专利名称：：一种快速筛选降胆固醇乳酸菌的方法
技术领域：
：本发明涉及一种微生物的快速筛选方法，尤其涉及一种降胆固醇乳酸菌的快速筛选方法。
背景技术：
：根据世界卫生组织公布的1996年度卫生统计年鉴，全球因心血管疾病死亡1530万人，占总死亡人数的29%，心血管疾病因此而高居世界五大死因之首，而它们共同的病理基础都是动脉硬化。动脉粥样硬化由许多因素促成，其中最重要的危险因素是高脂血症即血胆固醇和血甘油三脂的升高。因而，保持血液中胆固醇浓度在正常范围内，对于预防动脉粥样硬化和心脑血管疾病是至关重要的。美国、我国国内的营养和医学专家推荐食物胆固醇的摄入量标准为250-300mg/d/人。但随着人民生活水平的不断提高和膳食营养的增加，胆固醇的摄入量很容易超标。据上海市心血管病研究所在1997-1999年间对3467名上海居民的调查，由于每日的营养摄取量比20世纪70年代有明显增加，脂肪由24.1%增至31.8%，胆固醇由282mg上升至388mg，而碳水化合物则由65.7%降至53.7%，上海人的血脂则明显增高。因此研究不影响食品风味，经济实用的降低食品和人体血清胆固醇的方法，己成为当前改善食品质量、提高人们生活水平重要的研究课题。国外对降胆固醇乳酸菌的研究起步较早。1977年，Gilliland对肠道乳杆菌降胆固醇作用进行了研究，提出乳杆菌在生长过程中通过降解胆盐促进胆固醇的分解代谢，从而降低胆固醇含量的观点。随后Rasic等也证实了嗜酸乳杆菌和两双歧杆菌对胆固醇的脱除作用。迄今为止人体及动物实验也证明了乳酸菌的降胆固醇作用。一些天然的微生物种群包括许多乳酸菌和双岐杆菌，被发现有解离结合胆盐能力，它可以把结合态的胆盐催化水解为氨基酸残基和游离胆盐，在此过程中，关键酶就是胆盐水解酶，该酶的功能性基因为BSH。胆盐水解酶是乳酸菌降胆固醇的关键酶，因此，利用BSH基因进行降胆固醇乳酸菌的筛选，几小时可确定乳酸菌胆盐水解酶的阴阳性。以往的降胆固醇乳酸菌筛选采用传统的筛选技术，筛选工作周期长、工作量大，选育高性能乳酸菌菌株尤如大海里捞针。
发明内容本发明的目的在于提供一种快速筛选降胆固醇乳酸菌的方法。具体内容如下(1)菌株PCR扩增取经初步分离纯化的乳酸菌，挑取单个菌落到0.2mLPCR管中，加入10uL无菌1XTE缓冲液混匀，100。C煮沸5min，一20。C冷冻5min，循环23次，5000r/min离心lmin，吸取8uL上清液作为PCR扩增的DNA模板；然后按照下列反应条件进行PCR扩增PCR体系成分表如下—一____________——_——_______________—<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>PCR体系成分表中所述的一对上下游引物1、2，是根据GeneBank现己收录的乳酸菌BSH基因全序列，用vectorNTI软件设计上下游一对引物BSHPf和BSHPr，其中引物1BSHPf:5,-GGTTACGATTACGCCTAGAAAATATCC-3，引物2BSHPr5，—TTAATTCAGTCGTATCCAAGTGCTCATG-3，(2)电泳实验分析具有胆盐水解酶(BSH)基因的乳酸菌可扩增出大小为950bp的一条特异条带，根据电泳图谱分析，即可确定待检乳酸菌是否有胆盐水解酶(BSH)。上述的初步分离纯化的乳酸菌可以通过K述方法得到，但不局限于下述的方法，而应当涵盖了现有技术中的任何一种能够获得纯化的乳酸菌的方法1、乳酸菌的富集培养选择适量的酸奶、干酪等富含乳酸菌的食品为富集样品，加入到脱脂牛乳培养基或MRS液体培养基中进行富集培养，37。C培养48h后，用作分离样品。所述的脱脂牛乳培养基10克脱脂乳粉加入到100ml蒸馏水中，112'C灭菌20min。所述的MRS液体培养基蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5.0g，葡萄糖20.0g，K2HPO42.0g，NaOAC5.0g，MgSO40.2g，吐温80L0g，柠檬酸三铵2.0g，蒸馏水1000mL。2、降胆固醇乳酸菌的初步分离和纯化将上述富集培养液加入改良KENJI选择性液体培养基，以胆固醇为唯一营养源，37。C振荡培养，需经三次转管培养，涂布在改良MRS平板上，37。C恒温培养48-72h。挑取可产酸的典型菌落，涂片、革兰氏染色、镜检。凡是革兰氏阳性的菌株，进行反复的划线分离、纯化，至纯菌落为止，初步确定为降胆固醇乳酸菌。所述的改良KENJI选择性培养基取l号溶液1000niL，胆固醇1.0g，超声波细胞粉碎机600W振荡乳化20min，加入lmLL—1的4%溴百里香草酚兰作指示剂，i周pH至6.0，12rC灭菌20min。所述的1号溶液配方酵母酶解粉0.2g，NH4N03l.Og，KH2P040.25g，MgS047H200.25g，FeS047H205mg，NaCl5mg，蒸馏水1000mL。所述的改良MRS固体培养基在普通的MRS液体培养基中加入3%的胆盐(牛磺胆酸钠)，1%的水溶性胆固醇，2。/。的CaCl2，最后加入2%的琼脂。本发明的有益效果在于研究发现一些天然的微生物种群，包括乳酸菌和双岐杆菌，有解离结合胆盐能力，它可以把结合态的胆盐催化水解为氨基酸残基和游离胆盐(即胆固醇的降解)，在此过程中，关键酶就是胆盐水解酶，以及调控该酶的功能性基因BSH。本发明研究根据GeneBank中乳酸菌BSH基因的全序列编码，设计降胆固醇乳酸菌的特异性引物。直接以菌体热、冻解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增，省略了菌株DNA的提取，通过菌株PCR技术快速确认BSH基因的阴阳性，进一歩确定具有胆固醇降解能力的菌株，12小时即可确定乳酸菌胆盐水解酶的阴阳性。具备工作周期短、工作量小的突出优点。具体实施例方式实施例1以益生菌酸乳、干酪等发酵乳制品为分离原料(1)乳酸菌的富集培养称取10-20克酸奶、干酪等富含乳酸菌的食品为富集样品，加入到100-200ml脱脂牛乳或MRS液体培养基中进行富集培养，37"C培养48h后，用作分离样品。脱脂牛乳培养基10克脱脂乳粉加入到100ml蒸馏水中，112'C灭菌20niin。MRS液体培养基蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5.0g，葡萄糖20.0g，K2HPO42.0g，NaOAC5.0g，MgSO40.2g，吐温801.0g，柠檬酸三铵2.0g，蒸馏水1000mL。(2)降胆固醇乳酸菌的初歩分离和纯化无菌操作取0.5或lml上述富集培养液，加在含4.5或9ml无菌的改良KEN.丁I选择性培养基(含0.04%溴百里香草酚兰)的试管中，摇匀，37。C振荡培养l-2天，然后取培养液100PL加到同样的培养基里培养，为避免原培养基中的碳源干扰，共需三次转管培养。根据培养基的比混浊度和指示剂颜色的变化，取第三次培养后的菌液200A加入到pH2的MRS液体培养基，培养6h;取其lOOl^L培养液转接到含0.30%猪胆盐MRS液体培养基中，培养24h;然后取200叱培养液，涂布在改良MRS平板上，37。C恒温培养48-72h。挑取可产酸的典型菌落，制成涂片、革兰氏染色、镜检。凡是革兰氏阳性的菌株，继续进行反复的划线分离、纯化，至纯菌落为止。将所获菌落菌株编号、接种到含0.75%CaC03的MRS斜面培养基培养后，置4'C冰箱中保存备用。改良KENJI选择性培养基取l号溶液1000mL，胆固醇1.0g，超声波细胞粉碎机600W振荡乳化20min，加入lmLL—1的4%溴百里香草酚兰作指示剂，调pH至6.0，12rC灭菌20min。l号溶液配方:酵母酶解粉0.2g，腳03l.Og，K訓40.25g，MgSOWtW)PCR体系成分表如下:TaKaRaPCR10'BufferdNTPMixture(lOmM)引物1(50pm)引物2(50pm)模板DNATaKaRaTaq(5U/u1)超纯水)电泳实验分析5u14u10.5y10.5n12n10.25y138u10.25g，FeS047H205mg，NaCl5mg，蒸馏水lOOOmL。改良MRS固体培养基在普通的MRS液体培养基屮加入3M的胆盐(牛磺胆酸钠)，1%的水溶性胆固醇，2M的CaCl2，最后加入2%的琼脂。(3)胆盐水解酶(BSH)基因的菌落PCR快速筛选①BSH基因特异引物设计根据GeneBank现已收录的乳酸菌BSH基因全序列，用vectorNTI软件设计上下游一对引物BSHPf和BSHPr，BSHPf:5'-GGTTACGATTACGCCTAGAAAATATCC-3'BSHPr5'-TTAATTCAGTCGTATCCAAGTGCTCATG-3'②菌株PCR扩增挑选己分离纯化的乳酸菌，用无菌牙签挑取单个菌落到0.2mLPCR管中，加入10uL无菌1XTE缓冲液混匀，IO(TC煮沸5min，一20。C冷冻5min(循环2次)，5000r/min离心lmin，吸取8uL上清液作为PCR扩增的DNA模板。根据引物序列的GC比等因素确定退火温度，经过优化后的反应条件如下第一次变性反应35个循环反应末循环94C5min94。Clmin58。Clmin72。Clmin72。C2min性火合变退聚BSH基因在乳酸菌中普遍存在，其编码的胆盐水解酶(BSH)可以水解结合型胆汁盐产生游离型胆汁盐，BSH酶对乳杆菌降胆固醇作用有很大影响，因此，可以利用BSH基因进行降胆固醇乳酸菌的筛选。该酶基因测序结果均为950bp左右，因此利用菌株PCR方法扩增，具有该酶的乳酸菌可扩增出大小为950bp的-条特异条带。根据电泳图谱分析，可确定待检乳酸菌是否有胆盐水解酶(BSH)。利用上述方法，通过菌株PCR技术快速确认BSH基因的阴阳性，进一歩确定具有胆固醇降解能力的菌株，12小时即可确定乳酸菌胆盐水解酶的阴阳性。其中自天然发酵乳制品分离出的干酪乳杆菌GL-03，体外培养试验表明其有很强的耐酸、耐胆盐能力，粘附性好，对常见的肠道致病菌有明显的抑制作用，不携带耐药性因子，是一种适宜于人体肠道定植的乳酸菌，同时体外胆固醇降解率可达56%，体内降胆固醇的动物实验也表明该酸乳可明显降低小鼠血清胆固醇。实施例2实施例2以泡菜、辣白菜等发酵蔬菜为分离原料a)乳酸菌的富集培养量取10-20ml的泡菜汁、辣白菜汁等发酵蔬菜汁，经无菌蒸馏水稀释处理后，无菌操作吸取2ml加入到20ml灭菌的MRS液体培养基中进行富集培养，37。C静置培养48h，用作分离样品。(2)降胆固醇乳酸菌的初歩分离和纯化具体歩骤同例1(3)胆盐水解酶(BSH)基因的菌落PCR快速筛选①BSH基因特异引物设计具体步骤同例1②菌株PCR扩增挑选已分离纯化的乳酸菌，用无菌牙签挑取单个菌落到0.2mLPCR管中，加入10ixL无菌1XTE缓冲液混匀，IO(TC煮沸3min，一2(TC冷冻3min(循环3次)，5000r/min离心lmin，吸取8yL上清液作为PCR扩增的DNA模板。根据引物序列的GC比等因素确定退火温度，经过优化后的反应条件如下第一次变性反应94°C5min35个循环反应末循环72°ClminPCR体系成分表如例1。③电泳实验分析BSH基因在乳酸菌中普遍存在，其编码的胆盐水解酶(BSH)可以水解结合型胆汁盐产生游离型胆汁盐，BSH酶对乳杆菌降胆同醇作用有很大影响，因此，可以利用BSH基因进行降胆固醇乳酸菌的筛选。该酶基因测序结果均为950bp左右，因此利用菌株PCR方法扩增，具有该酶的乳酸菌可扩增出大小为950bp的一条特异条带。根据电泳图谱分析，可确定待检乳酸菌是否有胆盐水解酶(BSH)。利用上述方法，通过菌株PCR技术快速确认BSH基因的阴阳性，进一歩确定具有胆固醇降解能力的菌株，12小时即可确定乳酸菌胆盐水解酶的阴阳性。自泡菜汁中分离出的乳酸菌，体外培养试验表明其有很强的耐酸、耐胆盐能力，粘附性好，对常见的肠道致病菌有明显的抑制作用，不携带耐药性因子，是一种适宜于人体肠道定植的乳酸菌，同时体外胆固醇降解率可达50%，体内降胆固醇的动物实验也表明该酸乳可明显降低小鼠血清胆固醇。1iimmm462957性火合变退聚SEQUENCELISTING<110>大连工业大学<120〉一种快速筛选降胆固醇乳酸菌的方法<130>N/A<160>2<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>27<212〉DNA<213>人工序列<400>1ggttacgattacgcctagaaaatatcc27<210>2<211>28<212〉DNA<213>人工序列<400>2ttaattcagtcgtatccaagtgctcatg28权利要求1、一种快速筛选降胆固醇乳酸菌的方法，包括如下步骤(1)菌株PCR扩增取经初步分离纯化的乳酸菌，挑取单个菌落到0.2mLPCR管中，加入10μL无菌1×TE缓冲液混匀，100℃煮沸5min，-20℃冷冻5min，循环2～3次，5000r/min离心1min，吸取8μL上清液作为PCR扩增的DNA模板；然后按照下列反应条件进行PCR扩增第一次变性反应94℃5min35个循环反应变性94℃1min退火56～58℃1min聚合72℃1～2min末循环72℃1～2minPCR体系成分表如下<tablesid="tabl0001"num="0001"wi="156"></tables>PCR体系成分表中所述的一对上下游引物1、2为引物1BSHPf5’-GGTTACGATTACGCCTAGAAAATATCC-3’引物2BSHPr5’-TTAATTCAGTCGTATCCAAGTGCTCATG-3’(2)电泳实验分析具有胆盐水解酶(BSH)基因的乳酸菌可扩增出大小为950bp的一条特异条带，根据电泳图谱分析，即可确定待检乳酸菌是否有胆盐水解酶(BSH)。全文摘要一种快速筛选降胆固醇乳酸菌的方法，取经初步分离纯化的乳酸菌，挑取单个菌落到0.2mLPCR管中，加10μL无菌1×TE缓冲液混匀，100℃煮沸5min，-20℃冷冻5min，循环2～3次，5000r/min离心1min，吸取8μL上清液作PCR扩增的DNA模板；进行PCR扩增，电泳实验分析确认BSH基因的阴阳性。进一步确定具有胆固醇降解能力的菌株，12小时即可确定乳酸菌胆盐水解酶的阴阳性。本发明具有工作周期短、工作量小的突出优点。文档编号C12R1/225GK101671737SQ20091018779公开日2010年3月17日申请日期2009年9月30日优先权日2009年9月30日发明者侯红漫,张公亮,郭东启申请人:大连工业大学