专利名称：：一种螺旋霉素发酵工艺的制作方法
技术领域：
：本发明涉及螺旋霉素的发酵工艺优化方法。具体说是通过添加金属离子提高螺旋霉素产量的一种发酵工艺。
背景技术：
：螺旋霉素是由生二链霉菌(Streptomycesambofaciens)所产生的多组分大环内酯类抗生素。螺旋霉素链霉菌生物合成螺旋霉素的过程受许多酶的调控作用。酰基激酶和酰基辅酶A合成酶是螺旋霉素内脂环合成的重要酶。由于合成酶的活性较小，推测其可能是大环合成的"瓶颈"，如果提高其活性，就有可能大幅度提高发酵效价。在发酵前期加入激活因子，乙酸激酶处于初级代谢中，活性提高对次级代谢影响不大，效价提高不明显。在发酵中期加入激活因子，大大提高了参与次级代谢的乙酸激酶和乙酰CoA合成酶的活性，突破了大环合成的限制，从而明显提高了螺旋霉素的发酵效价。毛全贵等人发表在中国抗生素杂志2005年11月第30巻第11期(文索编号1001-8689(2005)11-0647-02)金属离子对螺旋霉素生物合成的影响一文也曾报道过在螺旋霉素产生菌产二素链霉菌(Streptomycesambofaciens)发酵过程中添加012+、Ca2+、Fe2+和Mg2+等无机金属离子，测定不同离子浓度对螺旋霉素发酵水平的影响。研究表明Ci^对螺旋霉素生物合成有较强的抑制作用，C^+对螺旋霉素生物合成影3响不大，Fe2+、Mg^都有明显激活作用，其中Fe"在添加浓度为2.5ug/ml时对螺旋霉素生物合成的促进作用最大，效价比对照组高18.3%;Mg^在浓度为3.0Pg/ml时效果最好，效价比对照组高出11.4%。现有的螺旋霉素的发酵生产只是一些较常规的发酵生产方式，即不添加金属离子的生产工艺，发酵工艺为将冷冻管接种于母瓶种子培养40-48h，子瓶培养24h，一级种子培养23-30h;二级种子培养20-32h;发酵培养100-136h放罐。所存在的突出问题是发酵单位较低，并且费时费力，往往达不到生产化的要求。本申请加入的锰离子相对于现有技术中未加入金属离子相比，发酵单位可提高25%。
发明内容本发明的目的在于提供一种简便的螺旋霉素生产工艺，在发酵过程中通过添加金属离子达到提高螺旋霉素碱单位产量之目的。本发明是通过以下方式来实现在一种实施方案中，本发明提供了一种生产螺旋霉素碱的发酵工艺，所述工艺包括螺旋霉素产生菌采取种子培养和发酵过程，其特征在于在发酵过程中，添加锰离子的水溶液，使得发酵罐锰离子的浓度为15-40mM。在本发明中使用的发酵培养基重量配比为淀粉10~15%，黄豆饼粉12%，玉米浆2~3%，磷酸二氢钾0.010.02%，氯化钠11.5%，碳酸钙11.2%，豆油0.5~0.8%。在本发明更进一步的技术方案中，发酵工艺包括将冷冻管接种于母瓶培养基，在27士0.5。C下培养40-48h，摇床转速220—240转/分；按6Q^接种量接种子瓶培养基，在27i0.5"C下培养24h，转速220-240转/分；当发酵进行到40小时左右时加入含有锰离子的溶液。优选锰离子的浓度为15-40mM。优选锰离子源为四水氯化锰。在本发明进一步的方法中，涉及工业化生产螺旋霉素的方法，其特征在于所述方法包括将冷冻管接种于母瓶培养基，在27士0.5'C下培养40-48h，摇床转速220-240转/分；按6%接种量接种子瓶培养基，在27士0.5。C下发酵24h，转速220—240转/分；按10%接种量接种于一级种子罐中进行发酵，在25-28.5'C下培养23-30h;按10。％移种量接种于二级种子罐中进行发酵，在20-28"C下培养20-32h;最后，按IO%移种量接种于发酵罐中进行发酵，在24-28.5。C下培养100-136h，当发酵进行到40小时时左右，添加锰离子的水溶液，使得发酵液中的锰离子浓度为15-40mM，最终获得螺旋霉素，其发酵单位可提高大约25%。在上述实施方案中，优选发酵装置为100m3不锈钢罐，转速的优选范围120140转/分，罐压的优选范围0.010.04MPa，风量的优选范围15002000mVh。本发明与现有技术相比，具有如下特点(1)发酵水平高，已明显超过原工艺的水平。(2)对组分没有影响。(3)操作简单。(4)成本低，便于大规模生可以看出这种方法有效地克服了国内现有生产螺旋霉素碱工艺的不足，适合大规模工业生产的需要。具体实施例方式下面通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明实施例的制备方法仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下，类似的制备方法都属于本发明要求保护的范围。除非另有说明，本发明中的百分数是重量百分数，另外，本发明说明书中的(w/w)是指重量比或者重量比浓度，(v/v)是指体积比或者体积比浓度，W/V是指重量与体积的比例(例如，克/毫升，g/ml或者千克/升)。实施例1、2、3为摇瓶实验，是将斜面种子转接摇瓶种子培养基扩大培养，在摇瓶中进行发酵；实施例4、5和6为放大试验，种子经一级、二级种子罐扩大培养而来，在1001113发酵罐中进行发酵。实施例1将斜面(即菌种)接种于摇瓶种子培养基中，在27t:下培养48h，摇床转速220r/min;按6%接种量接入摇瓶发酵培养基中，转速为220r/min，在27。C下，旋转式摇床培养96h。发酵培养基按常规方法配制(发酵培养基淀粉、磷酸二氢钾、氯化钠、硝酸铵、碳酸钙、玉米浆、豆油，其比例为淀粉10~15%，黄豆饼粉12%，玉米浆23%，磷酸二氢钾0.010.02%，氯化钠11.5%，碳酸f丐11.2%，豆油0.50.8%)，当发酵进行到35小时时，一次性投入含一定量锰离子的四氯化锰水溶液与发酵液中，使得投入到发酵摇瓶中的锰离子浓度为30mM。实施例2如实施例1的方法，当发酵进行到40小时时一次性投入含一定量锰离子的水溶液与发酵液中，此时投入到发酵摇瓶中的锰离子浓度为35mM。实施例3如实施例1的方法，当发酵进行到45小时时一次性投入含一定量锰离子的水溶液到发酵液中，此时发酵摇瓶中的锰离子浓度为40mM。表l.锰离子添加工艺在摇瓶上的实验结果没有添加过Mr^+摇瓶对照Mr^+添加浓度(mM)Mn2+摇瓶对照<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>效价与螺旋霉素的含量相对应，而效价的高低是评价发酵水平的标志。按干燥品计算:每lmg螺旋霉素相当于卯0螺旋霉素的效价单位。由此可见，在上述发酵过程中，加入锰离子之后显著提高了螺旋霉素的含量。实施例4如实施例l的方法，按6%接种量接入摇瓶发酵培养基中，转速为220r/min，在27。C下，旋转式摇床培养27h。按10%接种量接种于lm3—级种子罐中进行发酵，25-28.5'C培养23-30h;按10%移种量接种于101113二级种子罐中进行发酵，20-28"C培养20-32h;按10%移种量接种于100m3发酵罐中进行发酵，24-28.5'C培养100-136h。当发酵进行到35小时一次性投入含一定量锰离子的水溶液(四氯化锰水溶液)与发酵液中，使得此时投入到发酵摇瓶中的锰离子浓度为30mM。实施例5如实施例4的方法，当发酵进行到40小时时一次性投入含一定量锰离子的水溶液与发酵液中，此时投入到发酵摇瓶中的锰离子浓度为35mM。实施例6如实施例4的方法，当发酵进行到45小时时一次性投入含一定量锰离子的水溶液与发酵液中，此时投入到发酵摇瓶中的锰离子浓度为35mM。表2.锰离子添加工艺在1001113发酵罐上的实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>从上表可以看出在100m3发酵罐上试验，发酵前期(40小时左右)加入锰离子浓度为15-40mM，加入锰离子的发酵单位比对照高出大约25.0%。权利要求1.一种添加金属离子提高螺旋霉素碱产量的发酵工艺，发酵工艺为将冷冻管接种于母瓶培养基，27±0.5℃培养40-48h，转速220--240转/分；按6％接种量转接子瓶培养基，27±0.5℃培养24h，转速220--240转/分；按10％接种量接种于一级种子罐中进行发酵，25-28.5℃培养23-30h；按10％移种量接种于二级种子罐中进行发酵，20-28℃培养20-32h；按10％移种量接种于发酵罐中进行发酵，24-28.5℃培养100-136h；其特征在于在发酵的过程中，添加锰离子的水溶液，使得发酵液中锰离子的浓度为15-40mM。2.如权利要求l所述的发酵工艺，其特征在于，当发酵进行到40小时左右时，添加锰离子的水溶液，使得发酵液中的锰离子浓度为15-40mM。全文摘要一种添加金属离子提高螺旋霉素碱产量的发酵工艺。本发明是在按常规方法配置发酵培养基后，添加一定量的锰离子溶液，用本发明所建立的发酵工艺进行螺旋霉素碱的发酵水平已明显超过原工艺的水平，不仅效价高，而且操作简单成本低，便于大规模生产，有效地克服了现有发酵方法的不足，并为下一阶段的工业产业化的实现奠定了良好基础。文档编号C12P19/62GK101497907SQ200910118920公开日2009年8月5日申请日期2009年3月6日优先权日2009年3月6日发明者唐慧慧,孔德周,李武德,李翠平,毛全贵,焦国华,伟王,祝立新申请人:河南天方药业股份有限公司