatcatcactgagcaaggcgacgatttgscgcc3tcggcagcgggtatgtgaaatcccgttcgacagcagstgatgcgtctgatttgtcgaagaaaaatgccgatttgcccaacgcggcttctcggtascta_tctgggcctgscagcggcatgctggcagtcsscagcttgctggtcatacgcg<210〉3<211〉215<212〉PRT<213>大肠杆菌(Esc/er/c/7/'aco//')〈220〉〈223><400>3tatacggcgcattcagtctggcggttgtgctatccattgc60gctttgcatcccgttcscactcaacgaacstgagcttgat120gcggaagaagcctattcagaaaggccagacgctgtttsag180gctttatgccatccgctccggtacgattaaaagtt3tacc240gcaaatcactggtttccatttagcsggcgacctggtgggs300ccatcacccgagcttcgcgcsggcgctggaaacctcgatg360aacgctggacgatttgtccggtaaaatgccgaatctgcgt420gagcggtgaaatcaaaggcgatcaggacatgatcctgctg480ggaacgtctggctgcsttcatctacaacctgtcccgtcgt540ccctegtgaattccgcctgacgatgsctcgtggcgaitatc60〇ggta_ga_3scca_tca_gccgtctgctgggtcgcttcca_g333660aggtasatacatcaccatcgaaaatascgatgcgctggcc720taacgttgcctga753MetProGluAlaThrProPheGinValMetlieValAspAspHisPro151015LeuMetArgArgGlyValArgGinLeuLeuGluLeuAspProGlySer202530GluValValAlaGluAlaGlyAspGlyAlaSerAlalieAspLeuAla354045AsnArgLeuAsplieAspVallieLeuLeuAspLeuAsnMetLysGly505560MetSerGlyLeuAspThrLeuAsnAlaLeuArgArgAspGlyValThr65707580AlaGinlielielieLeuThrValSerAspAlaSerSerAspValPhe859095AlaLeulieAspAlaGlyAlaAspGlyTyrLeuLeuLysAspSerAsp100105110ProGluValLeuLeuGluAlalieArgAlaGlyAlaLysGlySerLys115120125ValPheSerGluArgValAsnGinTyrLeuArgGluArgGluMetPhe130135140GlyAlaGluGluAspProPheSerValLeuThrGluArgGluLeuAsp145150155160ValLeuHisGluLeuAlaGinGlyLeuSerAsnLysGinlieAlaSer165170175ValLeuAsnlieSerGluGinThrValLysValHislieArgAsnLeu180185190LeuArgLysLeuAsnValArgSerArgValAlaAlaThrlieLeuPhe195200205LeuGinGinArgGlyAlaGin210215<210〉4<211>648<212〉DNA<213>大肠杆菌(Escher/ch/aco//)〈220〉<223〉<400〉4atgcctgaagggtgttcgtcggcgcgsgcggcgca_a_a_tta_gcsggcgcsgcgtgccggagcgtgaastgtgttctgcscgtccgagcagacgcgtggcggC33C3CCtttsgttactggsctatcgatctgtatgagtggttstcctgscacggttatctcgssaggcsgttggcgcggasgctggcacsCC3CC3ttCttcaggtgstggcttgatcctggcgwtsgacctggstsctcgtstccgstcaaagtctttsgaagatcccggggctgtcaac3t3ttcgcgttcctgcaaattgtggatgggctctgasgctggatstcgctcwtgcctgcctccagcgagcgacccggagcgaacgcgttcagcgtgca_￡itctgctgccascgcgggg3tC3tCC3Cttggtcgccgsacgtgatctttgcgcsgggsatgtctttgcaagtattgcttcaatcagtatgacggagcgttgcctcggttatgcgacgc60agcgggcgac120gctggatctc180tggcgttacc240300ggaagcgatt360cttscgtgas420cgagctggat480gttgaatatt540tgtccgctcs60064819权利要求1、一种重组菌，是向产氢的宿主菌中导入激发所述宿主菌厌氧发酵且与所述宿主菌厌氧代谢正相关的基因，得到的含有所述基因的重组菌。2、根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于所述产氢的宿主菌为兼性厌氧菌或专性厌氧菌。3、根据权利要求2所述的重组菌，其特征在于所述兼性厌氧菌为肠杆菌科(￡nterotec￡&TJ'aceae)菌；所述专性厌氧菌为梭菌属(C2ostrW咖)菌。4、根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于所述肠杆菌科(￡btero^3"er/3ce3e)菌为肠杆菌属(^ofero6scfer)菌或埃希氏菌属(&c力e"'c力is)菌。5、根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于所述梭菌属(C7o对^W勿/ff)菌为类腐败梭菌("。5^rio7鹏parap〃z^rz'/Yc咖)；所述肠杆菌属(￡>2fer。Za"e_r)菌为产气肠杆菌(j&^eroZs"erserc^e/es)。6、根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于所述类腐败梭菌(Go^riW^历parapttrj'/j'c鹏)为类腐败梭菌(C7ostrW咖para;wtrWc鹏)ATCC17796;所述产气肠杆菌(j&^ero力actei"aero《e/2e50为产气肠杆菌(f/26T0Z7acferaeroge"es)IAM1183。7、根据权利要求1-6中任一所述的重组菌，其特征在于所述与所述激发所述宿主菌厌氧发酵且与所述宿主菌厌氧代谢正相关的基因为调节因子FNR或N虹P的编码基因；所述调节因子FNR的氨基酸序列如序列表中序列1所示；所述调节因子NarP的氨基酸序列如序列表中序列3所示。8、根据权利要求7所述的重组菌，其特征在于所述调节因子FNR的编码基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述调节因子NarP的编码基因的核苷酸序列如序列表中序列4所示。9、一种生物制氢的方法，包括如下步骤发酵权利要求1-8中任一所述重组菌，得到氢气。全文摘要本发明公开了一种生物制氢方法及其专用菌。该专用菌是向产氢的宿主菌中导入激发所述宿主菌厌氧发酵且与所述宿主菌厌氧代谢正相关的基因，得到的含有所述基因的重组菌。实验证明，本发明重组菌的产氢能力与对照菌比有了显著的提高。因此，本发明重组菌与生物制氢方法在生物制氢领域中有广阔的应用前景，对节约能源具有重要的意义。文档编号C12N1/21GK101597587SQ200910088408公开日2009年12月9日申请日期2009年6月29日优先权日2009年6月29日发明者元卢,翀张,来奇恒,邢新会申请人:清华大学