专利名称：显示作为除虫菊酯生物合成酶的活性的蛋白质、编码该蛋白质的基因和整合有该基因的载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及显示作为除虫菊酯生物合成酶的活性的蛋白质、编码该蛋白质的基因和整合有该基因的载体。
背景技术：
除虫菊所含的次级代谢产物除虫菊酯，具有对昆虫显示优异的杀虫活性、另一方面对哺乳动物毒性低这样的作为杀虫成分理想的优点，故而在驱蚊线香、喷雾剂、粉剂等中被广泛使用。虽然近年随着合成拟除虫菊酯惊人发展，对除虫菊酯的需要减少，但是作为来自植物的对环境温和的杀虫剂原料，现在其利用价值仍然较高，故而为了廉价且高效地获得除虫菊酯的研究还在继续。特别是由于作为合成拟除虫菊酯的原材料的石油价格急剧上涨等，上述次级代谢产物除虫菊酯的存在价值重新受到重视。
但是，除虫菊酯主要从除虫菊的花部提取，除虫菊在开花之前的生长
时间极长，约3年。因此，作为使除虫菊酯生产效率化的方法，除了挑选、育种除虫菊的除虫菊酯高生产抹之外，认为促进同种或异种植物细胞中的除虫菊酯生物合成是有效的。
除虫菊酯具有作为单薛羧酸的菊酸与作为脂肪酸氧化代谢物的除虫菊醇酮类(醇)以酯键结合的结构(图3)，人们知道在其生物合成中，菊酸和除虫菊醇酮类分别通过不同的代谢途径生物合成，最后在两者之间形成酯键。
作为高效地进行上述除虫菊酯的生物合成的方法，可列举利用与其生物合成相关的基因的方法，在利用这些基因进行除虫菊酯生物合成时，该基因的分离和鉴定是不可缺少的。但是，植物细胞生产的各种酯化合物，是以羧酸的辅酶A(CoA)硫酯体(酰基CoA、 RCO-S-CoA)和醇(R，-OH)作为底物，通过酰基转移酶而生物合成的(图4)，且它们的生物合成例如记载在非专利文献1和非专利文献2中。
推测作为这样的酰基转移酶，在除虫菊酯的生物合成中存在以菊酰CoA或拟除虫菊酰CoA和除虫菊醇酮类为底物的菊酰/拟除虫菊酰基转移酶(除虫菊酯生物合成酶)(图5)，但到目前为止没有作为基于M酸序列的具体构成而被分离，更何况对于编码基于该氨基,列的蛋白质的基因，当然也没有特别探求。
另外，专利文献1公开了能够对作为除虫菊酯的化学合成的原材料使用的菊基二磷酸生成进行催化的菊基二磷酸合酶(synthase)等酶的氨基*列，以及将基于该氨基^列的蛋白质编码化的基因序列，但对于能够进行上述除虫菊酯的生物合成的酶自身的氨基酸序列和编码基于该氨基酸序列的蛋白质的基因，并没有任何公开和暗示。正如由这样的现有技术的状况明确的那样，对于特别指定除虫菊酯的生物合成所涉及的酶，然后阐明编码该酶蛋白质的基因，从而基于基因工程学上的知识来进行除虫菊酯的有效生物合成，尚未阐明。
专利文献l:特表平9-504684
非专利文献1: R. Kalscheuer and A. Steinbuchel， A novel bifunctionalwax ester synthase/acyl-CoA:diacylglycero1 acyltransferase mediates waxester and triacylglycerol biosynthesis in Acinetobacter calcoaceticus ADP1.丄Biol. Chem. 278:8075-8082 (2003)
^,专禾'文献2: J. Luo等，Convergent evolution in the BAHD family ofacyl transferases: identification and characterization of anthocyanin acyltransferases from Arabidopsis thaliana. 50:678-695 (2007)
发明内容
本发明的目的是提供通过确定与除虫菊酯的生物合成相关的酶的氨基酸序列、及其基因的碱基序列，制作整合有该基因的载体、转化体，并将这些制作技术应用于生长较快的植物，从而高效地生成除虫菊酯的方法。
在解决上述课题时，本发明者们如下所述，以除虫菊花为原材料，以除虫菊酯I生成活性为指标进行蛋白质粗分级，并利用使用疏水性树脂的分批法来完成粗纯化，然后通过利用规定组合的色镨法来进行纯化，从而得到与除虫菊酯生成相关的酶蛋白质，然后进行该蛋白质的内部g,列和氨基末端序列分析。使用以通过上述分析而明确的部分氨基酸序列为
基础制作的简并引物，以从除虫菊花部得到的cDNA文库为模板进行RACE-PCR，从而扩增出序列未知部分的多核苷酸片段。
通过用DNA测序仪分析扩增的多核苷酸片段的碱基序列，从而确定包含图2所示的序列号、即序列号5的碱基序列的除虫菊酯生物合成酶的全长基因的碱基序列，以及由该基因编码的图l(a)所示的序列、即序列号l的氨基,列，以这冲羊的确定为基f出，从而完成本发明。
本发明采用下述构成。
(1) 一种除虫菊酯生物合成酶，是通过下述操作生成的分子量约40000的蛋白质，所述操作是以从除虫菊花制备的粗酶溶液为原料，使用(lR)-反式菊酰辅酶A ((1R)-trans-Chrysanthemoyl-CoA)和(S)-除虫菊醇酮((S)-Pyrethrolone)作为检测有无除虫菊酯合成酶活性功能的底物，通过利用硫酸沉淀进行的蛋白质粗分级来得到沉淀物，然后对该沉淀物利用使用疏水性树脂的分批法来进行粗纯化，对上述粗纯化所得的酶溶液，依次进行利用离子交换色谱法进行的纯化、利用疏7jC作用色谱法进行的纯化、通过凝胶过滤进行的纯化的各工序。
(2) 下述(i)或(ii)的蛋白质，是可以从能生成除虫菊酯的植物体内提取的酶，
(i) 包含序列号1所示的Mi^列的蛋白质，
(ii) 包含对序列号1所示的M酸序列置换、缺失、插入、和/或添加1个或多个氨基酸而得到的M酸序列、且显示作为除虫菊酯生物合成酶的活性的蛋白质。
6(3) —种蛋白质，是可以从能生成除虫菊酯的植物体内提取的酶，是 包含序列号2所示的M酸序列的蛋白质或包含序列号3所示的M^ 列的蛋白质或包含序列号4所示的M酸序列的蛋白质。
(4) 一种基因，编码下述(i)或(ii)的蛋白质，所述蛋白质是可以从能生 成除虫菊酯的植物体内提取的酶，
(i) 包含序列号1所示的M酸序列的蛋白质，
(ii) 包含对序列号1所示的M酸序列置换、缺失、插入、和/或添加 1个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列、且显示作为除虫菊酯生物合成酶 的活性的蛋白质。
(5) 根据(4)所述的基因，编码(i)的蛋白质，且包含序列号5所示的碱 基序列。
(6) 根据(5)所述的基因，含有序列号5所示的碱基序列的第85位~第 1179位的碱基序列作为开放式阅读框。
(7) —种基因，编码包含序列号2所示的氨基i^列的蛋白质、包含 序列号3所示的M酸序列的蛋白质或包含序列号4所示的氨基酸序列的 蛋白质的任一种，所迷蛋白质是可以从能生成除虫菊酯的植物体内提取的 酶。
(8) —种栽体，整合有(4) (7)的任一项所迷的基因。 本发明公开了与除虫菊酯的生物合成相关的酶的M酸序列、及其基
因的碱基序列，从而导出可以介由生长较快的植物来廉价且有效地生产作 为杀虫剂原料有用且安全性高的除虫菊酯的展望，显示了可以对杀虫剂产 业作出较大贡献的可能性。
图1表示本发明所涉及的除虫菊酯生物合成酶的氨基酸序列的具体 例，(a)表示从除虫菊的花得到的酶的典型例，(b)表示相对于(a)的JL^, 列移动性的信号序列缺失的具体例，(c)、 (d)表示相对于(a)的序列进一步添 加了移动性的信号序列的氨基酸序列(此外，(c)、 (d)的加下划线部分表示在(a)的序列上添加的部分)。
如实施方式项中说明的那样，图l(a)是表示氨基酸序列1所示的M ^列的图，图1(b)是表示M^列2所示的M^列的图，图l(c) 是表示序列号3所示的氨基酸序列的图，图l(d)是表示序列号4所示的氨 基酸序列的图。
图2表示编码基于图1(a)的氨基i^列的蛋白质的基因的序列，是表 示序列号5所示的g序列的图。
图3是具体地表示除虫菊酯类的结构由菊酸部侧链(R,)与除虫菊醇酮
部側链(R2)构成的化学结构式和一览表。
图4是表示植物细胞中的酯化合物以羧酸的CoA硫酯体(酰基CoA、 RCO-S-CoA)和醇(R，-OH)为底物通过酰基转移酶催化来生物合成的化学 反应的通式。
图5是表示以菊酰转移酶为催化剂的除虫菊酯生物合成反应的具体例 的化学反应式。
图6表示实施例1的利用HPLC测定除虫菊酯生物合成酶活性的情况 的曲线图，(a)表示在蛋白质生成阶段不产生酶活性的情况，(b)表示产生上 述酶活性的情况。
图7是显示实施例1中，从除虫菊的花制得酶的流程的一览表。
图8是实施例1中为了确认制得的除虫菊酯生物合成酶的纯度而明确 分子量特定程度的电泳(SDS-PAGE)照片。
图9是实施例1中对构成除虫菊酯生物合成酶蛋白质的氨基酸的各部 分进行分析而得的部分氨基酸序列的序列例，(a)是表示^酸序列6所示 的氨基亂亭列的图，(b)是表示氨基i^列7所示的氨基l亭列的图，(c) 是表示氨基酸序列8所示的M酸序列的图。
具体实施例方式
对于本发明中的基于除虫菊酯生物合成酶的提取分离的氨基酸序列、 及其基因的碱基序列的确定流程的过程、以及整合有基于这样确定的g序列的基因的载体、进而导入有该载体的转化体的应用，说明如下，但是
上述(1) (8)的各构成并不限于如下的实施方式，也包括可以从该实施方式 容易地置换和想到的实施方式。
在以下(a) (d)的顺序的各工序的实施方式之前，必须确保构成除虫菊 酯生物合成酶的蛋白质。
本发明者们以从除虫菊花制备的粗酶溶液为原料，使用(1 R)-反式菊酰 辅酶 A ((1R)-trans-Chrysanthemoyl-CoA)和(S)-除虫菊醇酮 ((S)-Pyrethrolone)作为检测有无除虫菊酯合成酶活性功能的底物，以除虫 菊酯I生成活性为指标，进行该除虫菊酯生物合成酶的分级和纯化。即， 如上述(l)那样，按照通过硫酸铵沉淀进行蛋白质粗分级、利用使用疏水性 树脂的分批法进行粗纯化、通过疏水性色i普法进行纯化、通过离子交换色 谱法进行纯化、通过凝胶过滤柱进行纯化的顺序，进行分级、粗纯化、纯 化，在这些各阶段中，对上述底物进行酶反应，将可以评价为具有除虫菊 酯合成酶活性的纯化级分分级了的酶进行SDS-PAGE电泳，结果可以确认 被认为能够作为酶对酯化反应发挥作用的分子量约40,000的蛋白质的带 (band)(图8)。
可以将通过上述带确认而得的蛋白质转印至PVDF膜，从而确保得到 的除虫菊酯生成酶蛋白质。
此外，直至上述带确认的具体工艺，如下述实施例l所述。
(a) 酶蛋白质的部分M酸序列的分析
将如上所述确保的纯化酶用胰蛋白酶(蛋白质分解酶)消化而片段化成 肽。然后，用HPLC分离消化后的肽片段，将该肽用埃德曼(Edman)法从 氨基末端侧开始1个残基1个残基地分离分解。
通过用HPLC分析生成的苯乙内酰硫脲衍生物来分析氨基酸残基。使 用将该反应分析重复自动化了的专用分析仪器(肽测序仪)来进行。
这样，可以获得构成除虫菊酯生物合成酶蛋白质的部分M,列。
(b) 引物的设计和全长cDNA碱基序列的确定
将通过分析而明确的氨基酸序列换成碱基序列，基于该序列设计简并
9引物。
通过使用上述引物(例如，4个位置的简并引物)采用PCR(聚合^反 应，Polymerase Chain Reaction),从而确定已知序列;波此之间所夹的未知 碱基序列。
接着，预先在作为PCR的底物的DNA上添加作为接头的多核苷酸，
行RACE-PCR,扩增包含两末端的序列的DNA片段，用DNA测序仪分 析该DNA片段从而确定全碱基序列。
这样确定的除虫菊酯生物合成酶的全碱基序列如上述(5)所述，如图2 的序列、即序列号5所示。此外，序列号5的全碱基序列如上述(6)所述， 其特征在于，含有第85位~第1179位的碱基序列作为开放式阅读框。此 夕卜，序列号5的全^序列不仅可以通过采用如上所述的PCR来实现，还 可以通过对如上所述转印到PVDF膜上的酶蛋白质进行免疫筛选法、使用 核酸探针的杂交法等其它基因检测法来实现。
(c)全长M酸序列的确定
对应于上述序列号5的碱基序列，来确定由该基因编码的蛋白质的氨 基酸序列。
通过本发明确定的除虫菊酯生物合成酶的氨基酸序列如上述(2)所述， 如图1的序列、即序列号1所示。
即使是对序列号l所示的g酸序列置换、缺失、插入、和/或添加了 1个或数个氨基酸的氨基酸序列，也可以从含有除虫菊酯生物合成酶的植 物中通过与序列号1所示的M酸序列的情况相同的方法和工序来提取， 且只要是显示作为除虫菊酯生物合成酶的活性的蛋白质，就可以与序列号 1所示的酶蛋白质同样地发挥功能，就包含在本发明的除虫菊酯生物合成 酶所涉及的蛋白质中。进而，如上述(3)所述，下述序列的氨基酸也相当于 作为本发明的除虫菊酯生物合成酵的蛋白质。
,图1(b)所示的序列号2所表示的序列从序列号1所示的氨基^ 列中除去移动性信号序列(N末端~第27位的丝氨酸(S)残基的部分)后的氨
10基酸序列。
.图l(c)所示的序列号3所表示的序列在大肠杆菌中表达时，添加 到组氨酸标签和接头序列的C末端侧的氨基酸序列。
-图1(d)所示的序列号4所表示的序列在大肠杆菌中作为谷胱甘肽 S转移酶(GST)融合蛋白质表达时，添加在GST序列的N末端的氨基* 列。
序列号2所示M酸序列如下述实施例1所述，是从除虫菊的花提取 的，当然可以纯化。序列号3和序列号4所示的M酸序列的酶，是在将 整合有序列号1所示的氨基酸序列的载体导入大肠杆菌之后，通过在大肠 杆菌内表达而获得的，但在可以以大肠杆菌为宿主表达的情况下，即使在 能够生成除虫菊酯的植物体内，作为除虫菊酯生物合成酶而实际地存在的 可能性也极强，在实际存在的情况下，当然可以通过与序列号2的序列的 ^J^酸相同的方法和工序从上述植物体内提取、并纯化。
既然不仅是序列号1所示的M酸序列的蛋白质，上述(2)的^# 列所形成的具有作为除虫菊酯生物合成的活性的蛋白质，作为发挥与该蛋 白质相同的功能、且能够生成的蛋白质，也包括在本发明的技术概念中， 并成为其对象，那么本发明所涉及的基因就不仅是编码序列号1所示的氨 基酸序列的上述(4)的基因，编码上述(2)的蛋白质的上述(5)、 (6)的基因也 必然归于本发明的技术概念所包括的范围。进而，编码上述(3)的包含序列 号2、 3、 4的^i^酸序列的蛋白质的上述(7)的基因也包括在本发明的技术 概念中。
基于已知蛋白质的氨基酸序列的数据库检索序列号1的相似序列，结 果该序列并不是预料的已知酰基转移酶，几种GDSL基序(motif)脂肪酶与 该^J^酸序列相似。由此认为，上述(2)、 (3)的作为除虫菊酯生物合成酶的 蛋白质是GDSL基序脂肪酶的亲缘蛋白质。
为了确认如上述(4)、 (5)、 (6)、 (7)那样的除虫菊酯生物合成酶基因的 生物合成活性，例如可以先将这些基因插入载体DNA，然后将其导入大肠 杆菌，在大肠杆菌内作为组氨酸标签融合蛋白质表达除虫菊酯生物合成酶，表达的除虫菊酯生物合成酶通过Ni-NTA亲和色镨法来纯化，使用(lR)-反 式菊酰CoA和(S)-除虫菊酮醇作为底物，以除虫菊酯I生成活性为指标， 进行活性评价。
(d)栽体的生成和导入有该载体的转化体
上述(8)的载体是通过整合上述(4)、 (5)、 (6)、 (7)的任一种基因而生成 的，显示作为除虫菊酯生物合成酶的活性。上述载体可以通过用周知的转 化方法导入植物、微生物等宿主使之可以表达，从而在该宿主中表达整合 基因或基因片段。
另外，所谓导入有上述(8)的栽体的转化体，是宿主中导入有除虫菊酯 生物合成相关基因、或其基因片段的转化体。这里，所谓"导入栽体"， 意味着通过周知的基因工程学方法将整合在载体内的基因导入宿主内使之 可以表达。
作为基因的导入方法，可列举例如，利用衣杆菌的转化法、基因枪法、 微注射法、电穿孔法等，但不特别限制。
在利用农杆菌的转化法中，将该基因整合到Ti质粒载体中，导入农杆 菌，然后感染适当的植物。在基因导入部位形成肿瘤(冠瘿)，对由除菌之 后的冠瘿再生而得的大量植物体评价活性，挑选除虫菊酯生物合成酶高表 达才直物体即可。
这样的转化体可以在自身的体内表达除虫菊酯生物合成相关基因。因 此，如果以植物、蓝藻类、酵母类或大肠杆菌等细菌类等的细菌细胞中的 染色体和/或叶绿体为宿主，制作导入了含有能够大量表达的启动子的上述 (8)的载体的转化体，则作为结果可以大量生产除虫菊酯生物合成酶。
因为上述载体是来自除虫菊的除虫菊酯生物合成酶的基因(或基因片 段)，所以作为上述转化体中的宿主，优选植物的染色体和/或叶绿体，特 别是更优选与除虫菊为同种类的菊科植物的染色体和/或叶绿体。作为这样 的菊科植物，可以例示万寿菊、非洲万寿菊、金盏菊、百曰草等，但并不 限于这些。
上述植物不仅包括完整的植物体，还包括其一部分，例如，叶、种子、
12块茎、插条等。进而，上述植物还包括以预先经转化过的基因重组植物、 其后代为来源的植物组织、原生质体、细胞、愈合組织、器官、植物种子、 胚芽、花粉、卵细胞、合子等可以繁殖的植物材料(包括花、茎、实、叶、 根等的植物的一部分)等。
使用上述(2)的蛋白质和上述转化体的任一者，可以生产除虫菊酯，本 发明提供这样的除虫菊酯的生产方法。根据该方法，介由生长明显比除虫 菊迅速的上述菊科的各植物或其它植物，可以有效且简便地生产除虫菊酉旨， 可以对要求安全且对环境温和的杀虫剂的社会需求做出巨大贡献。
以下，基于实施例具体详细地说明本发明的内容。 实施例1
为了进行上述(a)的氨基酸序列分析，按照图7所示的流程从除虫菊的 花纯化酶。
对于详细情况如以下iJL明。
纯化时使用的緩沖液的组成
如表1 ~表6所示。表1J
緩冲液A成分浓度(mM)
Tris-HCI pH8.050
EDTA1
DTT5
抗坏血酸钠100
PMSF2
l表2緩冲液B成分浓度(mM)
Tris-HCl pH8.020
EDTA1
DTT表31
緩冲液c_
成分_ 浓度(mM)
Tris-HCl pH8.0 EDTA DTT NaCl
1表41
緩沖液D
成分_ 浓度(mM)
Tris-HCl p朋.O EDTA DTT NaCl
表5j
緩沖液E 成成分 浓度mM)
Tris-HCl pH8.0 EDTA DTT
(NH"2SO4
l表6
20 5
500
20 5
150
20
5
400緩冲液F
成分浓度 (mM)
Tris-HCI pH8.050
EDTA1
DTT5
抗坏血酸钠100
(NH4)2S041000
除虫菊酯合成酶反应
在各纯化阶段进行酶反应，对于纯化级分评价除虫菊酯合成酶活性。
反应利用下表7所示的反应组成在25。C进行1小时。在酶反应之后，在反 应液中加入200fU己烷，分液而回收有右l4目，将其中的10nl进行HPLC分 析。 l表71
除虫菊酯合成酶反应组成
体积(y 1)浓度(mM)
酶溶液20
(1R)-反式菊酰CoA(10mM水溶液)100,5
(S)-除虫菊醇酮(20mM DMSO溶液)41
250mMTris-HCl(pH7.5), ImM EDTA4050
水126
总体积200
通过HPLC测定除虫菊酯合成酶活性
HPLC分析使用SHIMADZU SCL-10A VP(程序装置)、DGU-14A(脱 气装置)、LC-6AD(泵)、CTO-10AS VP(样品注入装置、柱恒温槽)、 SPD-10AV VP(光学检测器)，用CLASS-VP进行数据处理。柱使用 IMTAKT制的Cadenza C-18 (0.46 cm^xlO cm),在40。C、流速1 ml/分钟 的条件下测定230 nm的吸收。移动相使用乙腈:H2 0(65:35)。
将其结果的一例示于图6(a) (b)。(a)是在蛋白纯化阶段未发现酶活性的 级分的HPLC分析结果，(b)是发现酶活性的级分的HPLC分析结果。如 同图所示，在分级的溶液中存在酶的情况下，随着反应时间的经过，发现显示4.9分钟的保留时间的除虫菊酯I的峰。
4a酶的制备
使用500g除虫菊的花蕾按照以下流程制备粗酶液。在除虫菊花蕾中加 入经过冰冷却的1.5L的緩冲液A和聚乙烯吡咯烷酮(緩沖液A的1/10倍 (w/v)量)，用混合器进行破碎。将破碎物用重叠成4层的纱布过滤，将滤液 在8000xg、 4。C的条件下离心20分钟。收集上清液，加入100mL的 DOWEX(lx4 100-200 CI FORM)(厶口7^亍夕乂7)，用搅拌器搅拌10 分钟，然后在8000xg、 4。C的条件下离心20分钟。回收上清液，以此作为 粗酶液，进一步进行纯化。
通过;危酸铵沉淀进行分级
将上述制备而得的粗酶液用搅拌器搅拌，同时一点一点地加入预先使 用研钵和研杵磨碎的硫酸铵，使之溶解至30%饱和。静置30分钟之后， 以8000xg的加速度(g表示重力加速度)在4。C下离心20分钟。回收上清， 加入硫酸铵至80%饱和。静置一夜之后，在8000xg、 4。C的条件下离心20 分钟，从而得到酶级分的沉淀物。
利用l吏用疏水性树脂的分批法进行粗纯化
将通过上述分级得到的沉淀物悬浮在緩冲液F中，加入Phenyl Sepharose (苯基琼脂糖凝胶)(GE Healthcare)，用搅拌器搅拌30分钟， 然后^f吏用布氏漏斗滤出。将残留在布氏漏斗中的Phenyl S印harose用 500mL的緩沖液F洗涤，然后使用500mL的緩冲液B洗脱吸附在树脂上 的蛋白质。回收洗脱液，加入硫酸铵至1M，加入20mL的Phenyl S印harose (GE Healthcare),用搅拌器搅拌30分钟，然后加入Econo-Column柱(Bio Rad)进行稳定化，然后使用50mL的緩沖液B洗脱吸附在树脂上的蛋白质。 将洗脱液"透析用玻璃纸管，在2L的脱盐緩冲液中使用搅拌器搅拌的 同时脱盐2小时。然后，交换緩冲液，继续脱盐3小时。脱盐后的酶液接 着使用AKTA explorer (GE Healthcare)系统通过柱色镨法进一步进行纯 化。
通过阴离子交换色语法进行纯化对上述利用分批法进行粗纯化而得的酶液，进一步使用Q Sepharose 柱通过阴离子交换色镨法在以下条件下进行酶液的纯化。 [表8
通过疏水性色语法进行纯化
对上述通过利用阴离子交换色语法进行的纯化而得的酶液，使用 Phenyl Superose柱通过疏水性色谱法在以下条件下进行酶液的纯化。 [表9
通过凝胶过滤进行纯化
对上述通过利用疏水作用色镨法进行的纯化而得的酶液，使用 Superdex75柱，在以下条件下进行凝胶过滤。
l表10j___
系统 AKTA explorer 10秒
柱 Superdex 75 HR 10/30 (GE Healthcare)
使用緩冲液 緩冲液D
样品 通过Phenyl Superose纯化的活性级分
流速 0.5mL/分钟
级分 0.5mL/管
系统 AKTA explorer 10秒
柱 HiPr印TM 16/10 Q FF (GE Healthcare)
泵A 緩冲液B 泵B 緩冲液C 平衡化 (A) 100%
通过Phenyl Sepharose进行分批次处理之后的脱盐之后的酶液
(A) 100% 100mL
(B) 0-100 。/。在400mL中 4mL/分钟 10mL/管
AKTA explorer 10秒
Phenyl Superose FPLC (GE Healthcare)
緩冲液E
緩冲液B
(A) 100% 10mL
通过阴离子色谱法纯化的酶液
(A) 100 %
(B) 0-100 %在20mL中 0.4mL/分钟
2mL/管
品洗脱速分
样清洗流级
化
统 A B衡品洗脱速分
系柱泵泵平样清洗流级
17将用上述方法纯化的酶用SDS-PAGE分离，然后进行^l艮染色，从而确 认酶纯度。其结果是检测得到图8所示的、分子量约40000的来自除虫菊 酯合成酶的单一的蛋白质带。 实施例2
关于实施例1所得的除虫菊酯合成酶的上述(a) (d)的部分氨基酸序 列的分析~全长氨基酸序列的确定的实施情况、以及关于导入了整合有编 码基于该M酸序列的蛋白质的基因的载体的转化体的实施情况如下。
关于构成除虫菊酯生物合成酶蛋白质的氨基酸的各部分的分析
将实施例1所得到的蛋白质带从凝胶切下，作为内部氨基酸序列分析 用样品。另外，在SDS-PAGE之后转印到PVDF膜上，通过考马斯染色 (Coomassie Stain)检测带，然后切下带的部分，进行N末端氨基酸分析。 这一 系列搮作基于周知的方法进行。
上述氨基酸分析的结果是，作为构成酶蛋白质的部分M酸序列，可 以确认图9(a)、 (b)、 (c)中名"亭列例6、 7、 8所示那样的序列例。
引物的设计、和全长cDNA碱基序列的确定
以通过氨基酸分析而明确的M酸序列为基础，按照上述方法，确定 全长cDNA碱基序列(图2、序列号5)、 M^列(图1:序列号1)。这一 系列操作中，cDNA制备、PCR、用DNA测序仪分析碱基序列按照周知的 方法进行。
全长氨基酸序列的确定
通过分析而明确的除虫菊酯合成酶的N末端^J^酸序列如图l(b)的序 列、即序列号2所示，是从序列号1的g酸序列除去N末端 第27位 的丝氨酸(S)残基的部分后的序列。而且，如上所迷，除去后产生的序列号 2所示的Jl^酸序列相当于除虫菊中具有酶活性的蛋白质序列，另一方面 被除去的27个氨基酸残基是移动性信号序列，发挥形成适宜的除虫菊酯生 物合成条件这样的功能。因此，具有上述27个氨基酸残基的图l(a)的序列、 即序列号1的氨基酸序列，相当于还包括这样的移动性信号序列的除虫菊酯生物合成酶。
此外，通过将整合有编码基于序列号1的M酸序列的蛋白质的基因
的栽体导入大肠杆菌、从而大量表达而得的包含序列号3、 4的序列所示的 氨基酸序列的蛋白质，具有作为除虫菊酯生物合成酶的活性，且在能够生 成除虫菊酯的植物体内存在的可能性极高，对此，如实施方式的(c)中所指 出。
载体和转化体的制作
关于通过导入上述除虫菊酯合成酶基因来制作载体和转化体的实施情 况:i口下。
作为可以在本发明中使用的载体，可列举一直以来在微生物、植物、 植物细胞等的转化中使用的载体。而且，根据已经实施的公知技术可以充 分预测上述载体除了上述全长基因中编码上述除虫菊酯生物合成酶的部 分之外，还可以含有用于表达现在已知的基因的恒定表达型或表达控制型 启动子，使表达的蛋白质易于可溶化、纯化的组氨酸标签和谷胱甘肽-S-转 移酶，麦芽糖结合蛋白质等融合蛋白质，使挑选转化体容易的抗药性基因， 用于使用农杆菌的双元载体系的复制起点等。
具体地说，在导入大肠杆菌等微生物时，可以使用pET载体(Novagen)、 pGEX载体(GE Healthcare)、 pMAL载体(New England Biolab)等。在导 入植物细胞的情况下，作为适合通过农杆菌导入的载体，可以列举pBI101、 pBI121等。在企图使用电穿孔法、基因枪法导入植物细胞的情况下，对载 体不特别限制。另外，作为上述抗药性基因，可以列举氨千青霉素抗性基 因、卡那霉素抗性基因、潮霉素抗性基因等。作为上述启动子，可以使用 来自花椰菜花叶病毒的35S启动子(恒定表达型)、热休克诱导蛋白质的启 动子(表达控制型)。作为复制起点，可以列举来自Ti或Ri质粒的复制起 点等，可以充分预测，制作这些转化体时，可以基于已经被实施的周知方 法来进4亍。
如果使用大肠杆菌、酵母等微生物来制作上述转化体，可以使用微生 物细胞系来进行物质转换。另外，可以通过使用已知能合成实用以下、少量的除虫菊酯的非洲万寿菊、金盏菊、百日草等菊科植物体制作上述转化 体，提高除虫菊酯合成能力，从而使得比除虫菊生长快的植物中的除虫菊 酯能够有效地生产，因此在杀虫剂生产中是有用的。
工业可利用性
本发明可以在以拟除虫菊酯作为杀虫剂的所有产业领域使用，所述领 域具体地说是驱蚊和蝇的线香、杀虫剂喷雾器、杀虫、 口热蒸散装置、电 热垫杀虫装置等以拟除虫菊酯为有效成分的杀虫用器具和装置的领域。序列表
<110>人日本除虫菊株式会社 <110>学校法人近畿大学
<120>显示作为除虫菊酯生物合成酶的活性的蛋白质、编码该蛋白质的基闲、整合有该基闪的载体、转化 体、利用所述蛋白质和所述转化体生产除虫菊酯的方法
<160> 8
<170> Patentboy版本3. 41
<210> 1
<2]1> 365
<212〉 PRT <213>除虫菊
<400> 1
MetAlaValAlaSerSerLysArgGlyAla匕euVal匕euVal Ala
151015
ValLeuCysLeuSer 20LeuProThrGlyCys 25匕euSerSerGin Gin 30
AlaAlaAla匕euPhe 3511 ePheGlyAspSer 40ValPheAspPro Gly 45
AsnAsnAsnHis1 le 50AsnThrHisValAsn 55Phe匕ysAlaAsn Phe 60
TrpProTyrGlyGin 65SerTyrPheSerSer 70ProThrGlyArg Phe 75
SerAspGlyArglie 801 leProAspPhelie 85AlaGluTyrAla Ser 90
LeuPro1 leliePro 95AlaTyrl_euGluPro 100AsnAsnAspPhe Thr 105
HisGlyAlaAsnPhe 110AlaSerAlaGlyAla 115GlyAlaLeulie Ala 120
SerHisAlaGly匕eu 125AlaValGlyLeuGin 130ThrGinLeuHis Tyr 135
PheGlyAspLeuVal 140AspHisTyrArgGin 145Asn匕euGlyAsp 11e 150
匕ysSerArgGinl_eu 155LeuSerAspAlaVal 160Tyr匕euPheSer Cys 165
GlyGlyAsnAspTyr 170GinSerProTyrTyr 175ProTyrThrGin Glu 180
GinTyrValAspI le 185Val1 leGlyAsnMet 190ThrAsnValIle Lys 195
Gly1 leTyrGluLys 200GlyGlyArgLysPhe 205GlyValValAsn Val 210
ProLeu1 leGlyCys 215TrpProGlyMetArg 220AlaLysGinPro Gly 225
AsnAlaCysAsnThr 230GluValAspGluLeu 235ThrArgLeuHis Asn 240
GinAlaPheAlaLys 245ThrLeuGluHisLeu 250GluLysGinLeu Glu 255
21Gly Arg Aia Arg Phe Ala Asn Pro
Phe Met Cys lie Phe Glu Leu Asn
Val Tyr Lys Asn Cys Gly Lys Glu Asp Pro Met Phe Lys Ala Asp Glu
<210> 2 <211> 338 <212> PRT <213>除虫菊 < 2 Ser Gin
1
Asp Ala Gly Tyr Asp Leu Leu Gly Phe Thr Val Val Gin 匕eu
Pro Asn Arg Ala Phe I le His Asp Ser Gin I le Asn Pro His
Gin Gly Phe Phe Ser Thr Ala Tyr I le Cys Glu l_ys Val Gly Asn
Ala Asn Trp Ser 匕eu His Ser Phe 匕ys Gly Gin Gly Pro Asn Gin
Ala 260 Pro 275 Ser 290 Phe 305 Phe 320 Trp 335 Leu 350 匕eu 365
Ala 5
Asn
20
Pro
35
Asp
50
Pro
65
Gly
80
His
95
Gly
110
Ser
125
Gly
140
Tyr
155
I le
170
Leu
185
Ala
200
Ala
匕ys Ser Gly Gly His Asp Phe
Ala Asn Tyr Gly
Phe l_ys Pro Leu Pro Gly Glu
Leu His Gly Arg
le lie
Ala Ala Asp Arg Asn Val Tyr I le Cys Phe
Asn Gly 匕eu Gin Asp Asp Glu Gly Asn Ala
Asp Tyr Phe Cys Asn Asp Gly
Leu Gly Gly Asp Glu Ser 匕ys
Phe Me Gin lie Pro Phe Leu Val Leu Tyr I le l_ys Gys Thr 匕ys
l le Asn Ser I le Ala Ala Ala Asp 匕eu Gin Val Gly Trp Glu Thr
Ser 265 Phe 280 Gly 295 Asn 310 Leu 325 Met 340 Pro 355
Thr 匕ys Asn Ala Ala Val Ser
Phe
10
Thr
25
Tyr
40
Pro
55
Tyr
70
Ser
85
Val
100
His
115
Ser
130
Ser
145
I le
160
Gly
175
Pro
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205
Leu
Ala Glu Tyr Thr Ser Thr Thr
Gly His Phe Asp Leu Ala Gly Tyr Asp Pro Gly Arg Gly Asp Glu
lie Gly Asp Glu Arg Gin 匕ys
Asp Val Ser Phe Glu Gly Leu Arg Ala Tyr Asn l_ys Met Glu His
Ser Asn Ser I le Pro Ala Gin Gin Val Tyr Met Phe Arg l_eu Leu
l_eu Glu Cys Tyr Gin Pro Tyr
Asn 270 Ser 285 Gly 300 Phe 315 Phe 330 Tyr 345 Leu 360
Val Phe Pro Ala Asn Gly Thr Asn Tyr Pro Thr Gly Ala Thr Glu
Phe
15
匕ys
30
Thr
45
Glu
60
Asn
75
Ala
90
Gin
105
Leu
120
Leu
135
Tyr
150
Asn
165
Val
180
Lys
195
Arg
210
匕ysGin lie Gly Asp Glu Arg Gin 匕ys
Leu l_eu Glu Cys Tyr Gin Pro Tyr
Glu Gly Asn Arg Ser Ala Gly Arg Phe Phe Phe Ala Tyr Asn Leu Pro
〈210〉 3 <211> 376 <212> PRT 〈213〉除虫菊 〈400〉 3 Met Ala
1
Val Ala Asn Trp Ser Leu His Ser Phe 匕ys Gly Gin Gly
Leu Ala Asn Pro Asp Pro Gly His Gly Ser Gly Tyr
Val Cys Ala Asn Tyr Gly I le Ala Ala Asp Arg Asn Val Tyr
Ala 匕eu Leu His Gly Arg lie Asn Gly Leu Gin Asp Asp Glu
215 Phe 230 Met 245 Cys 260 I le 275 Phe 290 Glu 305 Leu 320 Asn 335
Ser 5
Ser
20
Phe
35
I le
50
Gin
65
I le
80
Pro
95
Phe
110
Leu
125
Val
140
匕eu
155
Tyr
170
I le
185
匕ys
200
Val Lys Cys Lys Asp Met Lys Asp
Ser Leu I le Asn Ser I le Ala Ala Ala Asp 匕eu Gin Val Gly
Tyr Asn Gly Glu Pro Phe Ala Glu
匕ys Pro Phe Thr Tyr Pro Tyr Ser Val His Ser Ser I le Gly
Ala Pro Ser Phe Phe Trp Leu Leu
l_ys Ser Gly Gly His Asp Phe
Arg Thr Gly His Phe Asp Leu Ala Gly Tyr Asp Pro Gly Arg
220 Phe 235 Lys 250 Pro 265 匕eu 280 Pro 295 Gly 310 Glu 325
Gly Gly Asp Val Ser Phe Glu Gly Leu Arg Ala Tyr Asn l_ys
Asp Tyr Phe Cys Asn Asp Gly
Ala
10
Cys
25
Ser
40
Asn
55
Ser
70
I le
85
Pro
100
Ala
115
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130
Gin
145
Val
160
Tyr
175
Met
190
Phe
205
匕eu Gly Gly Asp Glu Ser Lys
Leu Leu Val Phe Pro Ala Asn Gly Thr Asn Tyr Pro Thr Gly
Ser Phe Gly Asn Leu Met Pro
Val Ser Phe Lys Thr Glu Asn Ala Gin 匕eu Leu Tyr Asn Val
Thr l_ys Asn Ala Ala Val Ser
匕eu Ser Asp Ala Gly Tyr Asp Leu Leu Gly Phe Thr Val Val
225 Ala 240 Glu 255 Tyr 270 Thr 285 Ser 300 Thr 315 Thr 330
Val Gin Pro Asn Arg Ala Phe I le His Asp Ser Gin I le Asn
Ala
15
Gin
30
Gly
45
Phe
60
Phe
75
Ser
90
Thr
105
Ala
120
Tyr
135
lie
150
Cys
165
Glu
180
匕ys
195
Val
210
23pro
Asn
G-n
Gly
Arg
Ala
Arg
Phe
Ala
Asn
Pro
His
Leu
A-a
Ala
Phe
Met
Cys
二e
Phe
Glu
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Asn
I -e G-y
Cys Asn
Phe Ala
Val Tyr
llys Asn
Cys G一y
Lys G-u
Asp Pro-
Mel: Phe
llys Ala
Asp G-u
〈210〉 4
<2二〉 599
〈212〉 PRT
<213〉窓掛激
〈400〉 4
Mel: ser
1
Pro
His
Phe
Gly
Ala
Gl_j
va-
Asp
Arg
Pro
Thr
I.eu
G-匚
Asp
Asp
一 一e
ser
Phe
广eu
Asp-
pro
Arg
Tyr
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Leu Ser
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Phe
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350
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365
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Tyr
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Asp
G-y
Ala
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G-y
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G一u
G-u
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G一n
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Pro
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310
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340
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G-u
370
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Mel:
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Val
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Lys Gin
A-a 二e
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Cys
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G一n
Pro
Tyr
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llys Tyr
Arg Asn
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va一广eu
va-
G一u
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240
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Phe
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15
G一u
30
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45
Asp
60
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90
Gly
105
va-
120
Asp
135
His
150
Mel:155
Asp Pro Met Cys l_eu 170
I le Glu Ala 185
Tyr Ile Ala 200
Gly Asp His 215
Pro Leu Gly 230
Gly Ala Leu 245
Gly Cys Leu 260
Asp Ser Val 275
Val Asn Phe 290
Ser Ser Pro 305
Phe I le Ala 320
Glu Pro Asn 335
Gly Ala Gly 350
Leu Gin Thr 365
Arg Gin Asn 380
Ala Val Tyr 395
Tyr Tyr Pro 410
Asn Met Thr 425
Lys Phe Gly 440
Met Arg Ala 455
Glu Leu Thr 470
160
Ala Phe Pro Lys Leu Val Cys 175
Pro Gin lie Asp Lys Tyr Leu 190
Pro Leu Gin Gly Trp Gin Ala 205
Pro Lys Ser Asp Leu Glu Val 220
Pro Glu Phe Met Ala Val Ala 235
l_eu Val Ala Val Leu Cys l_eu 250
Ser Gin Gin Ala Ala Ala Leu 265
Asp Pro Gly Asn Asn Asn His 280
Ala Asn Phe Trp Pro Tyr Gly 295
Gly Arg Phe Ser Asp Gly Arg 310
Tyr Ala Ser Leu Pro lie lie 325
Asp Phe Thr His Gly Ala Asn 340
Leu lie Ala Ser His Ala Gly 355
Leu His Tyr Phe Gly Asp l_eu 370
Gly Asp lie Lys Ser Arg Gin 385
Phe Ser Cys Gly Gly Asn Asp 400
Thr Gin Glu Gin Tyr Val Asp 415
Val lie Lys Gly lie Tyr Glu 430
Val Asn Val Pro Leu Ile Gly 445
Gin Pro Gly Asn Ala Cys Asn 460
Leu His Asn Gin Ala Phe Ala 475
His Leu Glu Lys Gin Leu Glu Gly Phe Val Tyr 485 490
Ala lie Leu Asn Arg Met Lys Asn Pro Ser 505 510 Lys Tyr Gly Phe Lys Glu Gly Glu Ser Ala Cys Cys Gly Ser Gly 515 520 525
Asp Cys Gly Arg lie Lys Glu Phe Gly 535 540
Lys Ser Gly Gin Lys Pro Phe Thr Tyr Pro Tyr Ser Val His Ser Ser I le Gly Pro Val
Arg Lys Gly Gly Arg Thr Gly His Phe Asp Leu Ala Gly Tyr Asp Pro Gly Arg Gly Asp
Asp I le Trp Pro Ser Val Ser Phe Lys Thr Glu Asn Ala Gin Leu 匕eu Tyr Asn Val Lys Arg
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165 Phe Lys
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330 Phe Ala
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360 Val Asp
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420 Lys Gly
435 Cys Trp
450 Thr Glu
465 Lys Thr
柳 Ala Lys
495
Phe Asp Leu Ser Thr 500
Pro Phe Gly Gly Asn Tyr 530Leu Gys Asp Asn Ala 545
Pro Asn Glu l_eu Ala 560
Gly Asp Ser Met Val 575
Glu Gly Lys Pro Ser 590
〈210〉 5
〈211〉 1479
〈212〉瞧
〈213〉除虫菊
<400> 5
ttaaacgggatgtccaaagwcatttaacttGC3ctagcaagttagagcat50
ttttC3C3CCtcttgatctg3gcac3tataagctatggctgttgC3agca100
gcaawcggggtgctcttgttttggttgctgttttgtgtctttcactacct150
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ggtagattctctgatggccgtatcatccctgatttcattgctgagtatgc350
aagtctgcctatcattcctgcgtatctcgagccaaacaatgattttscgc400
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Thr Glu Tyr Phe Phe Phe 550
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Thr Gin Pro Tyr Asn Leu 580
Thr Lys Tyr Leu Pro Asn 595
Asp Pro Phe His 555
Met Phe Trp Asp 570
l_ys Ala l_eu Phe 585
Asp Glu Leu
<210> 6 <211> 33 〈212〉 PRT 〈213〉除虫菊 <400〉 6
Ser Gin Gin Ala Ala Ala Leu Phe Me Phe Gly Asp Ser Val Phe1
Asp Pro Gly Asn
Ala Asn Phe
〈210〉 7 〈211〉 7 〈212> PRT 〈213〉除虫菊 <400〉 7
Gin Asn Leu Gly
<210> 8 <211〉 9 〈212〉 PRT 〈213〉除虫菊 〈400〉 8
Gin Leu Glu Gly 1
5 10 15
Asn Asn His lie Asn Thr His Val Asn Phe Lys 20 25 30
Asp lie l_ys 5
Phe Val Tyr Ala Lys 5
2权利要求
1.一种除虫菊酯生物合成酶，是通过下述操作而生成的分子量约40000的蛋白质，所述操作是以从除虫菊花制备的粗酶溶液为原料，使用(1R)-反式菊酰辅酶A和(S)-除虫菊醇酮作为检测有无除虫菊酯合成酶活性功能的底物，通过利用硫酸沉淀进行的蛋白质粗分级来得到沉淀物，然后对该沉淀物利用使用疏水性树脂的分批法来进行粗纯化，对上述粗纯化所得的酶溶液，依次进行利用离子交换色谱法进行的纯化、利用疏水作用色谱法进行的纯化、通过凝胶过滤进行的纯化的各工序。
2. 下述(i)或(ii)的蛋白质，是可以从能生成除虫菊酯的植物体内提取的(i) 包含序列号1所示的M酸序列的蛋白质，(ii) 包含对序列号1所示的氨基酸序列置换、缺失、插入和/或添加1 个或多个氛基酸而得到的氨基酸序列、且显示作为除虫菊酯生物合成酶的 活性的蛋白质。
3. —种蛋白质，是可以从能生成除虫菊酯的植物体内提取的酶，是包 含序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质或包含序列号3所示的氨基酸序列 的蛋白质或包含序列号4所示的氨基,列的蛋白质。
4. 一种基因，是编码下述(i)或(ii)的蛋白质的基因，所述蛋白质是可以 从能生成除虫菊酯的植物体内提取的酶，(i) 包含序列号1所示的M,列的蛋白质，(ii) 包含对序列号1所示的M酸序列置换、缺失、插入和/或添加1 个或多个氩基酸而得到的氨基酸序列、且显示作为除虫菊酯生物合成酶的 活性的蛋白质。
5. 根据权利要求4所述的基因，编码(i)的蛋白质，且包含序列号5所 示的碱基序列。
6. 根据权利要求5所述的基因，含有序列号5所示的碱基序列的第85 位~第1179位的M序列作为开放式阅读框。
7. —种基因，编码包含序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质或包含序 列号3所示的M酸序列的蛋白质或包含序列号4所示的M酸序列的蛋 白质的任一种，所述蛋白质是可以从能生成除虫菊酯的植物体内提取的酶。
8. —种栽体，整合有权利要求4~7的任一项所述的基因。
全文摘要
本发明的课题是提供通过确定与除虫菊酯的生物合成相关的酶的氨基酸序列、及其基因的碱基序列，制作整合有该基因的载体、转化体，并将这些制作技术应用于生长较快的植物，从而高效地生成除虫菊酯的方法。本发明提供一种基因，是编码作为可以从能生成除虫菊酯的植物体内提取的酶的下述(i)或(ii)的蛋白质的基因，(i)包含序列号1所示的氨基酸序列的蛋白质，(ii)包含对序列号1所示的氨基酸序列置换、缺失、插入、和/或添加1个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列、且显示作为除虫菊酯生物合成酶的活性的蛋白质。
文档编号C12N9/20GK101649308SQ20091016539
公开日2010年2月17日 申请日期2009年8月11日 优先权日2008年8月13日
发明者松田一彦, 菊田幸雄 申请人:学校法人近畿大学;大日本除虫菊株式会社